Name: 获得 3C 的 A:本科生的染色体构象捕获 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学习染色体构象捕获技术以研究染色质组织如何调控基因表达。本方法使用C. elegans样本，通过DpnII酶切和连接反应构建3C文库，为本科生提供实践分子生物学实验的完整流程。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所罗德岛机构发展奖（IDeA）生物医学研究卓越网络（资助号&#160;P20GM103430）以及布赖恩特健康与行为科学中心的支持。

1. 引物设计
注意：3C 引物设计工具可在线获取28。或者，学生也可自行设计定制引物（见下文）。
<ol>
	<li>引物位置的确定
	<ol>
		<li>打开 UCSC 基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu/），选择研究的生物体，并使用 3C 技术评估基因组的目标区域。</li>
		<li>在下一个窗口中，点击浏览器下方的 Mapping and Sequencing 标签页中的 Restr Enzymes，以激活限制性酶切位点轨道。</li>
		<li>输入将要使用的 限制性内切酶，并将 显示模式 设置为 pack，然后点击 Submit。</li>
		<li>在 Variation and Repeats 区域中，确保 RepeatMasker 设置为 dense。</li>
		<li>以限制性酶切位点为参考，识别位于非屏蔽重复区域（黑色条带区域）之外的目标位点。通过点击 position（最上方轨道） 并拖动至所需长度（约 600 bp），高亮标记限制性位点上下游各 300 个碱基对（bp）的区域。</li>
		<li>松开鼠标后，将弹出一个对话框。记录该基因组位置，点击 Zoom in，使浏览器自动调整至所选区域。</li>
		<li>将鼠标悬停于浏览器顶部工具栏的 View 标签上，在下拉菜单中选择 DNA。</li>
		<li>保留默认选项，注意屏蔽序列的表示方式（可选择将其显示为 N's），然后点击 get DNA。</li>
		<li>高亮的序列将在窗口中显示。将该序列复制并粘贴至 Primer3（https://primer3.ut.ee/）。</li>
		<li>使用 Primer3 的默认设置，点击 Pick primers 生成引物。</li>
		<li>在 结果 中，注意限制性内切酶位点的位置，并选择能够扩增出 200–500 bp PCR 产物 且 限制性位点 位于 中间 的引物。</li>
		<li>按照上述步骤，设计距离目标位点 1 千碱基（kb）、2 kb、5 kb、10 kb 和 20 kb 处的测试引物。</li>
		<li>为设计输入对照引物，对距离目标位点 1–2 kB 且不含限制性酶切位点（即始终不被切割）的区域重复上述步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>引物功能验证
	<ol>
		<li>为验证引物的功能性，使用梯度稀释浓度的引物和纯化的基因组 DNA 进行 PCR 反应。通过定量或半定量方法，判断引物是否能够扩增出预期的产物。</li>
		<li>对未能通过验证的引物重新设计。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 第1天
注意：在染色质交联后以及细胞核收集后，可暂停（在 −20 °C 冻存）实验流程。对于本科生而言，这些步骤平均需要 5–6 小时。
<ol>
	<li>青年期（YA）C. elegans 细胞核收集（改编自 Han 等人29）
	<ol>
		<li>染色质交联
		<ol>
			<li>在 50 mL 锥形管中，用 30 mL M9 培养基收集 5,000 条青年期线虫，在室温（RT）下以 400 × g 离心 2 分钟。</li>
			<li>用 M9 培养基再洗涤线虫沉淀 3 次，以去除细菌。</li>
			<li>弃去上清液，将线虫沉淀重悬于含有 2.7 mL 37% 甲醛（终浓度为 2%）的 47.3 mL M9 培养基中，在室温下振荡（摇动或旋转）孵育 30 分钟。 
			警告：操作甲醛时需谨慎，应在通风橱内佩戴适当的个人防护装备（PPE，包括实验服、合适的手套和眼部防护）。甲醛是一种刺激物，可影响眼睛、鼻子、喉咙和肺部。</li>
			<li>在室温下以 400 × g 离心线虫 2 分钟。</li>
			<li>弃去上清液，将线虫沉淀重悬于 50 mL 1 M 甘氨酸溶液中，在室温下以 400 × g 离心 2 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞核收集
		<ol>
			<li>将线虫沉淀重悬于 6 mL 预冷的 NP 缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，40 mM NaCl，90 mM KCl，2 mM EDTA，0.5 mM EGTA，0.1% Tween 20，0.2 mM DTT，0.5 mM 亚精胺，0.25 mM 精胺，1× 完整蛋白酶抑制剂）中。</li>
			<li>将线虫悬液转移至冰上的 7 mL 松口玻璃匀浆器（Dounce）中，匀浆 15 次，冰上静置 5 分钟。</li>
			<li>将线虫悬液转移至冰上的 7 mL 紧口玻璃匀浆器（Dounce）中，匀浆 20 次，冰上静置 5 分钟。</li>
			<li>将线虫悬液转移至洁净的 15 mL 锥形管中，并加入 NP 缓冲液至总体积为 10 mL（约添加 4 mL）。</li>
			<li>在高速下涡旋振荡线虫悬液 30 秒，样品在冰上孵育 5 分钟。</li>
			<li>重复上一步操作。</li>
			<li>在 4 °C 下以 100 × g 离心 5 分钟。</li>
			<li>将上清液转移至新的 15 mL 锥形管中。</li>
			<li>检查样品中是否存在线虫碎片。取 10 µL 样品在光学显微镜下观察。若存在线虫碎片，则在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟，将沉淀重悬于 10 mL 新鲜 NP 缓冲液中，再以 100 × g 在 4 °C 下离心 5 分钟。弃去沉淀，检查上清液中是否仍有线虫碎片，并重复此步骤直至样品中无可见线虫碎片。 
			注：也可通过将样品依次经 40 µm 细胞筛过滤 6 次，再经 20 µm 细胞筛过滤 6 次，以去除线虫碎片。</li>
			<li>若样品中无线虫碎片，取 5 µL 样品，加入 5 µL 甲基绿派洛宁染液（细胞核呈蓝色），使用血细胞计数板计数细胞核数量。</li>
			<li>在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟。</li>
			<li>弃去上清液，将样品置于冰上并继续后续操作；或快速冷冻细胞核，并在 −80 °C 下保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色质消化
	<ol>
		<li>将细胞核重悬于 450 µL 无菌水中，转移至洁净的 1.5 mL 微离心管中。</li>
		<li>向交联样品中加入 60 µL 10× DpnII 限制性内切酶缓冲液，充分混匀。 
		&#8203;注：也可使用其他仍能切割交联 DNA 的限制性内切酶。</li>
