Name: 小鼠肠隐窝和单个干细胞的类器官的3D培养用于类器官研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学习小鼠小肠隐窝分离与三维类器官培养技术，结合EDTA处理和机械解离方法提高隐窝产量。该技术为研究肠道干细胞稳态维持机制及上皮细胞增殖分化提供了可靠的实验模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究得到了T.T.（资助号JP17K07495和JP20K06751）的科学研究费补助金（C）的支持。我们感谢研头峰子教授提供用于长期延时成像的设备（LCV100；Olympus）。

所有小鼠实验均经三得利动物伦理委员会批准（批准号：APRV000561），所有动物的饲养和使用均遵循该委员会关于实验动物护理和使用的指南。实验采用标准的野生型Mus musculus品系（C57BL6/J）。使用年龄在10至20周之间的雄性和雌性小鼠。小鼠通过CO2窒息法实施安乐死。
1. 小肠的分离
<ol>
	<li>使用手术剪切除小肠，包括十二指肠和空肠近端的一半。</li>
	<li>将组织转移至培养皿中，并用5 mL注射器吸取5 mL冰冷的含抗生素PBS缓冲液（PBS + 青霉素-链霉素[1%] + 庆大霉素[0.5%]）冲洗小肠，以清除管腔内容物。</li>
	<li>沿长轴方向用手术剪将组织剪开，并在振荡条件下用冰冷的含抗生素PBS缓冲液手动清洗。 
	注意：通过载玻片刮除绒毛可减少绒毛污染12。</li>
	<li>使用手术剪取约5 mm × 5 mm大小的小肠节段组织块。用镊子将组织碎片转移至50 mL离心管中，并加入25 mL冰冷的含抗生素PBS缓冲液。</li>
	<li>在50 mL离心管中，用25 mL冰冷的含抗生素PBS缓冲液来回振荡10次，洗涤组织碎片以去除肠道内容物。</li>
</ol>
2. 隐窝分离
<ol>
	<li>将组织块置于含 2 mM EDTA 的 PBS-ABx 中，冰上孵育 30 分钟，期间不进行震荡。</li>
	<li>为便于细胞外基质（ECM）凝固，提前将 24 孔板放入 37 °C 组织培养孵箱中预热。</li>
	<li>用真空泵吸除细胞培养体系中的 EDTA 溶液，加入 25 mL 新鲜且预冷的 PBS-ABx，然后用手剧烈上下震荡 30–40 次，以释放隐窝-绒毛复合体。 
	注意：可通过显微镜在 4 倍放大下观察 25 µL 悬液液滴，检查分离出的隐窝和绒毛。</li>
	<li>随后，将悬液通过 70 µm 细胞筛过滤一次。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 390 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>用移液器将隐窝沉淀重悬于 20 mL 山梨醇 DMEM（高级 DMEM/F12 + 青霉素-链霉素 [1%] + 庆大霉素 [0.5%] + 胎牛血清 [1%] + 山梨醇 [2%]）中，然后将隐窝悬液转移至两个新的 15 mL 离心管中，分为两份 10 mL 溶液，进行低速离心。 
	注意：可通过低速离心分离大细胞团块与细胞/碎片；大细胞团块位于沉淀中，细胞/碎片则位于上清液中。</li>
	<li>将两份隐窝悬液在 4 °C 条件下以 80 × g 离心 3 分钟，然后轻轻吸除上清液。 
	注意：由于沉淀形成较弱，吸液时不可过度，每管保留 2 mL 上清液。</li>
	<li>再次向每管中加入 10 mL 山梨醇 DMEM，在 4 °C 条件下以 80 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>吸除上清液后，每管保留 2 mL 上清液，再加入 10 mL 山梨醇 DMEM 重悬沉淀，最后在 4 °C 条件下以 80 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>吸除上清液后，每管保留 2 mL 上清液，加入 10 mL 完全 DMEM（高级 DMEM/F12 + 青霉素-链霉素 [1%] + 庆大霉素 [0.5%] + 胎牛血清 [1%]），通过上下吹打重悬沉淀，并静置 1 分钟。 
	注意：静置 1 分钟有助于高效获得漂浮的隐窝。</li>
	<li>1 分钟后，分别收集每管 10 mL 悬液，共 20 mL，用 70 µm 细胞筛过滤一次，以纯化隐窝。</li>
