Name: 使用设计的混合工艺实验和自验证集成模型 （SVEM） 优化脂质纳米颗粒 （LNP） 配方的工作流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:35:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: 了解使用SVEM模型优化脂质纳米颗粒配方的计算方法。该工作流程通过实验设计表构建和结果分析，最小化统计决策错误，生成信息丰富的可视化图形，帮助配方科学家快速识别最优因子设置。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢编辑和匿名审稿人提出的宝贵建议，这些建议&#160;改进了&#160;本文。

<ol><li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+lipids+to+power+next+generation+of+mRNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Better lipids to power next generation of mRNA vaccines.</a> Science. 376 (6594), 680-681 (2022).</li>
<li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+mRNA+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The landscape of mRNA nanomedicine.</a> Nature Medicine. 28, 2273-2287 (2022).</li>
<li>Rampado, R., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+experiments+in+the+optimization+of+nanoparticle-based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Design of experiments in the optimization of nanoparticle-based drug delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 358, 398-419 (2023).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15, 7300-7306 (2015).</li>
<li>Jones, B., Nachtsheim, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+three-level+designs+for+definitive+screening+in+the+presence+of+second-order+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Quality+Technology%22%5BJournal%5D)">A class of three-level designs for definitive screening in the presence of second-order effects.</a> Journal of Quality Technology. 43, 1-15 (2011).</li>
<li>Cornell, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCornell%2C+J+%22Experiments+with+Mixtures%3A+Designs%2C+Models%2C+and+the+Analysis+of+Mixture+Data.+Wiley+Series+in+Probability+and+Statistics%22">Experiments with Mixtures: Designs, Models, and the Analysis of Mixture Data. Wiley Series in Probability and Statistics</a>. , Wiley. (2002).</li>
<li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+and+improper+use+of+definitive+screening+designs+%28DSDs%29%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+user+Community%22%5BJournal%5D)">Proper and improper use of definitive screening designs (DSDs).</a> JMP user Community. , https://community.jmp.com/t5/JMP-Blog/Proper-and-improper-use-of-Definitive-Screening-Designs-DSDs/bc-p/546773 (2016).</li>
<li>Myers, R., Montgomery, D., Anderson-Cook, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMyers%2C+R+%22Response+Surface+Methodology%22">Response Surface Methodology</a>. , Wiley. (2016).</li>
<li>Lekivetz, R., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+flexible+space-filling+designs+for+nonrectangular+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Quality+and+Reliability+Engineering+International%22%5BJournal%5D)">Fast flexible space-filling designs for nonrectangular regions.</a> Quality and Reliability Engineering International. 31, 829-837 (2015).</li>
<li>Czitrom, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-factor-at-a-time+versus+designed+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Statistician%22%5BJournal%5D)">One-factor-at-a-time versus designed experiments.</a> The American Statistician. 53, 126-131 (1999).</li>
<li>Karl, A., Wisnowski, J., Rushing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JMP+Pro+17+remedies+for+practical+struggles+with+mixture+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+Discovery+Conference%22%5BJournal%5D)">JMP Pro 17 remedies for practical struggles with mixture experiments.</a> JMP Discovery Conference. , (2022).</li>
<li>Lemkus, T., Gotwalt, C., Ramsey, P., Weese, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-validated+ensemble+models+for+design+of+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Self-validated ensemble models for design of experiments.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 219, 104439(2021).</li>
<li>Gotwalt, C., Ramsey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+validation+strategies+for+designed+experiments+using+bootstrapping+techniques+with+applications+to+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+Discovery+Conference%22%5BJournal%5D)">Model validation strategies for designed experiments using bootstrapping techniques with applications to biopharmaceuticals.</a> JMP Discovery Conference. , (2018).</li>
<li>Xu, L., Gotwalt, C., Hong, Y., King, C. B., Meeker, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+fractional-random-weight+bootstrap%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Statistician%22%5BJournal%5D)">Applications of the fractional-random-weight bootstrap.</a> The American Statistician. 74 (4), 345-358 (2020).</li>
<li>Ramsey, P., Levin, W., Lemkus, T., Gotwalt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SVEM%3A+A+paradigm+shift+in+design+and+analysis+of+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+Discovery+Conference+Europe%22%5BJournal%5D)">SVEM: A paradigm shift in design and analysis of experiments.</a> JMP Discovery Conference Europe. , (2021).</li>
<li>Ramsey, P., Gaudard, M., Levin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+innovation+with+space+filling+mixture+designs%2C+neural+networks+and+SVEM%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+Discovery+Conference%22%5BJournal%5D)">Accelerating innovation with space filling mixture designs, neural networks and SVEM.</a> JMP Discovery Conference. , (2021).</li>
<li>Lemkus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Validated+Ensemble+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Doctoral+Dissertations.+2707%22%5BJournal%5D)">Self-Validated Ensemble modelling.</a> Doctoral Dissertations. 2707. , https://scholars.unh.edu/dissertation/2707 (2022).</li>
<li>Juran, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJuran%2C+JM+%22Juran+on+Quality+by+Design%3A+The+New+Steps+for+Planning+Quality+into+Goods+and+Services%22">Juran on Quality by Design: The New Steps for Planning Quality into Goods and Services</a>. , Free Press. (1992).</li>
<li>Yu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+pharmaceutical+quality+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Understanding pharmaceutical quality by design.</a> The AAPS Journal. 16, 771(2014).</li>
<li>Simpson, J. R., Listak, C. M., Hutto, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+planning+and+evidence+for+assessing+a+well-designed+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Quality+Engineering%22%5BJournal%5D)">Guidelines for planning and evidence for assessing a well-designed experiment.</a> Quality Engineering. 25, 333-355 (2013).</li>
<li>Daniel, S., Kis, Z., Kontoravdi, C., Shah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+by+design+for+enabling+RNA+platform+production+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quality by design for enabling RNA platform production processes.</a> Trends in Biotechnology. 40 (10), 1213-1228 (2022).</li>
<li>Scheffé, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+with+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society+Series+B%22%5BJournal%5D)">Experiments with mixtures.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B. 20, 344-360 (1958).</li>
<li>Brown, L., Donev, A. N., Bissett, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+blending+models+for+data+from+mixture+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Technometrics%22%5BJournal%5D)">General blending models for data from mixture experiments.</a> Technometrics. 57, 449-456 (2015).</li>
<li>Herrera, M., Kim, J., Eygeris, Y., Jozic, A., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+endosomal+escape+of+polymorphic+lipid+nanoparticles+that+boost+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Illuminating endosomal escape of polymorphic lipid nanoparticles that boost mRNA delivery.</a> Biomaterials Science. 9 (12), 4289-4300 (2021).</li>
<li>Lemkus, T., Ramsey, P., Gotwalt, C., Weese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-validated+ensemble+models+for+design+of+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ArXiv%22%5BJournal%5D)">Self-validated ensemble models for design of experiments.</a> ArXiv. , 2103.09303(2021).</li>
<li>Goos, P., Jones, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoos%2C+P+%22Optimal+Design+of+Experiments%3A+A+Case+Study+Approach%22">Optimal Design of Experiments: A Case Study Approach</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2011).</li>
<li>Rushing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOE+Gumbo%3A+How+hybrid+and+augmenting+designs+can+lead+to+more+effective+design+choices%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+Discovery+Conference%22%5BJournal%5D)">DOE Gumbo: How hybrid and augmenting designs can lead to more effective design choices.</a> JMP Discovery Conference. , (2020).</li>
</ol>

