通过3C获得A：面向本科生的染色体构象捕获技术

我们的研究旨在揭示染色质结构如何调控基因表达。重点在于确定在基因水平上调控染色质以控制基因活性的各种因素。目前，该领域主要采用类似于染色体构象捕获（chromosome conformation capture）或 3C 的技术来推动研究进展。

样本采集和测序技术的进步推动了我们对 3C 技术所能揭示内容的认知。目前最大的实验挑战是获取具有均一染色质结构的样本。样本的异质性会导致结果混淆。

未来，我们将重点关注染色质结构的改变在癌症中所起的作用。在第一天，对5,000条年轻成年秀丽隐杆线虫进行染色质交联并收集细胞核后，将重悬于450微升纯水中的细胞核沉淀转移至一个洁净的1.5毫升微量离心管中。然后加入60微升10倍DpnII限制性内切酶缓冲液，并充分混匀。

将样品与15微升10%十二烷基硫酸钠在37摄氏度下振荡孵育1小时。加入75微升20%Triton X-100终止反应，并按先前所示条件进行孵育。从样品中取出10微升作为未消化对照，分装后于4摄氏度保存。

向剩余样品中加入 400 单位 DpnII 后，在 37 摄氏度下振荡孵育过夜，以进行染色质消化。第二天，向样品中额外加入 200 单位 DpnII。为完成交联样品的消化，将其在 37 摄氏度下振荡孵育 4 小时。

将样品在 65 摄氏度孵育 20 分钟，以热灭活限制性内切酶。若该酶无法通过加热灭活，则加入 80 微升 10% 十二烷基硫酸钠并孵育。然后向样品中加入 375 微升 20% Triton X-100，并通过轻轻旋转混匀。

从样品中留出10微升等分试样作为消化对照。进行染色质连接时，将样品转移至洁净的50毫升锥形管中。用分子生物学级水将样品体积调至5.7毫升，并通过轻柔旋转混匀。

然后加入700 µL的10x T4连接酶缓冲液，接着加入60单位的T4 DNA连接酶，并在16 °C下孵育样品过夜。第三天，进行蛋白质消化和逆转交联。向3C样品中加入30 µL浓度为10 mg/mL的蛋白酶K，在65 °C下振荡孵育过夜。

在第四天开始纯化3C文库时，向样品中加入30微升浓度为10毫克/毫升的RNase A，并通过轻柔旋转混匀。孵育后，向样品中加入7毫升苯酚-氯仿，振荡混匀。在室温下以3,270 ×g离心15分钟。

收集水相并转移至一个洁净的50毫升锥形管中。加入等体积的氯仿，通过振荡混合样品。按照演示方法再次离心样品后，将水相转移至另一个洁净的50毫升锥形管中。

加入7.5毫升分子生物学纯度的水、35毫升100%乙醇和7微升浓度为1毫克/毫升的糖原。将充分混匀的样品在-80摄氏度下冷冻。样品冷冻的同时，使用分子生物学纯度的水将对照样品的体积调整至500微升，开始纯化对照样品。

加入 2 µL 浓度为 10 毫克/毫升的 RNase A，并通过轻弹管壁混匀。接着，向含有对照样品的管中加入 1 毫升苯酚-氯仿，通过振荡混匀。离心试管。

将水相转移至洁净的1.5毫升微量离心管后，加入等体积的氯仿。参照之前的方法进行离心，然后收集水相。向收集的水相中加入1毫升乙醇和2微升浓度为1毫克/毫升的糖原。

振荡混匀样品后，在零下80摄氏度孵育30分钟。接着，在4摄氏度、3,270 ×g条件下离心15分钟。弃去上清液后，加入750 µL预冷的70%乙醇，并进行离心。

将风干的沉淀重悬于50微升分子生物学级水中。若不立即进行后续操作，可在此处将悬液冷冻保存。如需继续进行3C样品纯化，从冷冻机中取出样品，并在3,270 G离心30分钟。

加入10毫升预冷的70%乙醇并打散DNA沉淀。离心后去除上清液，在室温下将样品部分风干。用150微升pH 7.5的10毫摩尔Tris-HCl通过反复吹打重悬沉淀，以获得纯化的3C文库。

对一个实验组和两个对照组的3C样品进行qPCR，有助于获得消化效率数据。在检测的七个基因组位点上，3C样品的消化效率约为88%。取染色体构象捕获（3C）样品及其对照样品进行qPCR。

切下与预期片段大小相对应的产物条带。为进行PCR产物的凝胶回收，可使用商业试剂盒，或按照自制方案操作。对于后者，可用针头在0.5毫升离心管底部戳一个小孔，以制备自制纯化柱。

将少量棉花压入带孔的管底，填充量不超过管体积的一半。将该管放入一个1.5毫升的离心管中，确保小管稳放在大管的管口边缘上，而不是落入大管内部。小心地将凝胶片段切成更小的碎片，并放入离心柱的小管中。

将组装好的离心管置于-20摄氏度冰箱中冷冻5分钟，然后在室温下以13,000 G离心3分钟。弃去含有琼脂糖残渣的小管，保留含有提取DNA的缓冲液的1.5毫升离心管。

采用不同基因组位点的位点特异性引物组合与定量PCR（QPCR），检测样品中是否存在长距离染色质相互作用。计算各产物相对于对照引物组的相对丰度，并绘制图表进行比较。数据显示，在10个反应中有8个为条件性阳性。

对8个条件阳性样本和1个阴性反应的预期PCR产物进行凝胶纯化和测序。代表性阳性与阴性反应的结果如下所示。