	<li>在接种基本纯净的隐窝前，计数过滤后完全 DMEM 中的隐窝数量，然后在 4 °C 条件下以 290 × g 离心 3 分钟。
	<ol>
		<li>在 6 cm 培养皿中三个不同位置各滴加 25 µL 液滴，在显微镜下以 4 倍放大观察并计数隐窝数量，计算每 25 µL 液滴中的隐窝浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每孔用 40 µL ECM 悬浮 100 个隐窝，上下吹打 5–10 次，使隐窝在 ECM 中形成均匀悬液，随后接种于已预热至 37 °C 的 24 孔板中。 
	注意：始终将 ECM 置于冰上以防止聚合；移液时需小心，避免在 ECM 中产生气泡。</li>
	<li>将 24 孔板置于 37 °C、5% CO2 孵箱中孵育 15 分钟，使 ECM 完成聚合。</li>
	<li>最后，在 ECM 上覆盖 500 µL 含小鼠表皮生长因子（EGF）、重组小鼠 R-spondin 1 和重组小鼠 Noggin 的培养基（室温），每孔终浓度如下：青霉素-链霉素（1%），50 U/mL；庆大霉素（0.5%），25 µg/mL；EGF，20 ng/mL；Noggin，100 ng/mL；R-spondin 1，500 ng/mL；L-谷氨酰胺，2 mM。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 孵箱中开始隐窝培养。 
	注意：有关 24 孔板类器官培养基的配制，请参见 表 1。</li>
	<li>使用配备 20 倍物镜的延时成像显微镜，每 3 小时进行一次长时间活细胞成像，持续最多 7 天，获取 z 轴堆栈图像，z 轴步进为 1 µm（1 µm × 五步）。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 荧光激活细胞分选（FACS）
<ol>
	<li>从小鼠中分离隐窝（参见第2节）。</li>
	<li>用2 mL胰蛋白酶在37 °C下处理分离的隐窝30分钟。</li>
	<li>用10 mL PBS终止反应，然后通过20 µm细胞滤筛过滤。</li>
	<li>将溶液在 390 × g 4 °C下孵育3分钟，用100 µL完全DMEM重悬。</li>
	<li>加入抗 EphB2 APC 偶联抗体（1/50），冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞 3 次，最后加入 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）（1/100）。</li>
	<li>分选染色后的细胞 通过 FACS
	<ol>
		<li>调整面积缩放因子，并根据细胞大小（前向散射，FSC-A）与颗粒度（侧向散射，SSC-A）进行分选。</li>
		<li>使用波长为488 nm、功率为50 mV的激光，根据7-AAD阴性和阳性细胞分选活细胞。</li>
		<li>划定分选门以分选EphB2高表达（EphB2-high）细胞高），EphB2-中等（EphB2医学），EphB2低表达（EphB2-low）低）以及EphB2阴性（EphB2阴性) 细胞，激光设置为波长640 nm，功率100 mV。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动 EphB2高 37 °C、5% CO₂ 条件下的细胞培养2 培养箱</li>
</ol>
4. 单细胞培养类器官
<ol>
	<li>根据EphB2表面水平梯度进行细胞分离方法11，然后获得四个不同的细胞群（高表达、中表达、低表达和阴性）。</li>
	<li>收集细胞，在4 °C条件下以390 × g 离心3分钟形成沉淀，通过移液将单个分选的EphB2high细胞悬浮于细胞外基质（ECM）中，随后接种至24孔板（每孔100个单细胞/40 µL ECM）。</li>
	<li>同步骤2.14，使ECM发生聚合，并在ECM上覆盖含有Rho相关激酶（ROCK）抑制剂（10 µM）的培养基，前2天使用以维持EphB2high细胞的存活。 
	注意：ROCK抑制剂可有效防止失巢凋亡（anoikis）。</li>
	<li>使用倒置显微镜在40倍放大倍数下人工检查细胞，观察具有球形结构和隐窝样突起的存活类器官。</li>
</ol>