本工作流程所依据的实验设计策略已应用于两项专利申请，其中一位作者为发明人之一。此外，Adsurgo有限责任公司是认证的JMP合作伙伴。然而，本文的开发与发表均未接受JMP提供的任何形式的经济激励、鼓励或其他诱导。

用于设计和分析混合-过程实验的现代软件使科学家能够通过结构化的流程优化其脂质纳米颗粒配方，避免了效率低下的单因素试验（OFAT）方法。近期开发的SVEM建模方法消除了许多以往可能使科学家分心于额外统计考量的复杂回归修正和模型简化策略。一旦收集到实验结果，SVEM分析框架提供了一种更易于实施且通常比传统建模方法产生更优模型的分析途径13。此外，基于各响应变量预测公式的图形化分析对科学家而言易于解读，能够清晰地总结响应变量在单个因素以及少量因素组合下的边际行为，而无需解释回归模型中高度相关的参数估计值。这使得科学家能够在SVEM自动剔除统计上不显著效应后，专注于评估各研究因素的实际重要性。
该工作流程已在实践中用于系统性地调整脂质组成以及N/P比、流速和混合比例等制剂参数，以实现优化，并筛选出最佳的辅助脂质类型、可电离脂质类型和缓冲液类型。这些实例的共同目标通常包括最大化 体内 或 体外 效力及包载不同载荷（如mRNA或DNA）以用于相关应用 体内 靶细胞，例如肝细胞，或在某些情况下可...

