Name: 荧光染色脂滴分析与3D重建，用于肝脂肪变性评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学习使用BODIPY 493/503荧光染色和三维重建技术评估肝脂肪变性。该方法可区分微泡性和大泡性脂肪变性，为传统组织学技术提供补充方案，助力研究脂滴生物发生与动态变化。

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本研究由国家和欧洲基金资助 通过 葡萄牙科学技术基金会（FCT）、欧洲区域发展基金（FEDER）和竞争力操作计划（COMPETE）：2020.09481.BD，UIDP/04539/2020（CIBB）和POCI-01-0145-FEDER-007440。作者谨此感谢iLAB—显微与生物成像实验室的支持，该实验室隶属于科英布拉大学医学院，是国家基础设施PPBI—葡萄牙生物成像平台（POCI-01-0145-FEDER-022122）的成员单位，同时感谢FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142项目的支持。

本研究中进行的所有动物实验均经科英布拉临床与生物医学研究所（iCBR）动物福利委员会（ORBEA，编号#9/2018）批准，并遵循国家和欧洲动物护理法规以及ARRIVE指南。
1. 实验设计
<ol>
	<li>将13周龄雄性Wistar大鼠成对饲养于通风笼具中，环境条件控制在温度（22 °C ± 1 °C）、湿度（50%–60%）和光照（12小时明暗循环）下，并提供 随意摄取 可自由获取自来水和标准啮齿类动物饲料。</li>
	<li>经过2周的适应期后，将大鼠随机分为两组。</li>
	<li>分别给予对照组（CTRL，n = 6）标准饲料，高脂饮食组（HFD，n = 6）高脂饲料（45% kcal/fat），持续24周。</li>
	<li>每周监测体重（BW）。每天按笼记录食物和饮料的消耗量。</li>
</ol>
2. 肝脏样品制备
<ol>
	<li>肝脏解剖
	<ol>
		<li>准备蠕动泵：将70%乙醇通过管路冲洗，将27 G针头连接至管路出口端，并用冰浴（4 °C）的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH ~7.4）预充管路（例如，使用内径1.6 mm硅胶管、IV微量输液装置，在蠕动泵上以200 rpm运行）。根据体重调整流速（例如，对于100–150 g的大鼠，使用约10–12 mL/min的流速）。</li>
		<li>通过腹腔注射麻醉剂方案对大鼠进行麻醉（氯胺酮终浓度 = 75 mg/kg，美托咪啶终浓度 = 1 mg/kg）。 
		注意：请使用脚趾夹捏反应法确认大鼠已完全麻醉。</li>
		<li>将大鼠放置于解剖托盘上。</li>
		<li>用70%乙醇彻底消毒毛发，并用纸巾擦干。</li>
		<li>使用剪刀在皮肤上做&#34;U&#34;形切口，并在膈肌下方剪开。然后沿肋骨边缘向头侧剪开肋骨，以暴露心脏。</li>
		<li>在1×PBS运行的同时，将针头从左心室插入升主动脉并夹紧。然后剪开右心房，以便灌注开始后液体排出。 
		注意：随着血液被PBS替换，肝脏应开始变白。</li>
		<li>使用剪刀和Dumont镊子小心取出肝脏，并用1×PBS冲洗。</li>
		<li>将肝脏转移至培养皿中并称重。</li>
		<li>使用手术刀从肝脏左叶外侧（距边缘1 cm处）采集厚度为5 mm的肝组织样本，用于包埋。 
		注意：剩余组织可储存于−80 °C以长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝脏组织包埋
	<ol>
		<li>准备一个干冰容器，并在冷冻模具上正确标记样本编号和方向。</li>
		<li>在冷冻模具中心滴加数滴冷冻包埋介质，以制备最佳切削温度（OCT）包埋剂。</li>
		<li>确保组织样本正确朝向，以便进行横切面切片。 
		注意：请确保接触冷冻模具底部的一面是将首先被切片的一面。</li>