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

<ol><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Seidlitz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gastric+cancer+modelling+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human gastric cancer modelling using organoids.</a> Gut. 68 (2), 207-217 (2019).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li>
<li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+and+application+of+3D-organoid+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27, R99-R107 (2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li>
<li>Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+versus+enzymatic+isolation+of+stromal+vascular+fraction+cells+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Springerplus%22%5BJournal%5D)">Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue.</a> Springerplus. 4 (1), 713(2015).</li>
<li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+and+perspectives+in+the+function+of+non-neuronal+acetylcholine+in+crypt-villus+organoids+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New trends and perspectives in the function of non-neuronal acetylcholine in crypt-villus organoids in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 145-155 (2019).</li>
<li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-catenin+and+TCF+mediate+cell+positioning+in+the+intestinal+epithelium+by+controlling+the+expression+of+EphB%2FephrinB%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">β-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB.</a> Cell. 111 (2), 251-263 (2002).</li>
<li>Baghdadi, M. B., Kim, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mouse+intestinal+organoid+culture+with+conditioned+media+isolated+from+mucosal+enteric+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of mouse intestinal organoid culture with conditioned media isolated from mucosal enteric glial cells.</a> STAR Protocols. 3 (2), 101351(2022).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+acetylcholine+as+an+endogenous+regulator+of+proliferation+and+differentiation+of+Lgr5-positive+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal acetylcholine as an endogenous regulator of proliferation and differentiation of Lgr5-positive stem cells in mice.</a> FEBS Journal. 281 (20), 4672-4690 (2014).</li>
<li>Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+intestinal+stem+cells%3A+Critical+drivers+of+epithelial+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).</li>
<li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li>
<li>Miyoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+potentiates+TGF-%CE%B2+signaling+to+promote+colonic+crypt+regeneration+after+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wnt5a potentiates TGF-β signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury.</a> Science. 338 (6103), 108-113 (2012).</li>
<li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22NatureMedicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> NatureMedicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li>
<li>Merlos-Suárez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+signature+identifies+colorectal+cancer+stem+cells+and+predicts+disease+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).</li>