用于体内基因递送系统的脂质纳米颗粒（LNP）制剂通常包含四种类别的组分脂质，即离子化脂质、辅助脂质和聚乙二醇（PEG）脂质1,2,3。无论这些脂质是单独研究，还是与其他非混合因素同时研究，这些制剂的实验均需采用“混合物”设计，因为对于任一候选制剂而言，增加或减少其中任一种脂质的比例，必然导致其余三种脂质比例总和相应减少或增加。
为说明起见，假设我们正在优化一种脂质纳米颗粒（LNP）配方，该配方目前采用一个固定的配方组合，将作为基准进行比较。目标是最大化LNP的效力，其次力求最小化颗粒的平均粒径。实验中变化的研究因素包括四种组分脂质（可电离脂质、胆固醇、DOPE、PEG）的摩尔比例、N:P比、流速以及可电离脂质的类型。其中，可电离脂质和辅助脂质（包括胆固醇）的摩尔比例变化范围较宽，为10–60%，而PEG的比例在此示例中变化范围为1–5%。基准配方的具体组成以及其他因素的变化范围及其数值舍入精度详见补充文件1。本例中，科研人员能够在一天内完成23次实验运行（即23批独立的颗粒制备），并希望以此作为样本量，前提是满足最低要求。本实验的模拟结果见补充文件2和补充文件3。
Rampado 和 Peer4近期发表了一篇关于为优化纳米颗粒药物递送系统而设计实验的综述论文。Kauffman 等人5探讨了使用部分因子设计和确定性筛选设计6进行脂质纳米颗粒（LNP）优化的研究；然而，这类设计在处理混合约束时，若不采用效率较低的“松弛变量”（slack variables）7则无法实现，因此在存在混合因素时通常不被采用7,8。相反，能够纳入混合约束的“最优设计”（optimal designs）传统上被用于混合-过程实验9。这类设计针对研究因素的用户指定函数进行优化，仅当该函数准确反映研究因素与响应变量之间的真实关系时，才在某种意义下达到最优。需注意，文中“最优设计”与“最优配方候选物”（optimal formulation candidates）有所区别，后者指通过统计模型识别出的最佳配方。对于混合-过程实验，最优设计存在三个主要缺点。第一，若研究人员在设定目标模型时未能预见到研究因素之间的交互作用，则所得模型将存在偏差，可能导致筛选出的候选配方性能不佳。第二，最优设计通常将大部分实验点布置在因素空间的外边界上。在 LNP 研究中，若脂质或工艺参数处于极端水平时颗粒无法正确形成，则可能导致大量实验失败。第三，研究人员通常更倾向于在因素空间内部设置实验点，以便在不依赖模型的情况下直观了解响应曲面，并在因素空间此前未探索的区域直接观察实验过程。
另一种设计原则是采用空间填充设计，以在（混合物约束的）因子空间中实现近似均匀的覆盖10这些设计相对于最优设计牺牲了一定的实验效率9 （假设整个因子空间均可产生有效的配方）但在权衡中具备多项优势，适用于本应用场景。空间填充设计并不做任何 先验的 关于响应曲面结构的假设；这使其具有足够的灵活性，以捕捉研究因素之间未预期到的关系。这也简化了实验设计的生成过程，因为在调整所需试验次数时，无需对回归项的增减做出决策。当某些设计点（配方）导致配方失败时，空间填充设计能够对研究因素空间内失败边界的建模成为可能，同时还能在成功因素组合范围内支持对研究响应的统计建模。最后，因子空间内部的良好覆盖性允许在不依赖特定模型的前提下，对响应曲面进行图示化探索。
为了可视化混料-过程实验中的混料因子子空间，需使用特殊的三角形“三元相图”。图1说明了这种用法：在一个三维立方体中，三个组分各自可在0到1之间变化，其中满足各组分之和等于1这一约束条件的点以红色标出。该三组分混料约束将可行的因子空间缩减为一个三角形。在含有四种混料组分的脂质纳米颗粒（LNP）应用中，我们通过每次将两种脂质与一个代表其余脂质总和的“其他”轴进行组合，绘制六种不同的三元相图以表示整个因子空间。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65200/65200fig01.jpg" /> 