		<li>小心地向冷冻模具中再滴加OCT，直至完全覆盖组织。尽量避免气泡形成。如有必要，使用普通镊子去除OCT内部的气泡。</li>
		<li>迅速将含有OCT覆盖样本的冷冻模具放入干冰容器中。 
		&#8203;注意：组织可在−80 °C下保存长达3年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 冷冻组织切片
<ol>
	<li>调节恒冷切片机温度（舱内：−21 °C；样本：−18 °C），并插入新的无菌刀片。</li>
	<li>将样本放入恒冷切片机中静置 30 分钟，使其温度达到平衡。</li>
	<li>在样本托盘上铺一层 OCT 包埋剂，以利于样本黏附。待 OCT 冷冻后，将组织样本按所需方向固定。 
	注意：切割面应与刀片平行。为保持良好黏附性，可将散热器置于样本上方。上述步骤也可在盛有干冰的容器中进行。</li>
	<li>将样本安装至样本头，修整组织表面（切去数片厚约 30 µm 的组织切片）。</li>
	<li>当目标区域暴露并适合切片时，切取 12 µm 厚的切片，并将其转移至室温（RT）下预标记的载玻片上。 
	注意：收集切片时，应缓慢将载玻片移向组织切片。每张载玻片可收集两个肝组织切片。</li>
	<li>将载玻片在室温下干燥 10 分钟。 
	&#8203;注意：载玻片可在 −20 °C 保存 6–12 个月，或在 −80 °C 保存长达 3 年。</li>
</ol>
4. BODIPY 染色
<ol>
	<li>在室温下将载玻片放入载玻片染色系统中解冻 30 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 洗涤（每次 5 分钟，共 3 次）。</li>
	<li>使用疏水笔在组织区域周围画圈形成疏水屏障。</li>
	<li>制备 500 µg/mL BODIPY 493/503&#160;储备液：将 1 mg BODIPY 493/503 溶于 2 mL 溶剂（90% DMSO；10% 1× PBS）中。避光保存。在 37 °C 下超声处理 1 小时（功率 9.5–10 W）。 
	注意：该溶液可在 −20 °C 下保存至少 30 天。</li>
	<li>通过将 2 µL BODIPY 493/503 储备液和 0.1 µL DAPI 储备液（5 mg/mL）加入 997.9 µL 1× PBS 中，配制 BODIPY 染色工作液（1 µg/mL）。</li>
	<li>每张载玻片加入 75 µL 染色液，在室温下避光孵育 40 分钟，使 BODIPY 493/503（1 µg/mL）和 DAPI（0.1 µg/mL）与样本反应。 
	注意：从本步骤开始，所有操作均需避光。</li>
	<li>用 1× PBS 洗涤载玻片（每次 5 分钟，共 3 次）。</li>
	<li>使用荧光封片剂将盖玻片封固于载玻片上，室温静置 30 分钟使其干燥，然后用指甲油封边。 
	&#8203;注意：载玻片可在 4 °C 下避光保存，直至成像分析。</li>
</ol>
5. 脂质定量
<ol>
	<li>使用经过验证的自动方法和设备测定血清总胆固醇和TG水平。</li>
	<li>根据制造商的说明书，使用甘油三酯比色法检测试剂盒（材料表）测定肝脏TG水平。</li>
</ol>
6. 图像采集
<ol>
	<li>将载玻片放置在激光扫描共聚焦显微镜的载物片 holder 上。</li>
	<li>进行图像观察和采集时，使用配备 20 倍物镜（平场复消色差：20x/0.8）的共聚焦显微镜。</li>
	<li>为避免 BODIPY 493/503 与 DAPI 之间的串扰，请在共聚焦软件中使用顺序扫描模式（最佳信号模式）。</li>
	<li>使用 488 nm 氩离子激光线激发 BODIPY 493/503，使用 405 nm 激光线激发 DAPI。将 BODIPY 493/503 的发射波长范围设置为 493–589 nm，DAPI 的发射波长范围设置为 410–464 nm。</li>
	<li>使用以下设置：针孔：1 AU，分辨率：1,024 像素 × 1,024 像素，位深度：12，像素大小：0.415 µm，双向扫描模式，扫描速度：7（约 1.58 µs/像素，适用于 20x 物镜），线平均：2 次，数字缩放：1。 
