Name: 多重免疫荧光结合空间图像分析，用于肿瘤微环境的临床和生物学评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: 了解酪酰胺信号放大多重免疫荧光结合空间图像分析方法，用于肿瘤微环境临床评估。该技术可检测低丰度蛋白，适用于FFPE组织切片，为癌症研究提供可量化的生物学数据。

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作者谨此感谢 Derouane F 博士提供的帮助与支持。Nicolas Huyghe 是比利时科学研究中心国家基金（Télévie/FNRS 7460918F）资助项目的科研研究员。

本方案中使用的所有样本均来自经当地伦理委员会批准并由主管机构授权的研究。所有研究参与者均签署了书面知情同意书。该试验已在 ClinicalTrials.gov 注册（NCT03608046）。
1. 多重免疫荧光
<ol>
	<li>石蜡包埋切片
	<ol>
		<li>用 4% 多聚甲醛固定组织，并将固定后的组织包埋于石蜡中。</li>
		<li>切取 5 µm 厚的切片，并将其置于粘附性载玻片上。</li>
		<li>在室温（RT）下将载玻片干燥过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱蜡及内源性过氧化物酶抑制
	<ol>
		<li>在通风橱中，将载玻片依次浸入甲苯（每次 5 分钟，共 3 次）和甲醇（每次 5 分钟，共 3 次）中进行脱蜡。</li>
		<li>在通风橱中，将载玻片浸入用甲醇稀释的 3% 过氧化氢溶液中 20 分钟，以抑制内源性过氧化物酶活性。</li>
		<li>用蒸馏水（dH2O）冲洗载玻片（每次 3 分钟，共 1 次）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多重免疫荧光染色
	<ol>
		<li>将载玻片浸入含有 10 mM 枸橼酸盐缓冲液（pH 6）或 EDTA 缓冲液（pH 9）并添加 0.1% TritonX-100 的 300 mL 染色缸中。 
		注意：所用缓冲液（pH 6 或 pH 9）取决于待染抗原（见 表 1）。</li>
		<li>将盖上盖子的染色缸放入微波炉中，以最大功率（例如 900 W）加热 3–5 分钟，直至缓冲液开始沸腾。 
		注意：最佳沸腾时间取决于微波炉型号和缓冲液体积，可能需要调整以确定最适时间。对于某些脆弱抗原或脆弱且贴附性差的样本（如类器官和球状体），微波沸腾可能过于剧烈，此时可改用压力锅。</li>
		<li>将密闭的染色缸置于微波炉中，以低功率（例如 90 W）维持 15 分钟，使缓冲液保持接近沸腾的温度。</li>
		<li>通过将微波炉调至最大功率加热 90 秒，完成最后一步加热。</li>
		<li>从微波炉中取出染色缸，让缓冲液在室温下冷却 15 分钟。</li>
		<li>用 dH2O 冲洗载玻片（每次 5 分钟，共 3 次），然后用含 0.1% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBS-T）冲洗 1 次（5 分钟）。</li>
		<li>用纸巾轻压载玻片以吸除 TBS-T 溶液。</li>
		<li>将载玻片（平放）置于染色盒托盘或显微镜载玻片盒中（见 材料表）。</li>
		<li>用疏水笔在组织周围画圈。</li>
		<li>用含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBS-T 溶液覆盖组织，封闭非特异性结合位点，孵育 30 分钟。</li>
		<li>用纸巾轻压载玻片以吸除封闭液。 
		注意：封闭步骤后无需冲洗载玻片。</li>
		<li>将一抗（见 表 1）用含 1% BSA 的 TBS-T 溶液稀释后，取约 300 µL 覆盖组织，孵育 60 分钟。</li>
		<li>用 TBS-T 溶液冲洗载玻片（每次 3 分钟，共 3 次）。</li>
		<li>将多聚-HRP 二抗（见 表 1）取约 300 µL 覆盖组织，孵育 40 分钟。</li>
		<li>用 TBS-T 溶液冲洗载玻片（每次 3 分钟，共 3 次）。</li>
		<li>将荧光素-酪胺试剂（见 表 1）用硼酸盐缓冲液（0.1 M 硼酸，pH 7.8，3 M NaCl）现配稀释 200 倍，并加入 0.003% H2O2，取约 300 µL 覆盖组织，孵育 10 分钟。</li>
		<li>用 TBS-T 溶液冲洗载玻片（每次 3 分钟，共 3 次）。</li>
		<li>重复步骤 1.3.1–1.3.16，直至完成所有 TSA 染色步骤。</li>
		<li>将最后一种一抗（见 表 1）用含 1% BSA 的 TBS-T 溶液稀释后，覆盖组织，于 4 °C 过夜孵育。 
		注意：由于孵育时间为过夜，必须盖好染色盒托盘或显微镜载玻片盒，并在盒底（载玻片下方）的纸巾上加少量 dH2O，以确保组织在孵育过程中不会干燥。</li>
		<li>用 TBS-T 溶液冲洗组织（每次 5 分钟，共 3 次）。</li>
		<li>将荧光标记的二抗用含 1% BSA 的 TBS-T 溶液稀释 200 倍后，覆盖组织，孵育 120 分钟。</li>
		<li>用 TBS-T 溶液冲洗组织（每次 5 分钟，共 3 次）。</li>
		<li>用 bisbenzimide（20 mM）用含 10% BSA 的 TBS-T 溶液稀释 1,000 倍后覆盖组织，孵育 5 分钟以染色细胞核。 
		&#8203;注意：bisbenzimide 可由 DAPI 替代，但后者毒性更强，需在通风橱中谨慎操作。</li>
		<li>用 dH2O 冲洗组织（每次 3 分钟，共 3 次）。</li>
		<li>使用荧光封片剂和硼硅酸盐盖玻片对载玻片进行封片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 载玻片扫描
<ol>
	<li>使用荧光玻片扫描仪以 20 倍放大倍数对玻片进行数字化扫描（扫描仪详细信息见材料表）。 