图1：三角形因子区域。 在立方体内填充空间的图中，小的灰色点表示不符合混合约束的配方。较大的红色点位于立方体内接的一个三角形上，代表满足混合约束的配方。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65200/65200fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
除了脂质混合物因素外，通常还存在一个或多个连续的工艺因素，例如 N:P 比值、缓冲液浓度或流速。也可能存在分类因素，例如可电离脂质类型、辅助脂质类型或缓冲液类型。目标是找到一种制剂（即脂质混合物及工艺参数的组合），以最大化某种效力指标和/或改善理化特性，例如减小粒径和多分散系数（PDI）、提高包封率，并减少副作用——如体重下降——在 体内 研究。即使从一个合理的基准配方开始，当遗传载荷发生变化，或考虑工艺参数或脂质类型改变时，也可能需要重新优化。
康奈尔大学7 为混合与混合-过程实验的统计学方面提供了权威论述，作者为 Myers 等。9 为优化提供了最相关混合设计与分析主题的出色总结。然而，这些著作可能使科研人员面临过多的统计学细节和专业术语。现代用于实验设计与分析的软件提供了一种稳健的解决方案，足以支持大多数脂质纳米颗粒（LNP）优化问题，而无需依赖相关理论。尽管更复杂或高优先级的研究仍可从与统计学家合作中受益，并可能采用最优设计而非空间填充设计，但我们的目标是提高科研人员的操作信心，鼓励在不依赖低效的每次改变一个因素（OFAT）测试的情况下对LNP配方进行优化11 或仅仅满足于首个符合规格的配方。
本文介绍了一种利用统计软件优化通用脂质纳米颗粒（LNP）配方问题的工作流程，按实际遇到的顺序解决设计与分析中的各项问题。事实上，该方法适用于一般的优化问题，并不仅限于LNP。在此过程中，本文还解答了若干常见问题，并基于实践经验与模拟结果提供了相应建议12。近期开发的自验证集成模型（self-validated ensemble models, SVEM）框架13显著改进了以往在分析混合-过程实验结果时较为脆弱的方法，本文采用该框架提出了一种简化的配方优化策略。尽管该工作流程以通用方式构建，可使用其他软件包实现，但JMP 17 Pro在提供SVEM以及我们发现对简化混合-过程实验复杂分析所必需的图形汇总工具方面具有独特优势。因此，实验方案中也提供了针对JMP的具体操作说明。
SVEM 采用与传统方法相同的线性回归模型基础，但使我们能够避免为拟合模型而需进行的繁琐修改 &#34;完整模型&#34; 通过使用前向选择或惩罚性选择（Lasso）基础方法来筛选候选效应。此外，SVEM 提供了改进的 &#34;简化模型&#34; 通过反复重新加权模型中每次运行的相对重要性，并对由此产生的预测模型进行平均，从而拟合出能够最小化数据中噪声（过程变异和分析变异）引入风险的结果。13,14,15,16,17,18SVEM 为混合-过程实验的建模提供了一个框架，该框架不仅比传统的单次回归方法更易于实施，而且能够生成更优的配方优化候选方案12,13SVEM 的数学细节超出了本文的范围，即使对其进行简要概述，也会偏离该方法在此应用中的主要优势：它为实践者提供了一种简单、稳健且准确的“一键运行”操作流程。
所展示的工作流程符合药物开发中的质量源于设计（Quality by Design, QbD）19 方法20。本研究的结果将有助于理解将物料属性和工艺参数与关键质量属性（critical quality attributes, CQAs）21 关联起来的功能关系。Daniel 等人22 讨论了在RNA平台生产中专门应用QbD框架的问题：我们的工作流程可作为该框架内的一个工具使用。