		<li>加入 15 µL 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）以通透细胞核，在 37 °C 下振荡孵育 1 小时。 
		&#8203;警告：SDS 具有刺激性，若摄入或经皮肤吸收则有毒。操作时需谨慎，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、合适的手套和眼部防护）。</li>
		<li>通过加入 75 µL 20% Triton X-100 终止 SDS 作用，并在 37 °C 下振荡孵育 1 小时。</li>
		<li>从样品中取出 10 µL 作为未消化对照，4 °C 保存。</li>
		<li>加入 400 U DpnII 酶，在 37 °C 下振荡过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 第2天
注意：本科生平均需要 5 小时完成这些步骤。
<ol>
	<li>染色质消化
	<ol>
		<li>额外加入 200 U 的 DpnII，并在 37 °C 下振荡孵育样品 4 小时，以确保交联样品完全消化。</li>
		<li>从样品中取出 10 µL 作为消化对照。</li>
		<li>将样品在 65 °C 下孵育 20 分钟（或根据制造商说明书）以热灭活限制性内切酶。继续进行步骤 2.1.3。</li>
		<li>如果该酶不能通过加热灭活，则加入 80 µL 的 10% SDS，并在 65 °C 下孵育 30 分钟。然后加入 375 µL 的 20% Triton X-100，轻轻混匀。在 37 °C 下孵育 1 小时，然后继续进行步骤 2.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色质连接
	<ol>
		<li>将样品转移至一个洁净的 50 mL 锥形管中，用分子生物学级 H2O 调整体积至 5.7 mL，并轻轻混匀。</li>
		<li>加入 700 µL 的 10x T4 连接酶缓冲液，并轻轻混匀。</li>
		<li>加入 60 U 的 T4 DNA 连接酶，并轻轻混匀。</li>
		<li>在 16 °C 下过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第3天
注意：本科生平均需要 15-30 分钟完成这些步骤。过夜孵育后，样品可进行冷冻保存。
<ol>
	<li>蛋白质消化与逆转交联
	<ol>
		<li>向3C样品中加入30 µL蛋白酶K（10 mg/mL），在65 °C下振荡孵育过夜。向未消化组和消化对照组中各加入5 µL蛋白酶K（10 mg/mL），在65 °C下振荡孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第4天
注意：本科生平均需要 4-5 小时完成这些步骤。
<ol>
	<li>3C 文库的纯化
	<ol>
		<li>向 3C 样本中加入 30 µL 核糖核酸酶 A（RNase A，10 mg/mL），轻轻涡旋混匀。在 37 °C 下孵育 45 分钟。</li>
		<li>向样本中加入 7 mL 苯酚-氯仿试剂，振荡混匀。 
		警告：苯酚-氯仿对皮肤和眼睛具有刺激性，接触后可能引起灼伤，须立即处理。苯酚-氯仿应在通风橱中操作，并佩戴适当的眼部防护装备和手套（腈类手套）。</li>
		<li>在室温下以 3,270 × g 离心 15 分钟。收集水相，转移至一个新的洁净 50 mL 锥形离心管中。加入等体积的氯仿，振荡混匀。</li>
		<li>在室温下以 3,270 × g 离心 15 分钟。收集水相，转移至一个新的洁净 50 mL 锥形离心管中。加入 7.5 mL 分子级 H2O、35 mL 100% 乙醇，以及（可选）7 µL 甘油（glycogen，1 mg/mL）。振荡混匀后，置于 −80 °C 冻结直至样本完全冻结。 
		注意：样本完全冻结可能需要 1 小时或更长时间。此步骤可暂停。
		<ol>
			<li>在 3C 样本冻结期间，纯化对照样本。用分子级水将对照样本体积调整至 500 µL，并加入 2 µL 核糖核酸酶 A（RNase A，10 mg/mL），轻弹管壁混匀。</li>
			<li>短暂离心，使液体沉至管底。在 37 °C 下孵育 45 分钟。</li>
			<li>向对照样本中加入 1 mL 苯酚-氯仿试剂，振荡混匀。在室温下以 3,270 × g 离心 15 分钟。收集对照样本的水相，转移至洁净的 1.5 mL 微离心管中。</li>
			<li>加入等体积的氯仿，振荡混匀。在室温下以 3,270 × g 离心 15 分钟。收集水相，转移至洁净的 1.5 mL 微离心管中。</li>
			<li>加入 1 mL 100% 乙醇和 2 µL 甘油（glycogen，1 mg/mL）。振荡混匀后，在 −80 °C 下孵育 30 分钟。</li>
			<li>在 4 °C 下以 3,270 × g 离心 15 分钟。弃去上清液，加入 750 µL 预冷的 70% 乙醇。</li>
			<li>在 4 °C 下以 3,270 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将样本在室温下部分风干。用 50 µL 分子级 H2O 重悬沉淀。可选择冻存，或继续进行第 6 步。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 4 °C 下以 3,270 × g 离心 60 分钟。弃去上清液，加入 10 mL 预冷的 70% 乙醇。通过振荡混匀，使 DNA 沉淀充分分散并破碎。</li>
		<li>在 4 °C 下以 3,270 × g 离心 30 分钟。弃去上清液，让样本在室温下部分风干。用移液器反复吹打，将沉淀重悬于 150 µL 的 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中。此即“3C 文库”。 
		&#8203;注意：可将样本冻存，或直接进入后续分析步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第5天
注意：本科生平均需要 1-2 小时完成这些步骤。
<ol>
	<li>使用对照引物的标准曲线评估样本质量
	<ol>
		<li>对 3C 样本及所有对照样本的 DNA 浓度进行定量，并将样本调整至 30 µg/µL（若浓度允许）。将样本连续两倍稀释四次，得到每个样本的五个稀释梯度（1x、0.5x、0.25x、0.125x、0.0625x）。 
		注意：若难以准确进行定量，可按上述方法进行连续稀释，并继续后续操作。</li>
		<li>使用对照引物为每个稀释样本设置 3C、基因组对照和酶切对照的 PCR 反应体系：1 µL DNA、10 µL 5x 反应缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 10 mM 对照引物（正向与反向混合）、1 µL Taq 聚合酶，以及 36 µL 水。</li>
		<li>根据 PCR 仪器专用软件的操作说明，设置标准曲线 PCR 程序，循环条件如下：98 °C 预变性 30 s；进行 30 个循环（98 °C 变性 5 s、60 °C 退火 5 s、72 °C 延伸 10 s）；72 °C 延伸 1 min；4 °C 保存。</li>