	&#8203;注意：最优多重染色样本的代表性扫描图像见图 1。</li>
</ol>
3. 图像分析
<ol>
	<li>将扫描图像导入图像分析软件（文件 &#62; 打开图像）。</li>
	<li>进入 分类器 选项卡，选择 DenseNet AI V2 插件。</li>
	<li>通过在一个图像中圈选约 500 个细胞核，训练 DenseNet AI V2 插件以识别细胞核。</li>
	<li>在来自同一批次及不同批次的多张 mIF 染色切片上，每张切片圈选若干细胞核（约 50 个），在多张切片（约 10 张）上进一步训练人工智能模型。 
	注：有关如何使用 AI 插件的详细说明，请参见软件手册。使用人工智能进行细胞核检测为可选步骤，具体取决于所使用的图像分析软件，也可采用其他细胞核检测方法。</li>
	<li>保存已训练的 AI 模型（分类器操作 &#62; 保存）。</li>
	<li>进入 注释 选项卡，使用 画笔注释工具 为每个感兴趣区域（ROI）创建注释，例如肿瘤中心区域和肿瘤边缘区域。</li>
	<li>如有必要，使用 排除注释工具 删除存在褶皱或模糊的区域。 
	注：可在进行 mIF 染色前，对相邻组织切片进行苏木精-伊红染色，以确认样本中存在肿瘤细胞，并辅助病理学家确定感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>进入 分析 选项卡，选择 HighPlex FL 算法（设置操作 &#62; 加载 &#62; HighPlex FL）。</li>
	<li>选择 染料选择 选项卡，并选择目标染料。</li>
	<li>在 细胞核检测 选项卡中，进入 细胞核分割类型，选择 AI 自定义模式。</li>
	<li>在 细胞核分割分类器 中，选择步骤 3.5 中保存的 AI 模型。</li>
	<li>在 膜和细胞质检测 选项卡中，设置最大细胞质半径（本研究中使用 1.5）以及膜染料的数量。</li>
	<li>针对每种染料，设置细胞核阳性阈值、细胞质阳性阈值和膜阳性阈值。 
	注：每种染色的阈值均不相同，应根据每批切片及每种抗原染色情况进行调整。使用 查看设置 工具（查看 &#62; 查看设置）可通过强度峰值末端（右侧）的强度值，辅助选择合适的阈值。</li>
	<li>针对每种染料，设置细胞核、膜和细胞质的完整性百分比值。 
	注：该参数对于避免当两个染色不同的细胞彼此靠近时出现假阳性检测至关重要（图 2）。</li>
	<li>保存该算法（设置操作 &#62; 保存）。</li>
	<li>分析感兴趣区域（ROI）（分析 &#62; 注释图层）。</li>
	<li>进入 结果 选项卡，全选 对象数据 中的所有数据（Ctrl + A）。</li>
	<li>将数据导出为 .csv 格式（右键单击 &#62; 导出 &#62; 对象数据 .Csv）。 
	&#8203;注：该表格包含每个被分析细胞的位置（Xmin, Xmax; Ymin, Ymax）及其各标记物的阳性情况。</li>
</ol>
4. 使用 R 进行生物信息学分析
注意：有关以下步骤的更多详细信息，可参见 GitHub 上提供的 R 脚本（benidovskaya/Ring：多重免疫荧光染色分析流程。[github.com]）
<ol>
	<li>根据导出的表格，首先基于共定位染色结果定义不同的细胞类型。例如，将细胞毒性T细胞定义为CD3+/CD8+双阳性细胞。</li>
	<li>然后，使用图像分析软件导出的坐标以及 ggplot2 在点图上重建该切片的简化图像图3）。利用这些数据，可进行多种类型的分析：
	<ol>
		<li>密度分析 
		注意：最简单的分析是密度分析。
		<ol>
			<li>使用整张切片（针对活检样本）或组织的某些特定区域，对所有细胞类型进行密度分析。例如，计算肿瘤中心区域和肿瘤边缘区域 CD3+ 和 CD8+ T 细胞的密度图4A- C).</li>
			<li>为计算这些密度，使用图像分析软件为每个样本生成包含每种细胞表型及其坐标的特定数据框。在 R 中通过聚类函数（k-最近邻法），利用所研究活检样本的边界创建一个多边形对象，并计算该多边形内目标细胞类型的密度。 
			注意：这允许根据不同的生物学假设，比较不同条件下（如不同时间点、处理类型、组织类型以及对处理的响应）和不同定位区域（如肿瘤中心、肿瘤边缘、间质纤维化区域和坏死区域）之间各类细胞的密度。由于癌细胞、肿瘤周围细胞和肿瘤浸润细胞之间的空间距离非常接近，图像分析软件可能会将某些细胞同时识别为免疫细胞和癌细胞。在这种情况下，需要通过生物信息学手段对这一问题进行校正，并明确这些双阳性细胞的身份。本研究中，CD3+CD8+cytokeratin+细胞被标记为细胞毒性细胞，因为其细胞角蛋白（cytokeratin）阳性信号来源于包围浸润性淋巴细胞的肿瘤细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>热图
		<ol>
			<li>利用不同组中每种细胞类型的密度，并通过应用归一化方法（例如，缩放居中），绘制热图图5) 代表样本群体中细胞丰度。</li>
			<li>基于细胞密度进行无监督层次聚类，将肿瘤微环境（TME）组成相似的患者聚类，并将这些聚类结果与治疗反应和生存期等临床参数相关联。 
			注意：热图和聚类分析可使用 R 语言的 ComplexHeatmap 软件包轻松实现9.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>空间细胞分布
		<ol>
			<li>计算细胞之间的生物信息学距离（例如，免疫细胞与肿瘤细胞之间）； 图6A，B根据图像分析提供的细胞坐标，计算目标细胞类型之间的中位数和平均距离，用于比较队列中所有样本的细胞邻近性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>空间描述函数
		<ol>
			<li>使用 R spatstat 包提供的交叉型最近邻 G-交叉函数10,&#160;用于确定目标细胞X（如肿瘤细胞）在以细胞X为中心的特定半径范围内遇到最近邻细胞Y（如T细胞）的概率。</li>