<table><tbody><tr><td>JMP Pro 17.1</td><td>JMP Statistical Discovery LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用设计的混合-过程实验与自验证集成模型（svem）优化脂质纳米颗粒（lnp）制剂的流程

A Workflow for Lipid Nanoparticle (LNP) Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models (SVEM)

我们提出一种基于质量源于设计（Quality by Design, QbD）理念的方法，用于优化脂质纳米颗粒（LNP）配方，旨在为科研人员提供一个易于实施的工作流程。在这些研究中存在一个内在限制：可电离脂质、辅助脂质和聚乙二醇（PEG）化脂质的摩尔比总和必须为100%，这一混合物约束条件要求采用专门的实验设计与分析方法。本文聚焦于LNP设计优化中常用的脂质组分与工艺参数，通过采用空间填充设计（space-filling designs）并结合近期发展的自验证集成模型（self-validated ensemble models, SVEM）统计框架，提供了一套可避免传统混合-工艺实验在设计与分析中常见困难的操作步骤。该工作流程不仅能生成候选的最优配方，还能构建拟合统计模型的图形化汇总结果，从而简化对实验结果的解读。新识别出的候选配方可通过验证实验进行评估，也可选择性地纳入更全面的第二阶段研究中进一步验证。

该方法已在广泛分类的两大类脂质中得到验证：MC3类经典脂质和类脂质（如C12-200），后者通常源自组合化学合成。与采用一次单因素法（OFAT）开发的基准脂质纳米颗粒（LNP）配方相比，通过本工作流程生成的候选配方在小鼠肝脏荧光素酶读数中常表现出效价提升4至5倍（对数尺度）。 图 18. 表1 展示了在两个优化阶段（初步研究和后续跟进研究）中，与基准对照性能相比，小鼠肝脏荧光素酶表达所观察到的相应提升。在第一阶段，重点是优化脂质比例，同时保持其他因素不变。在后续研究中，引入了一种额外的辅助脂质类型，并综合考虑脂质比例组成和辅助脂质类型进行优化。因此，选定新引入的辅助脂质类型与相应的优化脂质组成联合使用。显著增强的效力表明，这些优化后的组分可能具有更优的内体逃逸能力25.
可以通过模拟来展示该流程所产生的最优候选配方的预期质量。在本方案所用示例实验的框架内，我们可以针对不同的试验次数重复多次模拟，并根据模拟的过程生成函数来评估结果。为此，<st...