<li>Mao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB2+as+a+therapeutic+antibody+drug+target+for+the+treatment+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">EphB2 as a therapeutic antibody drug target for the treatment of colorectal cancer.</a> Cancer Research. 64 (3), 781-788 (2004).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+receptor+M3+contributes+to+intestinal+stem+cell+maintenance+via+EphB%2Fephrin-B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Muscarinic receptor M3 contributes to intestinal stem cell maintenance via EphB/ephrin-B signaling.</a> Life Science Alliance. 4 (9), e202000962(2021).</li>
<li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+colon+stem+cells+using+surface+expression+of+PTK7%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of human colon stem cells using surface expression of PTK7.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 979-987 (2015).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Schulte, L., Hohwieler, M., Müller, M., Klaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+as+a+novel+complementary+model+to+dissect+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids as a novel complementary model to dissect inflammatory bowel disease.</a> Stem Cells International. 2019, 8010645(2019).</li>
<li>Puzan, M., Hosic, S., Ghio, C., Koppes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+nervous+system+regulation+of+intestinal+stem+cell+differentiation+and+epithelial+monolayer+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enteric nervous system regulation of intestinal stem cell differentiation and epithelial monolayer function.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6313(2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了一种稳定分离小肠隐窝并随后进行三维类器官培养的方法。为了提高隐窝释放率，建立了一种机械分离方法，即在EDTA处理后进行剧烈振荡。本方案所用培养基成分与Sato等人7的原始方案不同。原始培养基相对昂贵，因此本文在表1中列出了适用于小鼠小肠类器官的培养基配方，以及含有药理学抑制剂、重组生长因子和/或条件培养基的定制化培养基。本方案的培养基中不包含Wnt3A和N-乙酰半胱氨酸。由于潘氏细胞表达Wnt3，这些细胞可自行产生Wnt3并支持肠干细胞（ISC）的维持。此外，在隐窝分离过程中不使用条件培养基。类器官模型具有动态性，并表现出细胞和结构上的异质性（包括潘氏细胞、肠上皮细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞、簇细胞和肠干细胞）。因此，这些类器官可用于大规模研究类器官生物学中的基本问题。
EphB2 梯度在成年小肠隐窝-绒毛轴向上维持肠干细胞（ISC）的干性和增殖能力18。相较于分离完整的隐窝，使用单个 EphB2 阳性细胞培养类器官的优势在于有助于深入理解小鼠肠干细胞的生物学特性，因为肠干细胞在多种人类肠道疾病中发挥关键作用。单个高表达 EphB2 的肠干细胞（EphB2high）可像单个表达 Lgr5 的肠干细胞一样被培养形成类器官。其中最关键的步骤是利用流式细胞分选技术（FACS），根据隐窝中 EphB2 的表达水平，将细胞精确分为四组：EphB2high、EphB2med、EphB2low 和 EphB2neg。前向散射光与侧向散射光（FSC 与 SSC）图谱通常用于根据细胞大小和颗粒度来识别目标细胞。在 P0 门控中，FSC 反映细胞大小，SSC 反映细胞的复杂性或颗粒度（图 2A）。在本研究中，位于设定门控（P0）内的细胞随后进行活力分析。接着，根据 7-AAD 荧光信号的阴性和阳性群体来判断其活力。7-AAD 阴性与阳性细胞之间的分界被严格设定，以确保获得尽可能不含阳性细胞污染的阴性细胞群体。EphB2 的门控设置大致依据 EphB2 表达的梯度模式进行划分。
为确认四个组别是否被精确划分，分析了所选基因的 mRNA 表达水平。ISC 标记物的 mRNA 水平在 EphB2high 细胞中较高20。此外，祖细胞特异性标记物的 mRNA 水平在 EphB2med 细胞中相对较高20。然而，与 EphB2high 和 EphB2med 细胞相比，EphB2low 和 EphB2neg 细胞中的 EphB2 表达较低或呈阴性20。在接种前应采取上述措施，以确保 EphB2high 细胞群体的有效富集。然而，EphB2high 细胞形成类器官的效率低于 6% 可能是由于干细胞在培养过程中死亡所致，而非隐窝分离时剧烈震荡引起。已有研究表明，向人胚胎干细胞中添加选择性 Rho 相关激酶（ROCK）抑制剂可显著减少解离诱导的细胞凋亡22。因此，作为一种技术改进，值得尝试提高 ROCK 抑制剂的浓度并延长孵育时间，以改善细胞存活率。
位于肠干细胞（ISCs）旁的分泌Wnt3A的潘氏细胞为肠干细胞提供必要的支持8事实上，与单个肠干细胞相比，肠干细胞-潘氏细胞双细胞组合表现出显著增强的类器官形成能力8此外，在培养的前3天添加浓度为100 ng/mL的Wnt3A已被证明可提高类器官形成能力8因此，作为另一项技术改进，添加外源性 Wnt3A 可提高单个 EphB2 细胞的类器官形成能力高表达 ISCs。
与体内（in vivo）方法相比，类器官更易于进行遗传操作、恶性表型分析以及药物筛选20,23。结合EDTA螯合与机械分离法从隐窝制备小肠类器官具有高效、可重复且省时的优点，且实验人员无需具备高级经验即可轻松操作。因此，在EDTA处理后通过剧烈振荡进行机械分离，可高效地在体外（ex vivo）建立小鼠小肠类器官，为类器官培养及其他成年上皮组织的疾病建模提供了潜在工具。
肠上皮细胞具有极性，其顶面朝向管腔。然而，在三维类器官中，朝向管腔的顶面位于类器官内部。这种结构限制了对顶面的接触，因而在研究管腔成分（如营养物质、微生物和代谢物）对上皮细胞的影响时会带来困难。为克服这一缺点，已开发出将类器官细胞培养为二维单层细胞的方法24。在未来的应用中，类器官细胞单层培养将被广泛采用，因其代表了最高效且易于操作的体系。