	注意：上述扫描参数必须针对所使用的每台共聚焦显微镜和物镜进行优化。</li>
	<li>适当设置增益和数字增益，确保在范围指示器上未检测到饱和像素。 
	注意：通过调整偏移量来校正背景信号。</li>
	<li>一旦脂滴（LDs）被正确识别，即使用 BODIPY 和 DAPI 通道采集图像。 
	注意：所有图像必须在相同条件下（曝光时间和通用设置）对每个颜色通道进行采集。</li>
	<li>为生成大视野图像（图 2），将物镜更换为 10x 物镜（平场新荧光：10x/0.3）。</li>
	<li>选择 拼图扫描（Tile Scan） 模式，生成 5×5 图像的拼接图。 
	注意：在本研究中，每幅图像拼接时重叠 10%，以便在分析时正确合并图像。</li>
	<li>为生成三维（3D）和正交视图（图 3A），在盖玻片顶部滴加一滴浸油，并将物镜更换为 40x 物镜（平场新荧光：40x/1.30 油）。</li>
	<li>选择 Z-Stack 模式，通过调节 Z 平面，定义采集的起始和终止位置，光学切片厚度应设置为最佳值（约 0.5 µm），以确保捕获所有脂滴。 
	注意：为加快图像采集速度并避免光漂白，可将光学切片厚度调整为次优尺寸，但需确保至少 30% 的过采样，以获得良好的三维重建效果。</li>
	<li>选择 正交（Ortho） 模块，生成正交视图。</li>
	<li>选择共聚焦显微镜软件中的 3D 模块，并按照 透明度渲染模式（Transparency Rendering Mode） 采集三维图像。</li>
</ol>
7. 图像分析
<ol>
	<li>使用 CellProfiler（版本 4.2.5）处理和分析单平面图像（20 倍放大）。 
	注：本研究中使用的分析流程改编自 Adomshick 等人.45。</li>
	<li>单击 CellProfiler 窗口左上角的 Images 模块，并以 .tiff 文件格式上传图像。</li>
	<li>使用 NamesAndTypes 模块根据文件名区分 BODIPY-（脂滴）和 DAPI-（细胞核）染色的图像。仅对 BODIPY 染色图像进行脂滴分析。</li>
	<li>要开始构建分析流程，请单击 Adjust Modules，然后选择 ColorToGray 模块，将图像转换为灰度图像。 
	注：对象识别需要使用灰度图像。</li>
	<li>使用灰度图像，通过 IdentifyPrimaryObjects 模块识别脂滴。 
	注：该模块中的参数必须进行调整，以实现良好的脂滴识别效果。在本研究中，将脂滴定义为大小在 6 像素至 300 像素之间、阈值校正因子为 1.0 时，可获得最准确的识别结果。</li>
	<li>为测量已识别脂滴的像素强度，添加一个 MeasureObjectIntensity 模块。</li>
	<li>添加另一个 FilterObjects 模块，以确保仅对最强信号进行定量，而较弱信号则从最终的脂滴分析中排除（最小强度：0.15；最大强度：1 任意单位）。</li>
	<li>为测量与输出数据相关的脂滴特征，添加 MeasureObjectSizeShape 模块。</li>
	<li>在此处添加一个 OverlayOutlines 模块，将已识别的脂滴轮廓叠加到原始图像上，从而确保在未处理图像上分割结果同样准确。 
	注：此为可选步骤（质量控制）。</li>
	<li>最后添加一个 ExportToSpreadsheet 模块，然后单击左下角的 Analyze Images 按钮。</li>
</ol>
8. 统计分析
<ol>
	<li>使用任何统计分析软件，以均值 ± 均值标准误（S.E.M.）的形式表示结果。 
	注：本研究中使用 GraphPad 软件进行统计分析。</li>
	<li>采用 Kolmogorov-Smirnov 检验分析数值分布，以评估与正态分布的显著偏离。使用 Student 非配对 t 检验分析参数数据。 
	注：认为 p &#60; 0.05 的值具有统计学显著性。</li>
</ol>