		<li>使用软件生成样本的标准曲线。软件生成曲线后，记录 PCR 扩增效率和 R2 值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定 DNA 浓度
	<ol>
		<li>为测定 3C 样本的 DNA 浓度，需将样本与已知浓度的基因组 DNA 样本进行比较。将样本稀释至 30 ng/µL，并将基因组对照从 10 ng/µL 起以两倍梯度逐级稀释至 0.01 ng/µL，以构建标准曲线。 
		注意：若难以准确进行定量，可将样本稀释 1:10 后继续操作。</li>
		<li>使用对照引物为每个稀释样本设置 3C、基因组对照和酶切对照的 PCR 反应体系：1 µL DNA、10 µL 5x 反应缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 10 mM 对照引物（正向与反向混合）、1 µL Taq 聚合酶，以及 36 µL 水。</li>
		<li>根据 PCR 仪器专用软件的操作说明，设置标准曲线 PCR 程序，循环条件如下：98 °C 预变性 30 s；进行 30 个循环（98 °C 变性 5 s、60 °C 退火 5 s、72 °C 延伸 10 s）；72 °C 延伸 1 min；4 °C 保存。</li>
		<li>使用软件生成样本的标准曲线，并将 3C 样本的扩增曲线绘制于该标准曲线上。将 3C 样本的扩增信号位置与已知浓度基因组 DNA 反应生成的标准曲线进行比较，并将 3C 样本调整至 30 ng/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定染色质相互作用的存在与否
	<ol>
		<li>使用 30 ng 的 3C 样本、基因组对照样本和酶切对照样本设置 qPCR 反应：1 µL DNA、10 µL 5x 反应缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 10 mM 引物（正向与反向混合）、1 µL Taq 聚合酶，以及 36 µL 水。 
		注意：应使用对照引物、针对特定基因组位点的检测引物，以及用于检测染色质相互作用的检测引物组合（位点“a”正向与位点“b”反向）进行反应（图 3）。</li>
		<li>根据 PCR 仪器软件的操作说明，设置 PCR 程序如下：98 °C 预变性 30 s；进行 40 个循环（98 °C 变性 5 s、60 °C 退火 5 s、72 °C 延伸 10 s）；72 °C 延伸 1 min；4 °C 保存。</li>
		<li>PCR 完成后，检查扩增曲线。确保 PCR 反应呈现指数扩增，每个循环扩增量翻倍。 
		注意：未呈现指数扩增的反应无法进一步分析。</li>
		<li>根据 PCR 仪器软件的操作说明，设定 qPCR 实验的阈值。</li>
		<li>导出所有样本的 Ct 值。</li>
		<li>利用未酶切对照（UC）和酶切对照（DC）样本的检测引物（TP）与对照引物（CP）的 Ct 值，根据公式（1）计算酶切效率。 
		已酶切百分比 = 100 - <img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/65213/65213eq01.jpg" style="margin: auto;" />&#160; &#160; &#160;（1）</li>
		<li>该值应在 80%–90% 范围内。记录这些数值（图 4A）。</li>
		<li>利用未酶切对照（UC）和 3C（3C）样本的检测引物组合（TPC）与对照引物（CP）的 Ct 值，根据公式（2）计算相对染色质相互作用。 
		染色质相互作用 = 100 - <img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/65213/65213eq02.jpg" style="margin: auto;" />&#160; &#160; &#160;（2）</li>
		<li>将每种检测引物组合下各样本的数值绘制为柱状图。</li>
		<li>将 3C 样本的信号与对照样本进行比较，判断 3C 样本是否在特定染色质相互作用上存在富集。若 3C 样本信号高于对照，则可视为条件阳性，需通过 Sanger 测序进行验证（图 4B）。 
		注意：在分析图表数据时，需注意除非使用“对照模板”（见讨论部分），否则不同反应之间（即不同引物组合之间）的信号丰度不可比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3C 产物的鉴定
	<ol>
		<li>将 PCR 产物在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳。</li>
		<li>使用紫外灯箱或凝胶成像系统观察凝胶，确认 PCR 产物大小是否正确。 
		注意：构建良好的 3C 文库包含多种 DNA 片段，尽管引物已验证特异性，3C 文库的 PCR 反应仍可能出现多条条带（图 5A）。这并不影响 3C 文库的分析。</li>
		<li>切下对应预期片段大小的条带，并按照商业试剂盒说明或以下自制方案进行凝胶回收。 
		注意：紫外线具有已知致癌性，应尽量减少暴露时间。操作时应佩戴防紫外线护目镜、样品防护罩、手套和实验服。
		<ol>
			<li>使用针头在 0.5 mL 离心管底部打孔，以制备自制纯化柱。</li>
			<li>取少量棉球中的棉花填充至 0.5 mL 管底部，填充量不超过管体积的一半。</li>
			<li>将 0.5 mL 管放入 1.5 mL 管中，确保小管置于大管管口边缘，而非插入大管内部。</li>
			<li>小心将凝胶片段切成小块，并放入纯化柱的 0.5 mL 管中。</li>
			<li>将组装好的装置置于 −20 °C 冰箱中冷冻 5 min，然后在室温下以 13,000 × g 离心 3 min。</li>
			<li>保留含有缓冲液中提取 DNA 的 1.5 mL 管，丢弃含有琼脂糖残渣的 0.5 mL 管。</li>
			<li>纯化后的 DNA 可使用 3C 片段的正向和反向引物进行 Sanger 测序。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 Blat 鉴定染色质互作位点
		<ol>
			<li>测序完成后，根据测序报告判断样本是否符合质量控制标准。</li>
			<li>对于通过质控的序列，使用 Another Plasmid Editor (ApE) 等测序编辑软件打开 .seq 和 .ab1（迹线）文件，检查 .ab1 文件中碱基识别峰是否清晰，并修正 .seq 文件中误判的峰。</li>
			<li>基于编辑后的 .seq 文件，搜索 DpnII 位点。根据测序结果，该位点应位于序列中间位置。</li>
			<li>为确认序列是否为目标序列，选中 DpnII 位点及其上游 30–50 bp 的序列（对应于 3C 检测的基因组位点的正向引物序列），将该序列在目标物种基因组中进行 Blat 比对。确保比对到的基因组位点与引物设计位点一致。</li>
			<li>对反向引物序列重复上述步骤，确保比对到的基因组位点与反向引物设计位点一致。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Chromosome Conformation Capture (3C) for Undergraduate Research and Teaching