			<li>计算经验曲线下面积，以获得代表肿瘤细胞周围CD3+ T细胞浸润程度的数值11 (图6C）。使用其他空间描述函数，例如 F 函数或 J 函数12.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>免疫评分分析
		<ol>
			<li>计算由Galon团队开发的免疫评分（I）7,8通过检测肿瘤中心区域和肿瘤侵袭边缘处CD3+和CD8+ T细胞的密度。 
			注意：评分范围为 I0 至 I4。肿瘤中心区和边缘区 CD3+ 和 CD8+ T 细胞密度均较低时，评分为 I0；两个区域 CD3+ 和 CD8+ T 细胞密度均较高时，评分为 I4。近期，一项纳入来自13个国家14个中心的2,681例I-III期结肠癌患者样本的研究验证了免疫核心（Immunocore）的预后价值。7然而，Immunoscore 的计算需要包含肿瘤中心及边缘区域的手术切除标本。对于通常缺乏边缘组织的活检样本，近期已开发出适用于活检的改良版 Immunoscore13.</li>
			<li>为计算适用于活检的免疫评分（Immunoscore），将CD3+和CD8+ T细胞密度的数值转换为百分位数，然后采用CD3+与CD8+ T细胞百分位数的平均值，将其划分为三个等级之一（即低、中、高）13.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>热点分析
		<ol>
			<li>使用热点分析，通过 quadratcount 函数（spatstat）10，以比较组织中浸润最密集区域不同细胞类型的密度。例如，可以计算一个 &#34;免疫评分样&#34; 使用组织中浸润最显著区域的CD3和CD8 T细胞密度值进行评分（图7）适用于分析在组织中呈非均匀分布的任何细胞类型。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

<ol><li>Ge, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiles+of+immune+cell+infiltration+and+immune-related+genes+in+the+tumor+microenvironment+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Profiles of immune cell infiltration and immune-related genes in the tumor microenvironment of colorectal cancer.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109228(2019).</li>
<li>Fridman, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+as+a+guide+for+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment as a guide for cancer therapies.</a> Oncoimmunology. 1 (3), 261-262 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+Impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22in+Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: Impact on clinical outcome.</a> in Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+The+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Calu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+biomarkers+within+the+colorectal+cancer+related+inflammatory+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Key biomarkers within the colorectal cancer related inflammatory microenvironment.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7940(2021).</li>
<li>Havel, J. J., Chowell, D., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+landscape+of+biomarkers+for+checkpoint+inhibitor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 133-150 (2019).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Mlecnik, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analyses+of+colorectal+cancer+show+immunoscore+is+a+stronger+predictor+of+patient+survival+than+microsatellite+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrative analyses of colorectal cancer show immunoscore is a stronger predictor of patient survival than microsatellite instability.</a> Immunity. 44 (3), 698-711 (2016).</li>