本方案提供了一种针对混合物、连续型和分类研究因素的配方优化方法，可最大限度地减少实验设计构建中的主观选择。在分析阶段，采用了一种高效且易于使用的建模拟合流程。

利用设计的混合-过程实验与自验证集成模型（SVEM）优化脂质纳米颗粒（LNP）制剂的流程

我们提出一种基于质量源于设计（Quality by Design, QbD）理念的脂质纳米颗粒（LNP）配方优化方法，旨在为科研人员提供一种可及的……

本文为科研人员提供了一种构建实验设计表并分析多种混合与工艺因素下实验结果的工作流程，无需进行繁琐且可能不稳定的统计学决策。所得到的模型可对多个响应变量进行联合优化，并用于生成信息丰富的图形，以综合展示联合响应面以及各个响应变量的预测结果。这些图形比基础统计模型中的参数估计更易于解读，有助于呈现能够产生最优响应的因子设置条件。脂质与纳米颗粒制剂科学家经常需要针对不同的载药物质，或在更换脂质成分或工艺参数时，构建新的制剂配方。我们提供一种稳健的配方优化方法，可最大限度减少实验设计构建过程中的出错风险，并避免在数据分析过程中对复杂统计学知识的依赖。请在带有日期戳记的文件中总结本实验的目的。列出实验过程中将要测量的响应指标。选择研究中将要改变的因素以及将保持不变的因素。确定可变因素的取值范围以及每个因素相应的有效数字精度。使用最小值和最大值启发法确定研究设计的规模。打开 JMP，导航至菜单栏中的 DOI、特殊用途、空间填充设计。输入研究的响应变量。输入研究因素及其取值范围。输入设计预设的实验运行次数。生成所选因素和运行规模的空间填充设计表。在表格中添加一个注释列，用于标注任何手动创建的运行。如果适用，将基准对照运行手动纳入设计表格中。对其中一个受控的基准包含一个重复。在备注列中标记基准名称，并对基准重复行进行颜色编码，以便于准确识别。将因子水平的混合值四舍五入至适当的粒度。复制四舍五入后的数值，并粘贴回原始列中。删除圆整后列的冗余副本。在对脂质因子进行圆整后，验证其总和等于100%。若任何行的总和不等于100%，则手动调整其中一个混合因子，确保其仍处于因子范围内。调整完成后，删除总和列。采用与混合因子相同的四舍五入方法，将过程因子四舍五入至相应的粒度。将脂质列的格式设置为显示指定小数位数的百分比形式。如果您添加了手动运行的实验（例如基准测试），请重新随机化表格的行顺序，并添加一列包含四舍五入后的数值。右键单击该列标题，将其按升序排列，然后删除该列。生成三元相图以可视化脂质因素中的实验设计点。同时检查工艺因素中的实验运行分布情况。配方研究人员应确认所有试验运行的可行性。若存在不可行的运行，请重新启动实验设计，考虑新发现的约束条件。按照设计表格中提供的顺序进行实验。将读数记录在实验表格中内置的列中。绘制读数图表并检查响应值的分布情况。如果包含颜色编码的重复运行，则检查这些重复运行之间的相对距离，这有助于理解在基准条件下整个流程和分析变异的总体情况，以及与因子空间内不同因子设置变化所引起的变异之间的比较。在三元相图上绘制运行点。根据响应值对点进行着色，以获得混合因子影响下行为的、独立于模型的视图。右键单击生成的任意图形，选择“行图例”，然后选择响应值对应的列。对每个响应变量重复此步骤。针对每个响应变量，分别建立关于研究因子的独立模型。删除由空间填充设计创建的模型脚本。选择“分析”，然后选择“拟合模型”。构建一个包含所有候选效应的完整模型。该模型应包括各因子的主效应、二阶和三阶交互作用项、过程因子的二次项和部分三次项，以及混合因子的Scheffe三次项。选择所有研究因素。将“度”的条目从默认的“二”更改为“三”，然后选择“到指定度的因子设计”。仅选择非混合因素，然后选择宏，部分三次方。仅选择混合因素，然后选择宏，谢费三次方。取消勾选默认的“无截距”选项。指定响应列，将“人格”更改为“广义回归”。将此模型设置保存到数据表中以便于调用。选择“保存到数据表”。单击“运行”。在估计方法中，选择 SVEM 逐步回归法。展开“高级控制”中的“力项”菜单，并取消勾选与混合主效应对应的复选框。仅保留截距项选中状态。点击“确定”。通过将实际响应值与SVEM模型预测的响应值进行绘图，以验证其预测的合理性。点击SVEM正向选择旁边的红色三角形，选择“保存列”中的“保存预测公式”。这将在数据表中创建一个包含预测公式的新增列。对每个响应变量重复上述建模步骤。