<ol><li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92(2014).</li>
<li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li>
<li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li>
<li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li>
<li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039(2008).</li>
<li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li>
<li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

染色质构象捕获技术（3C）是一种建立在基础分子生物学技术之上的强大方法。正是这些基本工具的结合，使得3C技术成为本科生科研中极具吸引力的选择。近年来大量研究从广泛尺度上观察了染色质动态变化，利用这些成果设计针对单个基因或基因组区域的精细实验，有望在本科生科研中产生独特而具有影响力的研究项目。这类实验常被认为对本科生而言过于复杂，但通过周密规划，完全可以实现。需要注意的是，用于检测3C文库所捕获染色质连接的检测方法多种多样，可从半定量终点PCR到全基因组测序不等。事实上，首篇3C研究论文16中的数据即来源于qPCR。之所以存在如此广泛的检测手段，是因为所有3C技术均产生相同的产物——一个代表细胞核内三维空间连接关系的DNA片段文库。
本文介绍了一种更为灵活且适应性强的实验方案改良版本，更适合本科生研究人员使用。上述列出的暂停步骤通常意味着过夜暂停；然而，这些暂停也可以延长至周末，甚至在细胞和细胞核的情况下可延长至数周。最关键的考虑因素是实验工作的时间安排。通常在实验方案中会存在一些对时间敏感的步骤，这些步骤无法暂停。但除了少数几个时间点（第1天和第2天）外，本方案在多个环节均可暂停并冷冻样品。这一点在指导本科生开展实验时尤为关键，因为本科生的实验安排往往需要具备较高的灵活性。除了在方案中设计了这些可暂停的节点外，还鼓励本科生以两人一组，甚至三至四人小组的形式开展工作。小组合作模式非常适合本实验方案，学生之间可以相互支持，建立互助机制，确保每个人都能安全地进行实验。此外，多人协作也会使实验过程更加有趣。通过小组合作，学生还可以围绕染色质结构这一主题，探索多种不同的科学问题，同时仍采用相同的实验流程。因此，即使学生各自开展独立的研究项目，实验方案仍能将他们的工作联系在一起，从而实现相互支持与协作。
其他改进旨在解决某些专用工具和设备并非所有本科院校都具备的问题。这些设备包括但不限于qPCR扩增仪、凝胶成像系统和微量分光光度计。事实上，这些设备虽然使用方便，但并非必需。本文还介绍了经典3C方法在引物设计部分的应用：即首先确定一个感兴趣的基因组位点，然后基于该位点进一步评估其他较远距离的基因组位点是否存在染色质相互作用。如果使用已发表的数据集（例如Hi-C数据集），该技术同样适用，因为在这些数据集中已知存在阳性（相互连接）和阴性（无连接）的基因组位点。利用这些已发表的数据集设计实验是教学实验室的另一种良好改进方式，因为成功鉴定染色质相互作用的可能性通常更高。此外，相关研究论文可在课堂上进行讨论，并作为参考文献使用。
本方案采用改进的qPCR方法来检测3C产物的形成。对照对于3C技术的成功至关重要。每次实验均需设置样本对照和引物对照，以评估3C实验步骤是否完成。样本对照包括未消化对照（基因组DNA）和消化对照。未消化对照用于确定引物组的基线信号，并与交联后消化对照结合使用，以评估消化效率。对于跨越限制性酶切位点的任何引物，其扩增产物均预期出现下降。将该值与未消化对照进行比较，可反映样本消化的充分程度。
PCR所用的引物包括对照引物和检测引物。对照引物是一组位于待检测基因组区域附近、且不包含限制性酶切位点的引物，用于确定检测引物PCR产物丰度的基线水平。检测引物则是一对分别位于特定基因组位点两侧、跨越一个限制性酶切位点的正向与反向引物（图3）。通过比较使用这些引物组合的反应结果，可评估酶切效率：若限制性位点被成功切割，则PCR产物的丰度应有所下降。在分析染色质空间结构时，将来自一个基因组位点的检测引物与另一个不同基因组位点的检测引物配对使用，以判断这两个位点在三维空间中是否邻近。在此情况下，预期仅以3C样品作为模板时才能扩增出PCR产物。