Assessing Hepatic Steatosis with 3D Fluorescence Lipid Droplet Reconstruction

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究旨在建立一种基于BODIPY 493/503荧光的脂滴（LD）评估方案，以开发一种用于评估肝脂肪变性的新型成像方法。鉴于肥胖与脂肪肝疾病之间存在强相关性，采用西式高脂饮食（HFD）建立肝脂肪变性动物模型26。通过定量甘油三酯比色检测试剂盒确认，HFD喂养动物肝脏中的甘油三酯（TG）含量显著升高，提示其肝脂质沉积状况加剧。随后，在低倍镜下使用荧光探针BODIPY 493/503对脂滴累积程度进行可视化观察。结果如预期所示，HFD组肝脏组织中可见广泛分布的囊泡样结构。通过正交投影和三维重建技术进一步观察发现，脂滴核心富含中性脂质，呈现为近乎球形的脂滴。此外，脂滴面积占总面积的比例显著增加（较对照组升高360%），且该区域极可能充满中性甘油三酯，这与其在HFD组中测得的定量水平一致（52.83 mg/g ± 6.73 mg/g；较对照组升高346%）。为进一步表征HFD喂养条件下脂滴的动态变化，分析了肝脂肪变性的微泡性或大泡性特征。依据文献中既往报道的脂滴直径范围4,46<...

脂滴（LDs）传统上被视为能量储存库，是一类介导脂质储存的特化细胞器，其结构包含一个主要由胆固醇酯和甘油三酯（TGs）组成的疏水性中性脂质核心，并由一层磷脂单分子层包裹1,2,3。
脂滴（LD）的生成起始于内质网（ER），最初由三酰甘油（TAG）和甾醇酯的合成开始。中性脂质在低浓度时可弥散分布于内质网双分子层的两个小叶之间，但当其细胞内浓度升高时，则会聚集形成油相透镜状结构，并逐渐生长并从内质网膜上出芽，形成近乎球形的脂滴4。随后，来自内质网双分子层和细胞质的蛋白质，特别是脂滴包被蛋白（perilipin, PLIN）家族蛋白，会转位至脂滴表面，促进其出芽过程5,6,7,8,9。
通过新的脂肪酸合成以及脂滴（LD）的融合或聚集，脂滴可生长为不同大小。因此，不同细胞类型中脂滴的大小和数量存在显著差异。几乎所有细胞都能形成直径为300–800 nm的小脂滴，这类脂滴被称为初始脂滴（iLDs）4。在脂滴形成的后期，大多数细胞能够将部分iLDs转化为更大的脂滴——扩张型脂滴（eLDs &#62;1 µm 直径）。然而，只有特定类型的细胞（如脂肪细胞和肝细胞）具备形成巨大或超大型脂滴的能力（直径可达数十微米）4,10。
脂滴（LDs）在调控细胞脂质代谢、抑制脂毒性、防止内质网应激、线粒体功能障碍以及最终由游离脂肪酸（FAs）引起的细胞死亡中发挥着极为重要的作用11,12,13,14。此外，脂滴还参与基因表达调控、病毒复制蛋白的隔离以及膜运输和信号转导过程15,16,17。因此，脂滴生成的异常调控是多种慢性疾病的标志性特征，这些疾病包括代谢综合征、肥胖、2型糖尿病（T2DM）和/或动脉粥样硬化等18,19,20。
肝脏作为代谢中枢，主要负责脂质的储存与代谢，因此经常面临脂毒性威胁21。肝脂肪变性（HS）是一系列进行性肝病的常见特征，其特征是细胞质脂滴（LDs）形式的细胞内脂质过度积聚，最终可能导致肝脏代谢功能障碍、炎症以及非酒精性脂肪性肝病的进展期病变22,23,24,25。当脂肪酸通过极低密度脂蛋白（VLDLs）进行氧化和转运的速率低于肝脏从血浆摄取脂肪酸以及de novo合成脂肪酸的速率时，便会发生肝脂肪变性26。肝脏中脂质的积聚通常表现为两种形式——微泡性脂肪变性和大泡性脂肪变性——二者具有不同的细胞结构特征27。通常，微泡性脂肪变性的特征是肝细胞胞质中散布着许多小脂滴，细胞核位于中央；而大泡性脂肪变性的特征则是存在一个占据肝细胞大部分体积的单一大脂滴，将细胞核挤向边缘28,29。值得注意的是，这两种脂肪变性常同时存在，目前尚不清楚这两种脂滴分布模式如何影响疾病的发生发展，相关证据仍不一致31,32,33,34。然而，此类分析常被用作临床前和临床研究中的&#34;参考标准&#34;，以理解脂滴的动态行为并表征肝脂肪变性29,34,35,36。
肝活检是诊断和分级肝脂肪变性的金标准，通常通过组织学苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色分析进行评估，其中脂滴在H&amp;#38;E染色的肝组织切片中表现为无着色的空泡37。尽管该方法适用于大泡性脂肪变性的评估，但此类染色通常会限制对小泡性脂肪变性的准确判断38。脂溶性偶氮染料（如油红O（ORO））传统上结合明场显微镜用于分析细胞内脂质储存，但这些方法仍存在若干缺点：（i）染色过程中使用乙醇或异丙醇，即使细胞已固定，也常导致天然脂滴结构破坏并偶发融合39；（ii）操作耗时，因ORO溶液需现配现用，包括溶解粉末和过滤步骤，且保存期限有限，导致实验结果一致性较差；（iii）ORO不仅染色脂滴，还会染色其他成分，常导致肝脂肪变性的高估38。
因此，细胞可渗透的疏水性荧光染料（如尼罗红）已被用于活细胞或固定样品中，以克服上述部分局限性。然而，这类染料对细胞脂质细胞器的标记具有非特异性，常常限制了脂滴的准确评估40。此外，尼罗红的光谱特性会随环境极性的不同而变化，常导致光谱偏移41。
疏水性荧光探针1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并[1,2,3-cd]荧光素（激发波长：480 nm；发射峰值：515 nm；BODIPY 493/503）具有疏水特性，可被细胞内脂滴（LD）快速摄取，并在脂滴核心中富集，随后发出明亮的绿色荧光12。与尼罗红不同，BODIPY 493/503对环境极性不敏感，且已被证明具有更高的选择性，因其在脂滴成像中表现出高亮度。为了染色中性脂滴，该染料可用于活细胞或固定细胞，并可成功与其他染色和/或标记方法联用42。该染料的另一优势在于其溶解简便且稳定性高，因此无需每次实验前新鲜配制42。尽管BODIPY 493/503探针已成功用于细胞培养中脂滴定位与动态的可视化，但一些研究也证实了该染料在组织中的可靠应用，包括人股外侧肌43、大鼠比目鱼肌42以及小鼠肠道44中的脂滴成像。
本文提出了一种基于BODIPY 493/503的优化实验方案，作为评估肝脂肪变性动物模型肝组织样本中脂滴数量、面积和直径的替代性分析方法。该方案涵盖了肝组织样本制备、切片、染色条件、图像采集及数据分析等步骤。

