基于三维重建技术分析荧光染色脂滴以评估肝脂肪变性

这种成像方法能够实现肝内脂滴沉积的三维重建，克服了经典组织学染色在区分大泡性和小泡性脂肪变性方面成功判别的主要缺陷。当使用苏木精-伊红和油红O这两种金标准组织学染色方法时，由于原始脂滴的破裂和偶发融合，对小泡性脂肪变性的评估会受到损害。Pro BODIPY 因其合适的疏水性，可快速摄取并有效标记脂滴，不仅对环境极性不敏感，而且具有极高的选择性，因此为小泡性肝脂肪变性的常规评估提供了替代方案。

这种成像方法结合免疫化学技术，具有更广泛的应用前景，可同时检测其他可能促进脂滴、生物发生及动态研究的亚细胞抗原，为大泡性和小泡性肝脂肪变性提供基础。打开冷冻切片机，将从大鼠采集的冷冻肝组织切成12微米厚的切片。将切片置于室温下的标记显微镜载玻片上。

进行BODIPY染色时，用PBS洗涤组织切片三次，每次五分钟。最后一次洗涤后，使用疏水屏障笔在载玻片上将切片周围画圈。配制含有BODIPY 493503和DAPI的染色液。

然后将75 µL溶液移液至每张载玻片上。将载玻片在室温下避光孵育40分钟。孵育结束后，用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。

然后，使用荧光封片剂，将盖玻片小心地封固在每张载玻片上。让载玻片干燥30分钟，再用指甲油密封边缘。打开激光扫描共聚焦显微镜，将载玻片放置在载物片托上。

进行图像观察和采集时，选择20倍物镜。在共聚焦软件中，选择逐帧扫描模式，以避免BODIPY 493503与DAPI之间的串色。然后使用488纳米氩离子激光线激发BODIPY 493503染料，使用405纳米激光线激发DAPI染色。

BODIPY 的发射波长范围为 493 至 589 纳米，DAPI 的发射波长范围为 410 至 464 纳米。接下来，通过调整帧大小、扫描速度和平均值来配置显微镜参数，其中平均值设置包括次数为 2 次、位深度为 12 位、扫描方向为双向、扫描区域、数字缩放为减一、针孔面积为减一。调节增益和数字增益设置。

确保像素无过饱和，以范围指示器显示为准。在准确识别脂滴后，使用BODIPY和DAPI通道采集图像。为获得大视野图像，切换至10倍物镜，然后启动拼接扫描模式，并将其设置为生成5×5的拼接图像。

为生成三维图像和正交视图，在盖玻片顶部滴加一滴浸油，然后将物镜切换至40倍物镜。选择Z轴层扫模式，调节Z平面以确定图像采集的起始和终止位置，确保光学切片厚度约为0.5微米，从而清晰捕获所有液滴。

选择正交模块并创建正交视图。通过选择3D模块并采用透明渲染模式来获取3D图像。图像采集完成后，使用Cell Profiler对单平面图像进行处理和分析。

通过点击细胞分析软件界面左上角的图像模式，以TIFF格式上传图像。根据文件名，使用“名称和类型”模块对BODIPY脂滴染色图像和DAPI细胞核染色图像进行分类。进行脂滴分析时，仅使用BODIPY染色图像。

通过单击调整模块并选择“转为灰度”模块，将图像转换为灰度图像，从而启动流程构建。然后使用“识别初级对象”模块，将脂滴的大小定义为6至300像素，并设置阈值校正因子为1，以在灰度图像中检测脂滴。为测量所识别脂滴的像素强度，添加“测量对象强度”模块。

加入一个额外的过滤对象模块，以确保仅对最强的信号进行定量，而将较弱的信号从最终的脂滴分析中排除。接下来，为了测量与输出数据相关的脂滴，添加测量对象大小和形状模块。然后添加一个叠加轮廓模块，将已识别的脂滴叠加到原始图像上，从而确保分割结果在未经处理的图像上同样准确。

完成后，添加导出至电子表格模块，并点击左下角的“分析图像”按钮。与对照组相比，高脂饮食喂养的动物表现出明显的血脂异常特征，以及循环甘油三酯水平的轻微升高。大范围图像显示，高脂饮食喂养动物肝脏中的脂滴数量增加。

使用Cell Profiler分析显示，肝细胞脂滴数量增加，BODIPY荧光强度增强，面积比达360%，且脂滴直径增大。高脂饮食喂养动物的脂滴大小分布显示，大于九微米的巨泡性肝细胞脂滴增多，而小于三微米的微泡性脂滴减少。