需要注意的是，即使是经过验证的引物也有可能失败（图4：r14 引物组）。此外，在对照反应以及未预期存在染色质连接的反应中（例如消化对照，因其未进行连接），也常常会检测到 PCR 产物。这些产物经测序后，通常无法通过 Sanger 质控，或测序结果无明确序列（图5）。另外，传统的 3C 实验会生成一种&#34;对照模板&#34;，即未经交联、但经过消化和连接的 DNA 样品，用于代表在给定量的 DNA 中可能生成的所有连接片段。该&#34;对照模板&#34;在比较两个基因组位点之间的 qPCR 信号强度时起着重要作用，可用于判断信号代表的是真实相互作用还是随机关联。然而，构建&#34;对照模板&#34;可能存在困难，因为需要将大量待检测的染色质以人工染色体的形式捕获，并与 3C 样品一同处理。获取此类构建体可能不可行，且其制备可能超出一个学期项目的研究范围。鉴于这些困难，我们建议使用对照引物。该对照引物虽不能完全替代&#34;对照模板&#34;的全部功能，但仍可为数据分析提供依据，用于判断相互作用的&#34;存在&#34;或&#34;不存在&#34;。
进行qPCR时，使用等量的样品非常重要。即使使用NanoDrop等纳米分光光度计，也应通过已知浓度的基因组DNA生成标准曲线，并将3C样品的扩增结果拟合至该曲线上，以确定样品用量。这些用量应被记录下来，并用于后续的PCR反应中。PCR反应的质量同样关键。在qPCR运行过程中，通过荧光信号实时检测产物丰度并进行记录，该记录可在扩增曲线图中查看。程序运行结束后，必须检查扩增曲线图，确保所有反应（除无模板对照外）均呈现三个阶段：基线期、指数扩增期和平台期（饱和期）。尤其在设定阈值时（见下文），必须确认反应存在明显的指数扩增阶段。此外，对于系列稀释的样品，其Ct值应随样品稀释程度呈规律性偏移（浓度最高者Ct值最低，浓度最低者Ct值最高）。若样品在扩增曲线图中未表现出此种规律性变化，则需重新稀释，或提示3C样品制备过程中存在更严重的问题。最后，在生成标准曲线时，PCR软件会自动计算PCR扩增效率和R2值。PCR扩增效率应高于90%，R2值应大于0.99。若任一指标未达标，则可能表明样品或PCR引物存在问题。
qPCR 实验完成后，可通过每个反应的 qPCR Ct 值计算消化百分比以及 3C 相互作用的存在情况。为此，首先必须设定 PCR 反应的阈值，通常使用 qPCR 仪器配套的软件完成。设定阈值后，将确定用于比较各样本 Ct 值的 PCR 产物浓度。阈值应穿过 PCR 反应扩增曲线的指数扩增阶段。只有处于指数扩增阶段的 PCR 反应（在此情况下为对照引物和检测引物反应）才能进行比较，因为只有这样才能确保各反应以相同的速率扩增 DNA，从而实现可靠比较。在分析 3C 图谱时，条件性阳性反应被定义为相对于对照样本、基因组对照以及消化对照产生更多产物的反应（图 4B）。然而，这些样本还需在 PCR 产物经凝胶纯化后，通过 Sanger 测序进一步验证。
Sanger 测序完成后，通过质控的样本可使用 Blat 进行分析。该分析的目的是确定样本是否含有位于限制性酶切位点（本实验方案中为 DpnII）两侧的两个目标基因组位点的序列。如果检测到这两个序列，则可认为 3C 片段已得到验证。如果 Blat 分析结果未返回预期序列，可能表明一个或两个引物并非最优，从而导致 qPCR 出现假阳性结果。假阳性样本的测序迹线文件会出现未定义的碱基峰，且序列报告中将主要包含&#34;n&#34;碱基识别结果。
Sanger 验证至关重要，因为可能产生由人为假象 PCR 产物形成导致的假阳性结果。当测序产物不包含预期的目标序列或缺乏典型的 DpnII 位点（正确 3C 片段的特征）时，即可识别这些假阳性（图 5）。对 PCR 片段进行测序还能为实验提供另一个数据支持点，并使学生深刻理解 3C 技术能够识别在细胞核三维空间中相互靠近的远端基因组位点。
3C 技术为本科生提供了一套丰富且基础的分子生物学实验方法，其操作流程灵活而简便。该 3C 技术也是其他结合了下一代测序（NGS）技术的 3C 衍生技术的起点。此类实验可使本科生接触到生物信息学的重要内容，并建立在本文所述基本原理的基础之上。本科生的实践经验与积极参与对其成长为青年科学家至关重要。通过提供这些机会，本科生能够在加深对基本原理理解的同时，增强自信心，以应对前沿技术与科学问题的挑战。