当所有响应变量的预测列均已保存至数据表后，使用轮廓分析（profiler）功能绘制所有预测响应列的响应轨迹。选择“图形”（Graph）→“轮廓分析”（Profiler），并将上一步中创建的所有预测列选为 Y 预测公式，点击“确定”（Okay）。确定候选的最佳配方。为每个响应变量设定期望函数，明确其应被最大化、最小化或匹配至某一目标值。同时需设定各响应变量的相对重要性权重。为生成首个候选方案，将所有主要响应设置为重要性权重1.0，所有次要响应设置为重要性权重0.2。指示分析器寻找可最大化期望函数的最优因子设置。选择“优化期望值”中的“最大化期望值”。记录最优因子设置，并注明各响应变量所使用的重要性权重。对于离子化脂质类型等分类因子，需针对每个因子水平找出条件最优的配方。首先，在轮廓图中设置各因子的期望水平。然后按住控制键，同时在该因子的图表内单击鼠标左键，选择“锁定因子设置”。选择优化与期望值，并最大化期望值，以在该因子保持当前设定的条件下找到最优值。完成后，在继续下一步之前，请先解锁因子设置。在修改响应变量的重要性权重后，重复优化过程，可能仅优化主要响应变量，或将某些次要响应变量的重要性权重设为更高或更低，同时将其目标设为“无”。记录新的最优候选方案。生成因子空间最优区域的图形化总结。创建一个包含 50,000 行的数据表，其中填充了在允许的因子范围内随机生成的因子设置，以及每个响应变量的简化模型对应的预测值和联合期望函数。选择“输出随机表”。将要模拟的运行次数更改为 50,000，然后点击“确定”。在新创建的表格中，添加一个新列，用于计算“期望值”列的百分位数。在三元图中使用该百分位数列，而非原始的期望值列。右键单击“期望值”列标题，然后选择“新建公式列”、“分布”，再选择“累积概率”。生成以下图形。反复更改图形的配色方案，以分别显示每个响应变量以及累积概率列的预测结果。针对四种脂质因子构建三元相图。在表格中，导航至图形三元相图。选择用于 X 轴作图的混合因子，然后点击“确定”。在生成的图形之一中单击右键，选择“行图例”，然后选择预测响应列。将颜色下拉菜单更改为 Jet。这将显示相对于脂质因子表现最佳和最差的区域。当前图像显示了在考虑将效价最大化（重要性序列为 1）和将粒径最小化（重要性序列为 0.2）时联合可取性值的百分位数。在三元相图坐标轴未显示的因素上进行平均化处理。反复更改图形的颜色方案，以展示每个响应变量的预测结果。类似地，将代表不同配方的50,000个以颜色编码的点，针对非混合过程因素单独或联合作图，观察响应变量与各因素之间的关系。寻找能使点产量达到最高合意度的因子设置。该图显示了使用三种离子化脂质类型中的每一种所能形成的全部配方的综合合意度。最理想的配方采用H102，而H101可提供一些潜在的有竞争力的替代方案。探索可能导致不同响应的各种因素组合。将预测剖面图及其保存的设置重新保存至数据表中。准备一个表格，列出先前确定的最优候选方案。在将要配制和测定的一组候选样品中包含基准对照。如果实验中的任何配方被发现产生理想结果，例如优于基准对照，则选择其中最佳的配方加入候选表格，并与新配方一起重新测试。在分析仪中右键单击已保存的设置表格，然后选择“生成数据表”。进行验证实验，构建配方并收集读数。比较候选最优配方的性能。该工作流程已应用于多种场景。在大多数情况下，与采用单因素优化方法确定的基准配方相比，我们观察到其效价至少提高了四到五倍。当同时针对次要响应指标进行优化时，改进效果尤为显著。此外，还可以通过模拟来展示该方法所获得的最优候选配方的预期质量。利用本文所述示例实验中已知的数据生成函数，我们可以比较通过本工作流程中使用的空间填充设计和基于SVEM的分析所获得的候选最优配方，与通过传统混合物分析技术所获得配方的质量。图中垂直轴表示最优配方的质量，水平轴表示实验设计中的运行次数，蓝色点代表在150次模拟中未缩减的完整统计模型的表现，琥珀色点代表基于AICC目标函数的传统单次前向选择方法的表现。绿色点代表本工作流程中采用的基于 SVEM 的前向选择方法的性能。SVEM 分析使我们能够获得更优的候选方案并减少实验次数。对于某些复杂性较高的研究，可能需要统计学家在实验设计和数据分析方面提供协助。对于极高优先级的研究，若运行规模通常较小，或存在大量分类因子，或某个单一分类因子具有较多水平，则统计学家可能会采用不同的方法。此时可使用最优设计或混合设计，以替代工作流程中指定的空间填充设计。