肠道类器官自2009年首次建立以来，已成为一种强大的 体外 研究肠道生物学的工具，因其在形态和功能上与成熟组织具有相似性。近年来，源自成体组织干细胞的类器官培养技术取得进展，使得具有自我更新和分化潜能的肠道干细胞（ISCs）能够进行长期培养。这些类器官已被广泛应用于胃肠道生理学及病理生理学的基础与转化研究。1,2,3,4,5,6Clevers 团队开发的三维类器官为研究肠道上皮提供了具有更高生理相关性的强大工具7由于肠道类器官来源于组织干细胞并由多种细胞类型组成，它们能够重现肠道上皮的功能特性。值得注意的是，单个分选的富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5阳性（Lgr5+干细胞也可以在没有任何潘氏细胞或肠干细胞微环境（如上皮微环境或间质微环境）的情况下生成三维类器官7然而，单细胞分选的 Lgr5 具有类器官形成能力+ 细胞的数量相较于隐窝细胞和ISC-潘氏细胞双细胞群体而言较低8.
越来越多的研究表明，乙二胺四乙酸（EDTA）孵育或胶原酶解离的方法会导致上皮层松动并释放隐窝。由于酶解离可能影响隐窝细胞的状态，通常采用机械分离法来解离组织。尽管机械消化是一种快速的技术，但该方法可能导致隐窝得率不一致或细胞活力较差9。因此，可将EDTA处理与机械解离相结合，以获得更高的隐窝得率。本文所示方法的一个特点是，在EDTA螯合后对组织碎片进行剧烈振荡10。剧烈振荡有助于从小肠的隐窝-绒毛复合体中高效分离隐窝。手动振荡的程度决定了分离效果。因此，从复合体中获取隐窝对该领域的研究人员而言至关重要。此外，适当的操作技巧可将绒毛污染降至最低，并提高隐窝数量。
因此，本实验方案采用小鼠来源的小肠类器官，在使用EDTA进行解离处理后，可通过物理力量更有效地分离隐窝。已知促红细胞生成素生成肝细胞受体B2（EphB2）的表达模式在一定程度上反映了隐窝微环境的特征。例如，EphB2阳性细胞从底部到顶部有序排列11。根据EphB2的表达水平进行荧光激活细胞分选（FACS），将获得的细胞分为四组：EphB2high、EphB2med、EphB2low和EphB2neg。随后，展示了野生型（WT）小鼠中单个分选的EphB2high细胞形成类器官的生长能力。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.215</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>TERUMO</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>Iwaki</td><td>2325-015</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Iwaki</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>Iwaki</td><td>2345-050</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 组织培养皿</td><td>FALCON</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Iwaki</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EphB2 APC 标记抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>564699</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6/J 小鼠</td><td>Japan SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>HITACHI</td><td>CCV-1306E</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 mol/L)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06894-14</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>FACSMelody</td><td>BD Life Sciences-Biosciences</td><td>661762</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>173012</td><td>1% (v/v)</td></tr><tr><td>Fiji (软件)</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素 (10 mg/mL)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>16672-04</td><td>25 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Hammacher 实验室剪刀</td><td>SANSYO</td><td>91-1538</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170-PJ</td><td></td></tr><tr><td>实验室镊子</td><td>AS-ONE</td><td>7-164-04</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td>用于 3D 类器官的细胞外基质</td></tr><tr><td>小鼠抗人溶菌酶抗体</td><td>LSBio</td><td>LS-B8704-100</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 EGF (20 &amp;mu;g/mL 储存液)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL</td></tr><tr><td>Pipetman (10 &amp;mu;L, 20 &amp;mu;L, 200 &amp;mu;L 和 1,000 &amp;mu;L)</td><td>GILSON</td><td>1-6855-12, -13, -15, 和 -16</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 Noggin (20 &amp;mu;g/mL 储存液)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1967-NG-025</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>重组小鼠 R-Spondin 1 (250 &amp;mu;g/mL 储存液)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>山梨醇</td><td>Nacalai Tesque</td><td>32021-95</td><td>2% (w/v)</td></tr><tr><td>TE2000-S (倒置显微镜)</td><td>Nikon</td><td>24131</td><td></td></tr><tr><td>延时成像显微镜</td><td>Olympus</td><td>LCV100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 1x</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>ULVAC</td><td>ULVAC KIKO Inc.</td><td>100073</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Fujifilm</td><td>331752-47-7</td><td>10 &amp;mu;M</td></tr></tbody></table>