生物体的基因组不仅包含发挥功能所需的所有基因，还包含如何以及何时使用这些基因的全部指令。这使得调控对基因组的可及性成为细胞最重要的功能之一。尽管存在多种控制基因功能的机制，但从基本层面来看，基因调控归结为调控性转录因子（转-因子）结合到其特异的DNA序列（顺式-调控序列）。这种能力并非与生俱来，而是由细胞核内基因组的组织/结构所调控，后者控制着这些序列的可及性/暴露程度 顺式-调控序列到 转-因素1,2,3。如果 转-因子无法找到其 顺式-调控序列，然后 转因子无法执行其调控功能。这使得理解基因组在细胞核中的组织方式成为重要的研究课题。
普遍认为，在间期，真核生物细胞核内的染色体占据各自独立的区域，并锚定于核纤层和核基质上图1），从而使染色体更像一块披萨片，而不是盘中的一根意大利面条。染色体通过蛋白质-DNA相互作用（染色质）实现部分压缩，这些相互作用使染色体的某些区域发生扭曲和成环。通过电子显微镜和三维DNA荧光技术 原位 杂交（FISH）以及DNA标记技术（如荧光标记和人工DNA甲基化）发现，染色质的非活性区域紧密聚集在细胞核边缘4,5,6而活跃的、松散程度较高的染色质区域则位于细胞核内部7,8,9,10这些实验能够提供染色体动态的全景视角，但在捕捉DNase中观察到的基因启动子区域附近的局部变化方面作用有限。11,12 和核小体13,14,15 研究。
揭示更高分辨率染色质动态的关键在于三维染色体作图技术（3C）的建立。3C技术本身包含四个主要步骤：染色质交联、限制性内切酶消化染色质、染色质连接以及DNA纯化（图2）。通过该过程生成的新型人工DNA片段可被进一步表征，以揭示线性距离较远的DNA片段之间的紧密物理关联16。3C技术成为多种衍生技术的基础，这些技术利用3C的初始步骤来回答更广泛的全基因组问题（例如Hi-C、4C、ChIP-C）。这一系列3C技术已发现染色体被组织成多个离散的单元，称为拓扑关联结构域（TADs）。TADs由基因组编码，其特征是由未形成环的边界所夹持的染色质环结构16,17,18,19。TAD边界由两个在进化上保守且普遍存在的因子维持，即CCCT结合因子（CTCF）和黏连蛋白（cohesion），它们阻止不同TAD内的环状结构相互作用16,20。这些染色质环的形成依赖于反式作用因子与其调控序列之间的相互作用，以及CTCF和黏连蛋白的参与21。
尽管许多使用3C技术的研究提出的是全基因组范围的广泛问题，并采用复杂的样品采集技术，但3C技术的基本原理建立在基础分子生物学技术之上。这使得3C技术在本科科研和教学实验中具有很高的应用价值。3C技术可用于回答范围较小、目标明确的问题，并且本质上具有良好的可扩展性（可应用于单个基因22、染色体16和/或全基因组18），具体取决于研究问题的焦点和方向。该技术已被广泛应用于多种模式系统7,16,19,23，并被证实具有高度的灵活性和适用性。因此，3C技术非常适合本科生学习：学生在掌握常用分子生物学技术的同时，还能获得针对特定科学问题开展研究的宝贵经验。
本文提供了一种基于先前已发表方案24,25,26,27的3C文库构建的改进方案。该方案已针对约1 × 107个细胞进行优化，但即使使用低至1 × 105个细胞也能成功构建3C文库。该方案具有良好的通用性，已成功用于从斑马鱼胚胎、斑马鱼细胞系以及年轻成虫期（YA）秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中制备3C文库。本方案同样适用于哺乳动物细胞系，经进一步调整后也可用于酵母。
这些改进的目的是使3C技术更易于本科生掌握。在设计过程中，特别注意采用与本科生教学实验室中可实现的技术相类似的方法。3C技术为本科生提供了丰富的学习机会，有助于他们掌握基本的分子生物学技术，从而在实验操作、课堂教学以及毕业后的科研或职业发展中受益。