<li>Gu, Z., Eils, R., Schlesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+heatmaps+reveal+patterns+and+correlations+in+multidimensional+genomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2847-2849 (2016).</li>
<li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaddeley%2C+A+%22Spatial+Point+Patterns%3A+Methodology+and+Applications+with+R%22">Spatial Point Patterns: Methodology and Applications with R</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2022).</li>
<li>Barua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+interaction+of+tumor+cells+and+regulatory+T+cells+correlates+with+survival+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Spatial interaction of tumor cells and regulatory T cells correlates with survival in non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 117, 73-79 (2018).</li>
<li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+and+analyze+the+cellular+spatial+distribution+extracted+from+multiplex+immunofluorescence+data+to+understand+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340(2021).</li>
<li>El Sissy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diagnostic+biopsy-adapted+immunoscore+predicts+response+to+neoadjuvant+treatment+and+selects+patients+with+rectal+cancer+eligible+for+a+watch-and-wait+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A diagnostic biopsy-adapted immunoscore predicts response to neoadjuvant treatment and selects patients with rectal cancer eligible for a watch-and-wait strategy.</a> Clinical Cancer Research. 26 (19), 5198-5207 (2020).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+staining+by+sequential+immunostaining+and+antibody+removal+on+routine+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

优化多重染色时需要考虑的最重要参数包括每种一抗的稀释度、特异性和抗原修复方法。在开始多重染色实验前，必须使用显色染色法（DAB）对每种一抗的最佳稀释度和最佳表位修复条件（pH 6 或 pH 9）进行测试。我们建议针对每种抗原修复缓冲液测试三个稀释梯度：抗体生产商通常推荐的稀释度、该稀释度的两倍稀释（即稀释倍数加倍）以及该稀释度的二倍浓缩（即稀释倍数减半）（图8）。选择合适的稀释度是验证抗体特异性和优化染色信噪比（SNR）的关键步骤。在DAB染色中确定最佳稀释度后，应使用单重TSA方法对每种一抗的相同稀释度进行验证。在为每种抗原染色选定稀释度和表位修复缓冲液后，正确设置多重染色的顺序也至关重要；具体而言，某些抗原更适合在第一轮染色，而另一些则更适合在最后一轮。我们建议通过测试所有可能的染色顺序组合，来确定每种抗原染色应安排在第几轮。这一步骤同样非常重要，因为某些不稳定的抗原可能在多次抗原修复循环后发生降解，而另一些抗原则可能在经历多次修复循环后染色效果更佳。例如，CD3的信噪比在最后一轮染色时始终较高，而PD-1染色则在第一轮染色时效果更优。此外，多个共定位抗原的染色可能受到“伞效应”（酪胺反应位点饱和）的影响，这可以通过降低酪胺浓度来缓解。当某一抗原的表达依赖于另一抗原的表达时（如CD8仅存在于表达CD3的T细胞上），我们建议先染表达范围较窄的抗原，再染表达范围更广的抗原（本例中为CD3）。最后，根据扫描仪的特性为每种抗原染色选择合适的荧光染料，也是避免交叉检测的重要步骤。