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

目前，类器官培养代表了一种重要的工具 体外 研究不同器官中的多种生物学方面及疾病。小鼠小肠隐窝在三维细胞外基质中培养时可形成模拟肠道上皮的类器官。这些类器官包含所有类型的细胞，执行多种肠道稳态功能，包括潘氏细胞、肠内分泌细胞、吸收细胞、杯状细胞和簇细胞。通过向培养基中添加已明确的分子，可富集表达富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（Lgr5）的肠干细胞（ISCs），并诱导其向特定谱系分化；这些分子包括表皮生长因子、Noggin（一种骨形态发生蛋白）和R-spondin 1。此外，本文还详细描述了一种从单个表达红细胞生成素产生肝细胞样受体B2（EphB2）阳性的肠干细胞生成类器官的方案。本方法学文章介绍了从小肠组织中分离小肠隐窝及单个肠干细胞的技术，并确保类器官高效建立。

为生成小鼠小肠类器官，可结合EDTA处理与机械分离法，以高效分离隐窝10,13。本研究结果显示，几乎所有分离得到的隐窝在从上皮细胞生态位中挤出后立即闭合，并呈现圆锥形（图1A）。为最大限度减少绒毛污染，将所得悬液通过70 µm细胞筛过滤，随后对滤液进行离心。由于部分隐窝在过滤和悬液过程中可能受损，因此这些步骤应谨慎操作。结果表明，最终组分中的几乎所有隐窝均保持完整，适合用于培养（图1B）。为单独观察每个接种的隐窝，每孔接种100个隐窝（图1C）。加入特定的隐窝培养基后（图1D），每日通过显微镜监测类器官的发育情况。此外，通过延时成像观察隐窝来源的类器官生长，以监测其发育过程（图1E 和 补充视频S1）。培养的隐窝表现出典型的发育模式。类器官的内腔充满大量凋亡细胞。肠干细胞（ISC）在出芽区域的隐窝部位发生活跃增殖与分化（图1E 和 补充视频S1）。出芽过程伴随ISC的迁移与增殖以及潘氏细胞的分化。分化后的潘氏细胞始终定位于出芽部位（补充图S1）。由于在10倍放大倍率的倒置显微镜下确认类器官在培养中保持稳定，该技术可用于研究发育中小肠中隐窝的形成，以及评估组织再生能力与肠干细胞长期存活能力，从而支持新肠上皮细胞的生成14,15,16。
Lgr5 被定义为一种肠干细胞（ISC）标志物，小鼠 Lgr5+ 细胞形成三维类器官7然而，由于LGR5蛋白在细胞表面的表达量较低，且缺乏高亲和力的抗LGR5抗体，通过FACS高效分离小鼠肠干细胞（ISCs）仍具挑战性。EphB2此前已被鉴定为从小鼠和人类肠道组织中分离纯化肠干细胞的表面标志物。17,18EphB2的表达模式增加了肠干细胞标记物的复杂性。EphB2阳性细胞分布于整个增殖区，在隐窝底部最为密集，并沿隐窝向上呈梯度递减。11潘氏细胞和前体细胞也定位于隐窝。潘氏细胞主要表达EphB3，该分子对其定位至关重要，而隐窝中位于其上方的前体细胞则主要表达EphB2。因此，在使用抗EphB2抗体进行肠干细胞纯化过程中，可能同时污染这两种细胞类型。因此，应评估通过流式细胞术利用EphB2分离的细胞的标志基因表达及其类器官形成能力。
基于这些事实，可通过FACS分析从野生型隐窝中分离出EphB2表面标记的细胞19。已有研究探讨EphB2的表达是否能够区分四类细胞群体，这些群体具有特定标记物的表达特征，例如肠干细胞特异性标记基因（Lgr5、Ascl2 和 Olfm4）以及祖细胞特异性标记基因（Ki67、Myc 和 FoxM1）。该实验表明，EphB2high细胞主要为肠干细胞，而EphB2med细胞则不然20,21。最后，根据细胞分离方法，所获得的细胞被分为四组（EphB2high、EphB2med、EphB2low 和 EphB2neg 细胞）（图2）。随后，通过FACS分选获得的单个高表达EphB2的细胞被用于类器官培养。单个EphB2high细胞可独立用于局部处理，并重建出类似于正常小肠的自我组织化的隐窝-绒毛结构（图3）。然而，来自其他组（EphB2med、EphB2low 和 EphB2neg）的细胞则无法形成类器官20。
在之前的一项研究中，约6%的单细胞分选Lgr5-GFPhi细胞能够启动隐窝-绒毛类器官的形成7。然而，其余细胞无法生成类器官，并在前12小时内死亡7。作者推测，这可能是由于分离过程本身所固有的物理和/或生物学应激所致7。在野生型小鼠中，单细胞分选的EphB2high细胞也获得了低于6%的类器官生长率。培养至第5天时，形成类球状结构（图3）。从第7天到第9天，这些斑点向外突出，形成隐窝结构（图3）。重要的是，对单细胞分选的EphB2high细胞应用特定的ROCK抑制剂，可减轻解离诱导的细胞凋亡，并提高类器官生长的效率。
<img alt="细胞培养延时图像；显微镜；生长进程分析；多孔板实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65219/65219fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：小鼠小肠类器官的生成。（A）通过EDTA螯合与机械解离联合方法制备的隐窝。（B）最终获得的纯化隐窝。（C）包埋于细胞外基质中的隐窝。（A-C）黑色箭头指示隐窝。（D）隐窝与类器官的三维培养。（E）由隐窝发育而成的类器官的代表性图像。白色箭头指示隐窝出芽。比例尺 = （A-C）100 µm 和（E）50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/65219fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；细胞分选散点图；显示FSC-A与SSC-A以及7-AAD的数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65219/65219fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：在野生型小鼠中获取EphB2阳性（EphB2+）细胞群体的流式细胞术设门策略。（A）利用前向散射和侧向散射散点图分别根据细胞大小和颗粒度对细胞进行区分。（B）利用荧光散射根据细胞的7-AAD（PerCP）荧光强度区分活细胞，并选择7-AAD阴性细胞群体的设门。（C）设定EphB2高表达（EphB2high）、EphB2中等表达（EphB2med）、EphB2低表达（EphB2low）和EphB2阴性（EphB2neg）细胞群体的设门。缩写：FSC-A = 前向散射峰面积；SSC-A = 侧向散射峰面积；7-AAD = 7-氨基放线菌素D。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/65219fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="9天内菌落生长情况，显微镜图像显示细胞增殖和发育阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65219/65219fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：野生型小鼠中单细胞分选的EphB2high细胞类器官生长的时间过程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/65219fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：24孔板的培养基。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/65219_JoVE_Table1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充视频 S1：类器官生长的延时图像。比例尺 = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/JoVE_Supplymental%20Movie1.avi" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S1：类器官中抗溶菌酶抗体染色的代表性图像。 白色箭头指示潘氏细胞。缩写：DIC = 差示干涉对比显微镜。比例尺 = 10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/65219_%20supplementary%20Figure%20S1%20(1).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。