<table><tbody><tr><td>37% 甲醛&amp;nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Millapore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>MP Biomedical</td><td>215350280</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Millapore-Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合液</td><td>Millapore-Sigma</td><td>COEDTAF-RO</td><td>用蒸馏水配制成50倍浓缩液，使用前在蔗糖缓冲液和GB缓冲液中稀释至1倍浓度</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Millapore-Sigma</td><td>D0632</td><td>1 M 储存液使用前在蔗糖缓冲液和GB缓冲液中新鲜稀释至500 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>NEB</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Millapore-Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millapore-Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>甲基绿派洛宁&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>HT70116</td><td></td></tr><tr><td>MgAc&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Thermoscientific</td><td>1222530</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>苯酚-氯仿&amp;nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Millapore-Sigma</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05406</td><td></td></tr><tr><td>qPCR预混液（Phire Taq等）</td><td>Millapore-Sigma</td><td>KCQS07</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&amp;nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Millapore-Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>Promega</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>108319</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

通过3c获得a：面向本科生的染色体构象捕获技术

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

染色体构象捕获（3C）是一种强大的工具，衍生出一系列类似的技术（例如 Hi-C、4C 和 5C，本文统称为 3C 技术），可提供染色质三维结构的详细信息。3C 技术已被广泛应用于多种研究中，从监测癌细胞中染色质结构的变化，到鉴定增强子与基因启动子之间的相互作用。尽管许多使用这些技术的研究着眼于复杂的样本类型（即单细胞分析）并提出全基因组范围的重大科学问题，但人们常常忽略的是，3C 技术建立在基础分子生物学方法之上，适用于多种类型的研究。通过聚焦于染色质结构的特定科学问题，这一前沿技术可用于提升本科生科研与教学实验课程的体验。本文介绍了一种 3C 实验方案，并针对以本科生为主的教育机构，在本科生科研与教学实践中实施该技术提供了相应的调整建议与重点说明。

该实验流程将产生一个实验用3C样本和两个对照样本（未消化和已消化）。利用这三个样本进行qPCR检测。根据这些结果，计算（公式1）并记录消化效率（表1）。通过上述计算可知，在检测的七个基因组位点上，3C样本的平均消化效率约为88%（表1的平均值）。
接下来，使用不同基因组位点特异性引物组合（表2）和qPCR检测样品中是否存在长距离染色质相互作用。根据这些结果，计算了相对于对照引物组的产物丰度（公式2），并绘制图表进行比较（图4）。这些数据表明，在10个反应中有8个为长距离相互作用的条件性阳性结果。
随后将PCR反应产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。针对八个条件阳性样本和一个阴性反应样本，预期的PCR产物经凝胶纯化后送交进行Sanger测序。代表性阳性反应（蓝色箭头，蓝色框）和阴性反应（红色箭头，红色框）的结果如图所示（图5）。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg" /> 
图1：细胞核中的染色体结构。 细胞核内染色体的假想排列方式。（A）核膜，黑色线条；（B）核纤层，橙色；（C）异染色质，致密线条；（D）常染色质，松散环状结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg" /> 
图2：3C 实验流程示意图。 线性染色体的不同远端区域（蓝色、黄色和粉色）通过调控环在细胞核内被拉近。(A) 环状结构由转录因子（灰色圆圈和黑色星号）介导；这些相互作用通过化学交联得以固定。(B) 通过酶切消化（黑色线条）打断环状结构。(C) 消化产生的黏性末端使远端的染色质片段连接在一起。(D) 从蛋白质中纯化出 DNA。(E) 对片段内的序列进行鉴定并回贴至基因组。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg" /> 
图3：3C引物设计示意图。 3C引物围绕目标基因组位置不同距离处的限制性酶切位点进行设计。粉红色箭头表示围绕DpnII位点的实验引物组合。这些实验引物可混合搭配使用，以评估该区域的染色质成环情况。橙色引物代表不含DpnII位点的阴性对照。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg" /> 
图4：3C实验的代表性qPCR数据。 3C检测引物组的相对丰度。（A）对照图，显示未消化对照（蓝色）、消化对照（灰色）和3C样品（橙色）中产物的相对丰度。（B）3C实验结果；未消化对照（蓝色）、消化对照（灰色）和3C样品（橙色）中各检测引物组合扩增产物的相对丰度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg" /> 
图5：3C qPCR 产物的可视化。 上图：显示了各样品qPCR终点产物的凝胶电泳结果。下图：所示反应的代表性Sanger测序峰图文件。橙色样本为假阳性示例（参见图4，r38/34），蓝色样本为真阳性示例，测序峰图上方标注了DpnII位点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>位点</td>
			<td>消化率（%）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：计算的消化效率。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td colspan="3">序列</td>
			<td>基因组位点</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r38 RVS</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照引物 FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照引物 RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：代表性3C实验所用引物。