<table><tbody><tr><td>1.6 mm 内径硅胶管，I.V. 微滴输液套件</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-吲哚（BODIPY 493/503）</td><td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Honeywell</td><td>10191455</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC</td><td>Adobe Inc.</td><td>用于设计图像</td><td></td></tr><tr><td>全自动分析仪 Hitachi 717</td><td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany</td><td>8177-30-0010</td><td></td></tr><tr><td>屏障笔（Liquid blocker super pap pen）</td><td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>刀片</td><td>Leica</td><td>221052145</td><td>用于冷冻切片机</td></tr><tr><td>Cell Profiler 版本 4.2.5</td><td>https://cellprofiler.org/releases/</td><td>用于分析获取的图像</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Menzel-Glaser, Germany</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具</td><td>Tissue-Tek</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机（含样本盘和散热装置）CM3050 S</td><td>Leica Biosystems</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td><td>D-8418</td><td>用于溶解 BODIPY 以配制 5 mg/mL 储存液。注意：有毒&lt;br/&gt;且易燃。蒸气可能引起&lt;br/&gt;刺激。应在通风橱中操作。&lt;br/&gt;避免皮肤直接接触。&lt;br/&gt;佩戴橡胶手套和防护眼镜。&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>干冰容器（泡沫塑料冷藏箱）</td><td>Novolab</td><td>A26742</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿（高 25 mm，&amp;oslash;&lt;br/&gt; 150 mm）</td><td>Thermo Scientific</td><td>150318</td><td>用于解剖后称量肝脏</td></tr><tr><td>甘油封片剂（Glycergel）</td><td>DAKO Omnis</td><td>S303023</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件，版本 9.3.1</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高脂饮食</td><td>Envigo, Barcelona, Spain</td><td>MD.08811</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Nimatek&amp;nbsp; 100 mg/mL）</td><td>Dechra</td><td>791/01/14DFVPT</td><td>使用终浓度为 75 mg/kg</td></tr><tr><td>激光共聚焦扫描显微镜&amp;nbsp;（QUASAR 检测单元）</td><td>Carl Zeiss, germany</td><td>LSM 710 Axio Observer Z1 显微镜</td><td></td></tr><tr><td>美托咪啶（Sedator 1 mg/mL）</td><td>Dechra</td><td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td><td>使用终浓度为 1 mg/kg</td></tr><tr><td>针头</td><td>BD microlance</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>15 号无菌碳钢手术刀&lt;br/&gt;刀片</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td></td></tr><tr><td>物镜：10x（Plan-Neofluar 10x/0.3）、20x（Plan-Apochromat 20x/0.8）和 40x（Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil）</td><td>&amp;nbsp;Carl Zeiss, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td><td>&amp;nbsp;用于处理冷冻切片</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵（Minipuls 3）</td><td>Gilson</td><td>1004170</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS，pH ~ 7.4）</td><td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄，125 mm（5&quot;），3 号</td><td>Swann-Morton</td><td>0208</td><td></td></tr><tr><td>载玻片染色系统 StainTray</td><td>Simport Scientific</td><td>M920</td><td></td></tr><tr><td>标准饮食</td><td>&amp;nbsp;Mucedola</td><td>4RF21</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>Menzel-Glaser, Germany</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT 包埋介质</td><td>VWR CHEMICALS</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>甘油三酯比色法检测试剂盒</td><td>Cayman Chemical</td><td>10010303</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Bandelin Sonorex</td><td>&amp;nbsp;TK 52</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm&lt;br/&gt; 刃口</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Black 软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于三维重建技术分析荧光染色脂滴以评估肝脂肪变性