目前，类器官培养是体外研究不同器官多种生物学特性及疾病的重要工具。小鼠……

我们的研究聚焦于干细胞生物学，特别是位于肠隐窝底部的肠道干细胞。旨在解答肠道干细胞如何维持体内平衡。源自肠道干细胞的三维类器官培养技术为研究干细胞的增殖、分化及维持提供了强有力的工具。类器官技术通过维持肠干细胞的自我更新和分化潜能，有助于其长期培养。类器官已广泛应用于肠道脆弱性及既往脆弱性相关的基础与转化研究。我们当前的挑战在于理解参与肠上皮细胞和干细胞调控的冠状系统。理解由目标克隆引发的生物学过程至关重要。我们的一项重要发现是，通过目标克隆的信号传导能够维持肠道上皮细胞生长与分化的稳态。本方案描述了一种稳定分离小肠隐窝并进行三维类器官培养的方法。为了提高隐窝的释放率，我们建立了一种机械分离方法，即在EDTA处理后进行剧烈振荡。EDTA处理与机械解离相结合可提高隐窝的得率。此外，适当的操作技巧可将各种污染降至最低，从而增加隐窝数量。我们的研究结果表明，毒蕈碱受体和胆汁酸受体的信号通路似乎协同作用，以维持肠上皮细胞生长与分化的稳态。这促使我们提出假设：非神经性冠状系统在调节肠干细胞微环境中发挥关键作用。首先，从安乐死的动物体内分离小肠，并将组织转移至培养皿中。使用手术剪和镊子去除小肠上的脂肪组织，然后将小肠切成若干段。用5毫升注射器以5毫升冷PBS抗生素溶液冲洗小肠，以清除管腔内容物。沿纵轴方向用手术剪将组织剪开，然后在摇动条件下用手动方式用冷PBS抗生素溶液洗涤。使用手术剪将肠段剪成约5毫米×5毫米的组织块。用移液器将收集的组织碎片转移至50毫升离心管中。随后，向含有组织碎片的离心管中加入25毫升冰冷的含抗生素PBS溶液，并来回振荡管子10次，以洗去组织碎片中的肠内容物。吸去洗涤后的缓冲液。组织碎片现已准备好用于隐窝分离。对于小鼠小肠隐窝的分离，使用经过充分洗涤的、大小为5毫米×5毫米的小鼠小肠片段。将组织块置于含有2毫摩尔EDTA的PBS抗生素溶液中，冰上孵育30分钟，期间不摇动。为便于细胞外基质（ECM）凝固，可预先将24孔板放入37摄氏度的组织培养孵箱中孵育。吸除组织碎片中的EDTA溶液后，加入25毫升新鲜的冷PBS抗生素溶液。然后用手剧烈振荡容器30至40次。用70微米的滤网将悬液过滤一次。在进行下一步之前，需在显微镜下确认隐窝的存在。接下来在390 × g、4°C条件下离心悬浮液3分钟。然后将隐窝沉淀重悬于20毫升含有2%山梨醇的DMEM中，此后简称山梨醇DMEM。将10毫升隐窝悬浮液转移至两个新的15毫升离心管中，每管各10毫升。此次在4°C条件下以较低的80G转速离心两个试管3分钟，以将大块细胞团与细胞或碎片分离开。轻轻吸走上清液，每管中保留约2毫升上清液。然后向每管中加入10毫升山梨醇DMEM培养基。将悬液再次在80G、4摄氏度条件下离心3分钟。如前所示吸除上清液，并加入10毫升山梨醇DMEM重悬细胞。吸除上清液后，加入10毫升完全DMEM，通过反复吹打重悬沉淀。静置悬浮液1分钟，以高效获得漂浮的隐窝。1分钟后，通过70微米细胞滤筛将两支试管中的悬浮液过滤至一支新试管中，以纯化隐窝。接种前计数纯化隐窝时，将25 µL液滴滴加至6 cm培养皿中的三个位点。在显微镜下以 4 倍放大倍数计数隐窝数量，并计算每 25 微升中的隐窝浓度。随后将全部滤液在 4 摄氏度下以 290 ×g 离心 3 分钟。接种时，将隐窝以每 40 微升基质胶（ECM）含 100 个隐窝的浓度悬浮于 ECM 中，轻轻吹打 5 至 10 次，避免产生气泡，以获得均一的悬浮液。然后将40 µL隐窝悬液接种至预热的24孔板中，每孔加一滴。将24孔板置于37°C、5% CO₂条件下孵育15分钟，以促进ECM凝固。每孔加入500 µL培养基覆盖ECM，培养基中需含有小鼠表皮生长因子、重组小鼠R-Spondin 1和重组小鼠Noggin蛋白。每孔中各材料的终浓度如图所示。将类器官在37摄氏度、5%二氧化碳条件下进行培养。使用延时成像显微镜，每隔三小时进行一次活细胞成像，持续最多七天，以获取连续的Z轴层扫图像。几乎所有分离出的隐窝在从上皮细胞微环境中挤出后立即封闭，并呈现圆锥形。此外，最终组分中的隐窝结构完整，适合用于培养。类器官生长的延时成像显示，活跃的增殖和分化发生在具有出芽结构的隐窝区域的肠干细胞中。出芽过程与细胞迁移、增殖以及潘氏细胞分化相偶联。为了从单个表达促红细胞生成素的肝细胞受体B2（FEB2）阳性的肠干细胞生成类器官，需根据FEB2的表达进行荧光激活细胞分选，并将获得的细胞分为四组：高表达、中等表达、低表达和阴性表达。在4摄氏度、390G条件下离心3分钟收集FEB2高细胞沉淀后，通过移液将单个分选的FEB2高细胞嵌入细胞外基质（ECM）中。然后将细胞接种至24孔板，每孔40微升ECM中接种100个单细胞。将24孔板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育15分钟，以促进ECM的聚合。接下来，在ECM上加入500 µL含有10 µM Rho相关激酶（或称ROCK抑制剂）的培养基，前两天使用以维持FEB2高表达细胞。使用倒置显微镜在40倍放大倍数下人工检查细胞，观察具有球形结构和隐窝突起的存活类器官。由单个FEB2高表达细胞成功重建了类似于正常小肠的自组织隐窝-绒毛结构。培养至第5天时，形成了类球状结构。从第7天到第9天，这些斑点向外突出，形成隐窝。