该技术的主要优势在于所获得的信号放大效果和信噪比。然而，该技术也存在一个局限性，即染色是依次进行的，并且荧光染料与组织之间为共价结合。尽管如此，在完成所有酪胺信号放大（TSA）步骤后，仍可追加最后一次使用荧光染料直接标记的二抗进行染色（非TSA法）。在某些检测面板中，我们采用了这种方法来增加750通道的染色，这是必要的，因为在当时市场上尚无商业化的酪胺-AF750试剂。需要注意的是，AF750标记抗原在扫描过程中的曝光时间将明显长于其他通过TSA标记的抗原。在此情况下，我们建议对高表达的蛋白（如细胞角蛋白）进行染色，或提高一抗的浓度。通过上述优化，可在单次实验中根据荧光扫描仪的不同，每张切片最多实现五至六种抗原的联合染色。
相比之下，一些 commercially available 技术采用连续染色方法，通过多轮染色、扫描以及洗脱或光漂白步骤，以增加在同一张组织切片上可检测的抗原数量。然而，这些技术通常耗时较长、成本较高，缺乏信号放大机制，需要复杂的计算步骤来正确合并连续扫描的图像，并且根据我们的经验，由于操作步骤繁多，可能对组织造成不可逆的损伤。尽管如此，已有报道称利用该方法可在单张组织切片上实现多达 30 种抗原的染色14。
综上所述，我们的方法是一种稳健、可重复、易于使用且成本效益高的免疫组织荧光技术，任何配备荧光切片扫描仪的实验室均可采用。该方法可使用任何适用于免疫组化（IHC）的商业化一抗，且检测面板不依赖于任何商业试剂盒。图像分析可在多种不同软件中进行，包括QuPath和R等开源程序。然而，我们认为该方法未来还可进一步优化，以适用于大规模抗原面板检测，从而实现同一张切片上不同抗原组合的连续染色与扫描，并具备信号放大优势。

随着靶向治疗和免疫检查点抑制剂的发展，深入表征癌细胞与其肿瘤微环境之间相互作用的重要性日益凸显，目前这已成为转化研究的重要领域之一。肿瘤微环境（TME）由多种不同类型的细胞组成，其中包括靶向癌细胞的免疫杀伤细胞，以及可能促进肿瘤生长和侵袭性的免疫调节细胞1,2,3,4。对这一复杂环境的深入解析，有助于加深对癌症疾病的理解，并可能帮助科研人员和临床医生发现新的预测性和预后性生物标志物，从而更精准地为未来治疗筛选适宜患者5,6。例如，Galon 及其团队开发了免疫评分（Immunoscore），这是一种可重复的评分方法，可用作预测性生物标志物。免疫评分通过计算肿瘤侵袭边缘和肿瘤中心区域 CD3+ 和 CD8+ T 细胞的密度来确定7,8。
在过去几十年中，多重免疫荧光（mIF）的商业解决方案已得到开发，但这些方案通常价格昂贵，且针对特定的抗原组合而设计。为了克服在学术研究和转化研究中对抗原组合的特定需求，我们开发了一种经济高效的方法，可在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的肿瘤组织切片上进行多重免疫荧光染色，该方法适用于人和小鼠样本，能够同时检测两种至六种抗原，并结合细胞核复染。
当整个组织切片经荧光扫描仪染色并扫描后，可使用多种支持大型金字塔数据集的图像分析软件对样本进行分析。最后，可将原始数据导入统计计算与图形处理环境（如 R 软件 v.4.0.2），以进行密度和基于空间的分析。
本文介绍了一种优化的五标记染色方案，以及优化新抗体组合的技巧与提示。此外，还详细说明了图像分析的具体步骤，以及用于统计学和空间分析的R语言函数。

<table><tbody><tr><td>一抗 anti-CD3</td><td>Abcam</td><td>ab16669</td><td>兔单克隆</td></tr><tr><td>一抗 anti-CD8</td><td>DAKO</td><td>M710301</td><td>鼠单克隆</td></tr><tr><td>一抗 anti-hPanCK</td><td>DAKO</td><td>M3515</td><td>鼠单克隆</td></tr><tr><td>一抗 anti-PD-1</td><td>Cell Signalling</td><td>D4W2J</td><td>兔单克隆</td></tr><tr><td>一抗 anti-PD-L1</td><td>Cell Signalling</td><td>13684</td><td>兔单克隆</td></tr><tr><td>一抗 anti-RORC</td><td>Sigma</td><td>MABF81</td><td>鼠单克隆</td></tr><tr><td>ATTO-425</td><td>ATTOtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioscan Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>光源：Colibri 7（385、430、475、555、590、630、735 nm）滤光片组：激发 379/34 &amp;ndash; 二向色镜 409 &amp;ndash; 发射 440/40；激发 438/24 &amp;ndash; 二向色镜 458 &amp;ndash; 发射 483/32；激发 490/20 &amp;ndash; 二向色镜 505 &amp;ndash; 发射 525/20；激发 546/10 &amp;ndash; 二向色镜 556 &amp;ndash; 发射 572/23；激发 592/21 &amp;ndash; 二向色镜 610 &amp;ndash; 发射 630/30；激发 635/18 &amp;ndash; 二向色镜 652 &amp;ndash; 发射 680/42；激发 735/40 &amp;ndash; 二向色镜 QBS 405 + 493 + 611 + 762 - 发射 QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38；物镜：Plan-Apochromat 20x/0.8；相机&amp;nbsp;：Orca Flash 4.0 V3</td></tr><tr><td>硼硅酸盐盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Envision+ 抗小鼠试剂</td><td>DAKO</td><td>K4001</td><td></td></tr><tr><td>Envision+ 