a-workflow-for-lipid-nanoparticle-lnp-formulation-optimization-using

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

使用设计的混合工艺实验和自验证集成模型 （SVEM） 优化脂质纳米颗粒 （LNP） 配方的工作流程

本方案描述了一种用于制备亚微米尺寸且高度均一的脂质体囊泡的挤出方法。该方法采用压力可控的系统，并通过控制氮气流速来制备脂质体。本文将介绍脂质体制备1,2、脂质体挤出及粒径表征方法。...

用于制备纳米级脂质囊泡的恒压控制挤出法

本研究描述了一种合成超小生物相容性纳米颗粒群体的方法，以及若干 体外 用于评估其细胞相互作用的方法。...

用于细胞内靶向应用的固体脂质纳米颗粒（SLNs）

采用微流控混合平台方法开发用于mRNA和DNA包封的脂质纳米颗粒。...

利用微流控混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米颗粒

基于微流控技术的脂质纳米颗粒（LNP）制备方法在药物递送系统（DDS）中受到关注，包括RNA递送。本方案描述了使用我们自主研发的名为iLiNP的微流控装置进行LNP（负载siRNA的LNP）的制备、生产及评价过程。...

使用微流控装置制备装载siRNA的脂质纳米颗粒

此处介绍了一种制备包封编码萤火虫荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）的方案。这些LNPs已用于检测其效能 体外 在 HepG2 细胞中 体内 在 C57BL/6...

测试 体外 和 在体 内 微流控混合法制备mRNA-脂质纳米颗粒的效率

本文演示了一种使用限域撞击射流（CIJ）混合器技术合成脂质纳米颗粒（LNPs）的详细方案，其中包括双射流CIJ和四射流多入口涡流混合器（µMIVM）。CIJ混合器可产生可重复的湍流微混合环境，从而制备出单一分散的LNPs。...

在受限撞击射流混合器中通过湍流合成脂质纳米颗粒

分离和表征革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的脂质A区域，有助于深入了解基于细胞表面的抗生素耐药机制、细菌存活与适应性，以及化学结构多样的脂质A分子如何差异性地调节宿主先天免疫反应。...

革兰氏阴性菌脂质A的分离与化学表征

米勒-尤里实验是一项关于有机化合物非生物合成的开创性研究，可能与生命起源相关。将简单气体引入玻璃装置中，并通过电火花放电，模拟早期地球大气-海洋系统中闪电的作用。实验持续进行一周，随后对收集的样品进行分析，以检测其中是否存在生命所需的化学基本组分。...

进行米勒-尤里实验

基于共识基序的合成蛋白质序列通常忽略共进化残基，而共进化残基意味着残基间的相互依赖性（IPDs）。IPDs 可能对蛋白质活性至关重要，若设计中忽略这些依赖性，可能导致效果欠佳。本实验方案利用 StickWRLD...

合成蛋白质的优化：识别表明结构和/或功能相关残基的残基间依赖性

本文介绍了一种在帘流（CF）模式下操作和优化活性流技术（AFT）色谱柱以提高分离性能的实验方案。...

帘流柱：效率与灵敏度的优化

了解使用SVEM模型优化脂质纳米颗粒配方的计算方法。该工作流程通过实验设计表构建和结果分析，最小化统计决策错误，生成信息丰富的可视化图形，帮助配方科学家快速识别最优因子设置。

利用设计的混合-过程实验与自验证集成模型（SVEM）优化脂质纳米颗粒（LNP）制剂的流程

探索更多视频