the-3d-culturing-organoids-from-murine-intestinal-crypts-single-stem

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

小鼠肠隐窝和单个干细胞的类器官的3D培养用于类器官研究

在本视频中，我们演示了一种从小鼠小肠中分离完整隐窝的技术。分离得到的完整隐窝可用于在体外培养长期存活且具有自我更新能力的三维类器官。...

小肠隐窝分离：一种从小鼠模型小肠中分离完整隐窝的方法

我们详细描述了以下操作步骤：1）利用磁性纳米颗粒高效构建用于慢病毒或逆转录病毒转导的肠道类器官；2）对经基因工程改造的类器官制备冷冻切片。该方法为高效调控类器官中的基因表达以研究其下游效应提供了有力工具。...

利用磁性纳米颗粒转导病毒载体对原代小鼠肠道类器官进行遗传工程改造以用于冰冻切片

利用此处所述的单细胞分辨率三维成像方案，可完整捕获类器官的整个三维结构、细胞组成及其与原始组织的表型相似性。该方案适用于来源、大小和形状各异的多种类器官。...

单细胞分辨率下完整类器官的三维成像

该实验方案描述了从小鼠肠道上皮中分离正在进行去分化的绒毛，以确定其形成类器官的潜能。...

从小肠绒毛上皮去分化过程中类器官的三维培养

关键词：类器官，小肠绒毛上皮，去分化，三维培养

本方案提供了建立小鼠小肠类器官、从小鼠小肠固有层中分离1型固有淋巴细胞，以及在两种细胞类型之间建立三维（3D）共培养体系的详细操作步骤，用于研究肠上皮细胞与1型固有淋巴细胞之间的双向相互作用。...

小鼠小肠上皮类器官与固有淋巴细胞的共培养

本实验方案描述了建立小鼠结肠类器官系统，用于研究在claudin-7基因敲除模型中结肠干细胞的活性与功能。...

小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

本文介绍了一种利用冷冻保存的猪肠上皮隐窝培养三维类器官的方案。同时，我们还描述了一种由三维类器官衍生建立细胞单层的方法，可实现对上皮细胞顶膜侧的接触与研究。...

从冷冻保存的肠上皮隐窝培养仔猪肠道三维类器官及建立单层细胞模型

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内...

大鼠肠道类器官的生成与操作

过去，许多体外培养系统——主要是单层培养——常常存在一个缺点，即分化的原代细胞寿命相对较短，并在培养过程中发生去分化。因此，它们的大多数器官特异性功能迅速丧失。为了在体外更好地重现这些细胞的生理条件，人们已对传统的单层培养方法进行了多种改进和优化。...

访谈：用于干细胞研究的生物反应器及表面修饰三维支架

肌纤维的分离与培养是金标准 体外...

分离与培养成年骨骼肌单个肌纤维及其卫星细胞

学习小鼠小肠隐窝分离与三维类器官培养技术，结合EDTA处理和机械解离方法提高隐窝产量。该技术为研究肠道干细胞稳态维持机制及上皮细胞增殖分化提供了可靠的实验模型。

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

探索更多视频