抗兔试剂</td><td>DAKO</td><td>K4003</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片介质</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 750</td><td>ThermoFischer</td><td>A-21037</td><td></td></tr><tr><td>HALO 软件</td><td>Indicalabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoescht&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus 显微镜载玻片</td><td>Fisherscientific/Epredia</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>酪胺-AF488</td><td>ThermoFischer</td><td>B40953</td><td></td></tr><tr><td>酪胺-AF555</td><td>ThermoFischer</td><td>B04955</td><td></td></tr><tr><td>酪胺-AF647</td><td>ThermoFischer</td><td>B04958</td><td></td></tr></tbody></table>

多重免疫荧光结合空间图像分析用于肿瘤微环境的临床与生物学评估

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

肿瘤微环境（TME）由多种不同类型的细胞组成，例如细胞毒性免疫细胞和免疫调节细胞。根据其组成以及癌细胞与肿瘤周围细胞之间的相互作用，肿瘤微环境可能影响癌症的进展。对肿瘤及其复杂微环境的特征进行表征，有助于加深对癌症疾病的理解，并可能帮助科研人员和临床医生发现新的生物标志物。
我们近期开发了基于酪胺信号放大技术（TSA）的多种多重免疫荧光（mIF）检测面板，用于表征结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤和肺癌的肿瘤微环境（TME）。在完成相应检测面板的染色和扫描后，样本将通过图像分析软件进行分析。随后，每个细胞的空间位置及其染色信息将从该定量软件导出至R语言环境中。我们开发的R语言脚本不仅能够分析各肿瘤区室（例如肿瘤中心、肿瘤边缘和间质）中每种细胞类型的密度，还可对不同类型细胞之间进行基于距离的分析。
该特定工作流程为已常规用于多种标志物的经典密度分析增加了空间维度。多重免疫荧光（mIF）分析可帮助科学家更好地理解癌细胞与肿瘤微环境（TME）之间复杂的相互作用，并发现对治疗（如免疫检查点抑制剂和靶向治疗）反应的新预测性生物标志物。

按照本方案，应考察多个参数以确保组织染色正确。首先，使用较短曝光时间（通常为 2–100 ms）进行扫描时，TSA 染色应表现出良好的动态范围。较短的曝光时间表明 HRP 反应中的信号放大过程已正确完成。对于使用荧光染料直接偶联的二抗所标记的抗原，其曝光时间可能更长，这可能导致光漂白（因曝光时间过长而导致信号强度下降）。其次，需确认每种染色均具有较高的信噪比（SNR）。若背景信号较高而抗原信号较弱，可能提示一抗特异性不足、内源性过氧化物酶未完全灭活，或方案中某一操作步骤未正确执行。第三，根据所使用的切片扫描仪及扫描滤光片组，可能会出现两种颜色之间的信号重叠（例如 AF555、AF594 和 AF647）。选择合适的扫描仪滤光片组以及适当的一抗稀释度，对于避免可能的交叉检测至关重要。质量控制包括在扫描图像中识别每种标记物的单染细胞。最后，每批染色实验还应设置阳性和阴性对照。对于免疫细胞，扁桃体是良好的阳性对照。最优染色的代表性结果如图 1所示。
<img alt="多重免疫荧光显微镜；组织样本中蛋白质标志物的低/高倍镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65220/65220fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：通过多重免疫荧光染色的局部晚期直肠癌组织。 缩写：PD-1 = 程序性死亡蛋白 1；PD-L1 = 程序性死亡配体 1；ROR-γ = 视黄酸受体相关孤儿受体 gamma；CD3 = 分化簇 3；hPanCK = 人广谱细胞角蛋白。每种抗原染色均以灰度扫描，图中显示的颜色为伪彩色。低倍镜比例尺：200 µm；高倍镜比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65220/65220fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="荧光染色，AI细胞核分割，显微镜图像，细胞检测分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65220/65220fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：使用图像分析软件对局部晚期直肠癌进行细胞核与染色检测。 若未正确设置完整性百分比参数，软件会因两个CD8+细胞彼此靠近而将其识别为两个细胞（绿色圆圈），但实际上仅有一个细胞被染色。采用70%的完整性阈值可避免此类假阳性检测。绿色 = hPanCK；黄色 = CD3；橙色 = CD8。比例尺：100 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65220/65220fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="多重免疫荧光、图像分析和R点图；用于细胞荧光分析的显微镜实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65220/65220fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：肝转移性结直肠癌的图像分析与R点图重建。 