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

脂滴（LDs）是一类特化的细胞器，介导脂质储存，在抑制脂毒性及防止游离脂肪酸（FAs）引起的细胞功能障碍方面发挥着极为重要的作用。肝脏在机体脂肪代谢中具有关键作用，因此持续面临脂滴在细胞内积聚的威胁，表现为微泡性和大泡性肝脂肪变性。对脂滴的组织学表征通常依赖脂溶性偶氮染料，例如油红O（ORO）染色，但该方法在肝脏样本中的应用存在诸多局限性。近年来，亲脂性荧光染料BODIPY 493/503因其能快速摄取并富集于中性脂滴核心，已成为可视化和定位脂滴的常用工具。尽管其在细胞培养中的大多数应用已有详尽描述，但在组织样本中将其作为脂滴成像工具的可靠证据仍较为有限。本文提出了一种基于BODIPY 493/503的优化方案，用于评估高脂饮食（HFD）诱导肝脂肪变性动物模型肝脏样本中的脂滴。该方案涵盖肝脏样本制备、组织切片、BODIPY 493/503染色、图像采集及数据分析。我们发现，经高脂饮食喂养后，肝细胞中脂滴的数量、荧光强度、面积占比及直径均显著增加。通过正交投影和三维重建，可完整观察脂滴核心中的中性脂质，其形态呈近乎球形的颗粒。此外，利用BODIPY 493/503荧光染料，我们能够区分微泡（1 µm &lt; d ≤ 3 µm）、中等泡（3 µm &lt; d ≤ 9 µm）和大泡（d &gt; 9 µm），从而成功区分微泡性和大泡性脂肪变性。总体而言，该基于BODIPY 493/503荧光的方案是一种可靠且简便的肝脂滴表征工具，可作为经典组织学方法的有力补充。

成功实施该技术应获得清晰的脂滴染色结果，从而可同时表征脂滴的形态（基于三维重建的形状和脂质核心密度）及其空间分布、单位总面积内的数量和平均大小（通过上述流程进行评估，图1）。
<img alt="使用BODIPY标记的脂滴和DAPI染色的细胞核进行荧光显微成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65206/65206fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：使用CellProfiler进行图像处理示例。（A）对照组（CTL）中用BODIPY 493/503（绿色）染色的脂滴（LDs）和DAPI（蓝色）染色的细胞核的原始图像。（B）使用<str...