本文详细介绍了染色体构象捕获（3C）技术的一种改进方法，重点强调本科生的参与和学习过程。

通过3C获得A：面向本科生的染色体构象捕获技术

染色体构象捕获（3C）是一种强大的工具，已衍生出一系列类似的技术（例如 Hi-C、4C 和 5C，本文统称为 3C……）

我们的研究旨在揭示染色质结构如何调控基因表达。重点在于确定在基因水平上调控染色质以控制基因活性的各种因素。目前，该领域主要采用类似于染色体构象捕获（chromosome conformation capture）或 3C 的技术来推动研究进展。样本采集和测序技术的进步推动了我们对 3C 技术所能揭示内容的认知。目前最大的实验挑战是获取具有均一染色质结构的样本。样本的异质性会导致结果混淆。未来，我们将重点关注染色质结构的改变在癌症中所起的作用。在第一天，对5,000条年轻成年秀丽隐杆线虫进行染色质交联并收集细胞核后，将重悬于450微升纯水中的细胞核沉淀转移至一个洁净的1.5毫升微量离心管中。然后加入60微升10倍DpnII限制性内切酶缓冲液，并充分混匀。将样品与15微升10%十二烷基硫酸钠在37摄氏度下振荡孵育1小时。加入75微升20%Triton X-100终止反应，并按先前所示条件进行孵育。从样品中取出10微升作为未消化对照，分装后于4摄氏度保存。向剩余样品中加入 400 单位 DpnII 后，在 37 摄氏度下振荡孵育过夜，以进行染色质消化。第二天，向样品中额外加入 200 单位 DpnII。为完成交联样品的消化，将其在 37 摄氏度下振荡孵育 4 小时。将样品在 65 摄氏度孵育 20 分钟，以热灭活限制性内切酶。若该酶无法通过加热灭活，则加入 80 微升 10% 十二烷基硫酸钠并孵育。然后向样品中加入 375 微升 20% Triton X-100，并通过轻轻旋转混匀。从样品中留出10微升等分试样作为消化对照。进行染色质连接时，将样品转移至洁净的50毫升锥形管中。用分子生物学级水将样品体积调至5.7毫升，并通过轻柔旋转混匀。然后加入700 µL的10x T4连接酶缓冲液，接着加入60单位的T4 DNA连接酶，并在16 °C下孵育样品过夜。第三天，进行蛋白质消化和逆转交联。向3C样品中加入30 µL浓度为10 mg/mL的蛋白酶K，在65 °C下振荡孵育过夜。在第四天开始纯化3C文库时，向样品中加入30微升浓度为10毫克/毫升的RNase A，并通过轻柔旋转混匀。孵育后，向样品中加入7毫升苯酚-氯仿，振荡混匀。在室温下以3,270 ×g离心15分钟。收集水相并转移至一个洁净的50毫升锥形管中。加入等体积的氯仿，通过振荡混合样品。按照演示方法再次离心样品后，将水相转移至另一个洁净的50毫升锥形管中。加入7.5毫升分子生物学纯度的水、35毫升100%乙醇和7微升浓度为1毫克/毫升的糖原。将充分混匀的样品在-80摄氏度下冷冻。样品冷冻的同时，使用分子生物学纯度的水将对照样品的体积调整至500微升，开始纯化对照样品。加入 2 µL 浓度为 10 毫克/毫升的 RNase A，并通过轻弹管壁混匀。接着，向含有对照样品的管中加入 1 毫升苯酚-氯仿，通过振荡混匀。离心试管。将水相转移至洁净的1.5毫升微量离心管后，加入等体积的氯仿。参照之前的方法进行离心，然后收集水相。向收集的水相中加入1毫升乙醇和2微升浓度为1毫克/毫升的糖原。振荡混匀样品后，在零下80摄氏度孵育30分钟。接着，在4摄氏度、3,270 ×g条件下离心15分钟。弃去上清液后，加入750 µL预冷的70%乙醇，并进行离心。将风干的沉淀重悬于50微升分子生物学级水中。若不立即进行后续操作，可在此处将悬液冷冻保存。如需继续进行3C样品纯化，从冷冻机中取出样品，并在3,270 G离心30分钟。加入10毫升预冷的70%乙醇并打散DNA沉淀。离心后去除上清液，在室温下将样品部分风干。用150微升pH 7.5的10毫摩尔Tris-HCl通过反复吹打重悬沉淀，以获得纯化的3C文库。对一个实验组和两个对照组的3C样品进行qPCR，有助于获得消化效率数据。在检测的七个基因组位点上，3C样品的消化效率约为88%。取染色体构象捕获（3C）样品及其对照样品进行qPCR。切下与预期片段大小相对应的产物条带。为进行PCR产物的凝胶回收，可使用商业试剂盒，或按照自制方案操作。对于后者，可用针头在0.5毫升离心管底部戳一个小孔，以制备自制纯化柱。将少量棉花压入带孔的管底，填充量不超过管体积的一半。将该管放入一个1.5毫升的离心管中，确保小管稳放在大管的管口边缘上，而不是落入大管内部。小心地将凝胶片段切成更小的碎片，并放入离心柱的小管中。将组装好的离心管置于-20摄氏度冰箱中冷冻5分钟，然后在室温下以13,000 G离心3分钟。弃去含有琼脂糖残渣的小管，保留含有提取DNA的缓冲液的1.5毫升离心管。采用不同基因组位点的位点特异性引物组合与定量PCR（QPCR），检测样品中是否存在长距离染色质相互作用。计算各产物相对于对照引物组的相对丰度，并绘制图表进行比较。数据显示，在10个反应中有8个为条件性阳性。对8个条件阳性样本和1个阴性反应的预期PCR产物进行凝胶纯化和测序。代表性阳性与阴性反应的结果如下所示。

getting-an-with-3cs-chromosome-conformation-capture-for

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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构建无基因克隆的基因中断型Streptococcus mutans菌株

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通过3C获得A：面向本科生的染色体构象捕获技术

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