在多重染色图像（左）中，人广谱细胞角蛋白呈黄色，CD3呈绿色，CD8呈浅蓝色，IDO呈橙色。在点图（右）中，人广谱细胞角蛋白阳性细胞呈黄色，CD3阳性CD8阴性细胞呈绿色，CD3阳性CD8阳性细胞呈蓝色，IDO阳性细胞呈橙色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65220/65220fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="组织切片的组织学分析；显微图像显示结构及分割结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65220/65220fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4头颈部鳞状细胞癌手术切片的分析. (A) 一例头颈部鳞状细胞癌的手术切片。癌细胞以绿色显示。肿瘤岛周围的间质细胞围绕着肿瘤细胞团（CD3 以黄色显示，CD8 以紫色显示）。B) 肿瘤中心（黄色区域，黑色边框）通过基于单个区域内肿瘤岛之间距离的 k 近邻算法，以生物信息学方法计算获得。在该区域周围，侵袭性边缘（浅黄色区域，灰色边框）则根据任意设定的范围计算得出 500 µm 基础。C肿瘤中心的浸润性T细胞以黑色圆点标示，侵袭边缘的浸润性T细胞以灰色圆点标示，其他T细胞以浅绿色圆点标示。比例尺：1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65220/65220fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞密度（IHF）数据、z分数分析、患者聚类、免疫荧光的热图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65220/65220fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：局部进展期直肠癌活检组织中不同细胞类型密度的热图。 该热图通过ComplexHeatmap软件包对来自不同多重检测面板的各类细胞密度进行无监督聚类绘制而成。归一化过程中采用了缩放与中心化处理。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65220/65220fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤细胞分布分析；距离直方图；空间细胞分布图；IDO+ 细胞定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65220/65220fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：CD4+ 和 CD8+ 细胞与每个 IDO+ 或肿瘤细胞之间的距离。 人全角蛋白+ 细胞显示为黄色，CD3+CD8− 细胞显示为绿色，CD3+CD8+ 细胞显示为蓝色，IDO+ 细胞显示为橙色。（A）肿瘤细胞与每个 CD8+ T 细胞之间的最近距离。（B）IDO+ 细胞与每个 CD8+ T 细胞（蓝色）或 CD4+ T 细胞（绿色）之间距离的柱状图。（C）通过 G-交叉函数分析的样本示例。纵轴显示肿瘤细胞在其周围 0–200 µm 半径范围内遇到 CD3+ 淋巴细胞的概率。图中显示三条曲线：虚线绿色为理论曲线（泊松分布），实线黑色为经 km 校正的实测曲线，虚线红色为经边界校正的实测曲线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65220/65220fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="活检分析流程：细胞分布的点图、边界计算和四分格计数示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65220/65220fig07v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：四分格计数示意图。 边界计算和四分格计数使用 spatstats 软件包完成。浸润程度最高的方格（热点区域）可用于后续统计分析。CD4 标记为绿色，CD8 标记为红色，肿瘤细胞标记为黄色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65220/65220fig07largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用抗PD-1 pH6/9抗体进行免疫组织化学染色的结果；稀释梯度为1/400至1/100；棕褐色染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65220/65220fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8：抗体稀释与抗原修复条件优化。 使用三种不同稀释比例的一抗以及两种不同的抗原修复液（柠檬酸盐缓冲液 pH 6 和 EDTA缓冲液 pH 9）对PD-1进行显色检测。比例尺：50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65220/65220fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>一抗</td>
			<td>稀释倍数</td>
			<td>抗原修复</td>
			<td>二抗</td>
			<td>荧光染料</td>
			<td>通道位置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-1</td>
			<td>1/100</td>
			<td>EDTA (pH 9)</td>
			<td>抗兔</td>