本文展示了一种基于BODIPY 493/503荧光的优化方案，用于肝组织中脂滴的表征。通过正交投影和三维重建技术，该荧光染料可有效区分微泡性与大泡性脂肪变性，可作为经典组织学方法评估肝脂肪变性的补充手段。

脂滴（LDs）是介导脂质储存的特化细胞器，在抑制脂毒性及预防……方面发挥着极为重要的作用

这种成像方法能够实现肝内脂滴沉积的三维重建，克服了经典组织学染色在区分大泡性和小泡性脂肪变性方面成功判别的主要缺陷。当使用苏木精-伊红和油红O这两种金标准组织学染色方法时，由于原始脂滴的破裂和偶发融合，对小泡性脂肪变性的评估会受到损害。Pro BODIPY 因其合适的疏水性，可快速摄取并有效标记脂滴，不仅对环境极性不敏感，而且具有极高的选择性，因此为小泡性肝脂肪变性的常规评估提供了替代方案。这种成像方法结合免疫化学技术，具有更广泛的应用前景，可同时检测其他可能促进脂滴、生物发生及动态研究的亚细胞抗原，为大泡性和小泡性肝脂肪变性提供基础。打开冷冻切片机，将从大鼠采集的冷冻肝组织切成12微米厚的切片。将切片置于室温下的标记显微镜载玻片上。进行BODIPY染色时，用PBS洗涤组织切片三次，每次五分钟。最后一次洗涤后，使用疏水屏障笔在载玻片上将切片周围画圈。配制含有BODIPY 493503和DAPI的染色液。然后将75 µL溶液移液至每张载玻片上。将载玻片在室温下避光孵育40分钟。孵育结束后，用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。然后，使用荧光封片剂，将盖玻片小心地封固在每张载玻片上。让载玻片干燥30分钟，再用指甲油密封边缘。打开激光扫描共聚焦显微镜，将载玻片放置在载物片托上。进行图像观察和采集时，选择20倍物镜。在共聚焦软件中，选择逐帧扫描模式，以避免BODIPY 493503与DAPI之间的串色。然后使用488纳米氩离子激光线激发BODIPY 493503染料，使用405纳米激光线激发DAPI染色。BODIPY 的发射波长范围为 493 至 589 纳米，DAPI 的发射波长范围为 410 至 464 纳米。接下来，通过调整帧大小、扫描速度和平均值来配置显微镜参数，其中平均值设置包括次数为 2 次、位深度为 12 位、扫描方向为双向、扫描区域、数字缩放为减一、针孔面积为减一。调节增益和数字增益设置。确保像素无过饱和，以范围指示器显示为准。在准确识别脂滴后，使用BODIPY和DAPI通道采集图像。为获得大视野图像，切换至10倍物镜，然后启动拼接扫描模式，并将其设置为生成5×5的拼接图像。为生成三维图像和正交视图，在盖玻片顶部滴加一滴浸油，然后将物镜切换至40倍物镜。选择Z轴层扫模式，调节Z平面以确定图像采集的起始和终止位置，确保光学切片厚度约为0.5微米，从而清晰捕获所有液滴。选择正交模块并创建正交视图。通过选择3D模块并采用透明渲染模式来获取3D图像。图像采集完成后，使用Cell Profiler对单平面图像进行处理和分析。通过点击细胞分析软件界面左上角的图像模式，以TIFF格式上传图像。根据文件名，使用“名称和类型”模块对BODIPY脂滴染色图像和DAPI细胞核染色图像进行分类。进行脂滴分析时，仅使用BODIPY染色图像。通过单击调整模块并选择“转为灰度”模块，将图像转换为灰度图像，从而启动流程构建。然后使用“识别初级对象”模块，将脂滴的大小定义为6至300像素，并设置阈值校正因子为1，以在灰度图像中检测脂滴。为测量所识别脂滴的像素强度，添加“测量对象强度”模块。加入一个额外的过滤对象模块，以确保仅对最强的信号进行定量，而将较弱的信号从最终的脂滴分析中排除。接下来，为了测量与输出数据相关的脂滴，添加测量对象大小和形状模块。然后添加一个叠加轮廓模块，将已识别的脂滴叠加到原始图像上，从而确保分割结果在未经处理的图像上同样准确。完成后，添加导出至电子表格模块，并点击左下角的“分析图像”按钮。与对照组相比，高脂饮食喂养的动物表现出明显的血脂异常特征，以及循环甘油三酯水平的轻微升高。大范围图像显示，高脂饮食喂养动物肝脏中的脂滴数量增加。使用Cell Profiler分析显示，肝细胞脂滴数量增加，BODIPY荧光强度增强，面积比达360%，且脂滴直径增大。高脂饮食喂养动物的脂滴大小分布显示，大于九微米的巨泡性肝细胞脂滴增多，而小于三微米的微泡性脂滴减少。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

荧光染色脂滴分析与3D重建，用于肝脂肪变性评估

油红O染色：一种用于体外检测肝细胞中性脂质以识别肝脂肪变性的技术

此处优化了生成方法 体内 和 体外 描述了肝脂肪变性模型的建立方法，以及对脂肪变性表型和相关生理参数的分析。...

优化分析 体内 和 体外 肝脂肪变性

本研究中，我们描述了一种使用脂肪酸盐油酸钠在分化型HepaRG细胞中诱导肝泡性脂肪变性的详细方案，并介绍了脂质积聚的检测与定量方法，包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像、细胞荧光分析、油红O染色以及定量PCR。...

在分化型HepaRG细胞中诱导并表征囊泡性脂肪变性

本方案描述了一种用于表征脂肪酸刺激下人肠道类器官中脂滴（LD）形成的检测方法。我们讨论了如何利用该检测方法对脂滴形成进行定量分析，以及如何将其用于筛选影响脂滴形成的药物的高通量筛选。...

一种基于荧光的检测方法用于表征和定量人肠道类器官中脂滴的形成

本方案旨在作为研究肝细胞因脂质过度暴露而引发的脂肪变性，以及相关的分子、生化和细胞变化的工具 体外.

一种实验性脂肪变性的模型 体外肝细胞在脂质超载条件培养基中的培养

本实验方案描述了如何使用油红O染色脂滴（LDs），在脂肪酸诱导的脂肪变性肝细胞模型中计算脂滴的大小和数量，并利用BODIPY...

牛肝细胞中脂滴大小与融合的评估

本研究描述了基于脱细胞的方法，用于通过完整的肌肉体积来可视化和量化肌内脂肪组织（IMAT）的沉积，以及量化构成IMAT的单个脂肪细胞的各项指标。...

基于脱细胞技术的骨骼肌脂肪浸润定量分析

影响眼部视网膜色素上皮层的退行性眼病具有单基因和多基因起源。目前已开发出多种疾病模型及一种名为LipidUNet的软件应用，用于研究疾病的发病机制以及潜在的治疗干预手段。...

LipidUNet——基于机器学习的iPSC来源视网膜色素上皮细胞中脂质沉积物表征与定量分析方法

本文描述了使用油酸诱导的HepG2细胞作为代谢功能障碍相关脂肪性肝病的模型。...

代谢功能障碍相关脂肪性肝病中脂肪沉积的体外建模

本方案介绍了一种全面的成像流程，用于在完整肝组织中可视化并建模肝星状细胞的形态。该方法结合利用小鼠遗传学对成纤维细胞进行荧光标记， 原位 基于肝脏灌注的组织制备，以及改良的iDISCO组织透明化方法，以实现光学透明。...

在小鼠肝纤维化模型中绘制肝星状细胞形态

本方案利用同步化的肝癌细胞，可重复地观察有丝分裂过程中脂滴和细胞器的动态变化。...

一种基于荧光的方法用于可视化肝癌细胞有丝分裂过程中脂滴与细胞器的动态变化

学习使用BODIPY 493/503荧光染色和三维重建技术评估肝脂肪变性。该方法可区分微泡性和大泡性脂肪变性，为传统组织学技术提供补充方案，助力研究脂滴生物发生与动态变化。

基于三维重建技术分析荧光染色脂滴以评估肝脂肪变性

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