			<td>AF647</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-L1</td>
			<td>1/1000</td>
			<td>EDTA (pH 9)</td>
			<td>抗兔</td>
			<td>AF488</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROR-γ</td>
			<td>1/200</td>
			<td>EDTA (pH 9)</td>
			<td>抗鼠</td>
			<td>ATT0-425</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>1/100</td>
			<td>柠檬酸盐 (pH 6)</td>
			<td>抗兔</td>
			<td>AF555</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPanCK</td>
			<td>1/50</td>
			<td>柠檬酸盐 (pH 6)</td>
			<td colspan="2">与 AF750 偶联的抗鼠二抗</td>
			<td>5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：优化的多重检测面板示例。 缩写：PD-1 = 程序性死亡蛋白1；PD-L1 = 程序性死亡配体1；ROR-γ = 视黄酸相关孤儿受体γ；CD3 = 分化簇3；hPanCK = 人全角蛋白；AF = AlexaFluor；EDTA = 乙二胺四乙酸。CD3用于检测T淋巴细胞；PD-1用于检测耗竭型淋巴细胞；ROR-γ用于检测Th-17细胞；hPanCK用于检测肿瘤细胞。位置列指示顺序多重染色的执行顺序。

本文介绍了一种手动酪胺信号放大（TSA）多重免疫荧光（mIF）染色结合图像分析与空间分析的实验方案。该方案可用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，每张切片可检测两至六种抗原，具体数量取决于实验室所配备的切片扫描仪。

肿瘤微环境（TME）由多种不同类型的细胞组成，例如细胞毒性免疫细胞和免疫调节细胞。根据……

在我们的实验室中，我们正在研究人类结直肠癌、其向转移性疾病的进展过程以及其对包括免疫治疗在内的各种治疗手段的反应。我们通过研究原发性和转移性病变中的肿瘤免疫微环境及瘤内微生物组，试图寻找新的预测性和预后性生物标志物。在当前的项目中，我们正在应用多种技术，包括RNA测序、全外显子组测序、TCR测序、循环游离DNA分析、免疫荧光以及荧光原位杂交。目前，我们的主要挑战是将荧光原位杂交染色与酪胺信号放大多重免疫荧光技术相结合，以研究微生物组与免疫细胞之间的相互作用。我们的方法具有稳健性、可重复性、易于使用且成本效益高。任何配备荧光切片扫描仪的实验室均可建立该方法；此外，与通常仅针对有限抗原组合优化的商业化试剂盒不同，该方法可与任何市售的免疫组化抗体联合使用。进行多重免疫荧光染色前，先固定组织并进行脱蜡和内源性过氧化物酶抑制。随后进行多重免疫荧光染色时，将切片浸入含有10毫摩尔柠檬酸缓冲液（含0.1% Triton X-100）的300毫升染色缸中。将染色缸盖上盖子放入微波炉中，以最大功率加热3至5分钟，直至缓冲液开始沸腾。煮沸后，将微波炉调至低功率加热15分钟，使缓冲液保持接近沸腾的温度。再次将微波炉调至最大功率，加热90秒。从微波炉中取出烧杯，让缓冲液在室温下冷却15分钟。将载玻片用蒸馏水冲洗三次，每次五分钟，随后用含有0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBS Tween）冲洗五分钟。最后一次洗涤后，用纸巾轻压载玻片以吸除TBS Tween。接着，将载玻片放置于显微镜载玻片盒上，并用疏水笔在组织周围画圈。用含5% BSA的TBS Tween溶液覆盖组织以封闭非特异性结合位点。30分钟后，将切片在纸巾上轻轻吸干以去除封闭液。随后，加入300 µL用1% BSA TBS Tween稀释的一抗溶液，室温孵育60分钟。孵育后，用TBS Tween缓冲液将切片冲洗三次，每次三分钟。洗涤后，加入300 µL多聚-HRP二抗，孵育40分钟。孵育结束后，再次用TBS Tween缓冲液将切片冲洗三次，每次三分钟。接下来，将组织与300微升荧光素酪胺试剂在硼酸盐缓冲液中孵育10分钟，该试剂需临时用含0.003%过氧化氢的硼酸盐缓冲液稀释200倍。然后用TBS Tween缓冲液洗涤切片三次，再将组织在4摄氏度下与人广谱细胞角蛋白抗体在含1% BSA的TBS Tween缓冲液中4℃过夜孵育。次日，用TBS Tween缓冲液冲洗组织，随后在含1% BSA的TBS Tween缓冲液中加入稀释200倍的荧光素标记二抗，孵育120分钟。孵育后，用TBS Tween缓冲液冲洗组织，然后将组织在含10% BSA的TBS Tween缓冲液中加入稀释1000倍的双苯并咪唑染核5分钟。用蒸馏水冲洗组织三次，每次三分钟，随后使用荧光封片剂和硼硅酸盐盖玻片将组织封片。进行图像分析时，将扫描图像导入图像分析软件。然后转到“分析”选项卡，通过点击“设置”、“操作”，然后选择“加载”，来选用高重荧光算法。在“染料选择”选项卡中，选择目标染料。在“核检测”选项卡中，进入“核分割类型”，选择“AI 自定义”。然后在核分割分类器中，选择已保存的训练好的人工智能模型。在膜和细胞质检测选项卡中，选择最大的细胞质半径以及膜染料的数量。针对每种染料，选择细胞核阳性阈值、细胞质阳性阈值和膜阳性阈值。针对每种染料，选择细胞核、膜和细胞质的完整性百分比值。通过选择“设置”、“操作”和“保存”来保存算法。通过点击“分析”并选择“标注层”来分析感兴趣区域。然后转到“结果”选项卡，选择“对象数据”中的所有数据。通过右键单击“导出”并选择“对象数据 CSV”，以 CSV 格式导出数据。图中显示了多重免疫荧光染色的最佳结果示例。选择正确的稀释比例对于验证抗体特异性以及优化染色的信噪比至关重要。

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