Name: 牙髓干细胞的原代培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 45 s
Description: 学习利用外植体培养法从牙髓组织中分离原代牙髓干细胞，建立均一细胞群用于组织再生研究。该方法可推进颅颌面重建及骨缺损修复的再生医学应用。

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我们感谢印度政府卫生研究部（DHR）、印度医学研究理事会（ICMR）对AK的资助支持（DHR-NRI项目编号：R.12015/01/2022-HR）。SR获得了印度政府ICMR的资助（项目编号：2020-7593/SCR-BMS），PS获得了印度政府科学与工业研究理事会（CSIR）的奖学金资助。我们还感谢Sandhya Tokhi女士和Bhupinder Kaur女士在流式细胞术方面的协助，以及中央高级仪器中心（CSIC）和昌迪加尔PGIMER提供的基础设施支持。

Establishing the Primary Culture of Dental Pulp Stem Cells

<ol><li>Bhattacharyya, S., Kumar, A., Lal Khanduja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+voyage+of+stem+cell+toward+terminal+differentiation%3A+a+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">The voyage of stem cell toward terminal differentiation: a brief overview.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 44 (6), 463-475 (2012).</li>
<li>Prentice, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells.</a> Circulation Research. 124 (6), 837-839 (2019).</li>
<li>Raik, S., Kumar, A., Bhattacharyya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+cell-free+therapeutic+approach%3A+Role+of+stem+cell+%26%2334%3Bsoup-ernatant%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into cell-free therapeutic approach: Role of stem cell &#34;soup-ernatant&#34.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (2), 104-118 (2018).</li>
<li>Rodriguez-Fuentes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+current+clinical+applications%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells current clinical applications: a systematic review.</a> Archives of Medical Research. 52 (1), 93-101 (2021).</li>
<li>Yamazaki, K., Kawabori, M., Seki, T., Houkin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trials+of+stem+cell+treatment+for+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clinical trials of stem cell treatment for spinal cord injury.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3994(2020).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+spectrum+of+secretome+regulates+the+relative+hepatogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow+and+dental+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15015(2017).</li>
<li>Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+cues+modulate+the+neurogenic+potential+of+bone+marrow+and+dental+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells.</a> Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).</li>
<li>Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+proteins+regulate+comparative+osteogenic+and+adipogenic+potential+in+bone+marrow+and+dental+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Secretome proteins regulate comparative osteogenic and adipogenic potential in bone marrow and dental stem cells.</a> Biochimie. 155, 129-139 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Bhattacharyya, S., Rattan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+uncontrolled+freezing+on+biological+characteristics+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Effect of uncontrolled freezing on biological characteristics of human dental pulp stem cells.</a> Cell Tissue Bank. 16 (4), 513-522 (2015).</li>
<li>Raik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+post-thaw+quality+of+dental+mesenchymal+stromal+cells+after+long-term+cryopreservation+by+uncontrolled+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Assessment of post-thaw quality of dental mesenchymal stromal cells after long-term cryopreservation by uncontrolled freezing.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (2), 728-743 (2020).</li>
<li>Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+human+dental+pulp+stem+cells+%28DPSCs%29+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).</li>
<li>Tsutsui, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells%3A+advances+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Cloning%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells: advances to applications.</a> Stem Cells and Cloning. 13, 33-42 (2020).</li>
<li>Huang, G. T. -J., Gronthos, S., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+dental+tissues+vs.+those+from+other+sources%3A+their+biology+and+role+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine.</a> Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).</li>
<li>La Noce, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells%3A+state+of+the+art+and+suggestions+for+a+true+translation+of+research+into+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dentistry%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells: state of the art and suggestions for a true translation of research into therapy.</a> Journal of Dentistry. 42 (7), 761-768 (2014).</li>
<li>Xiao, L., Tsutsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+dental+pulp+cells-derived+spheroids+in+serum-free+medium%3A+stem+cells+in+the+core%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of human dental pulp cells-derived spheroids in serum-free medium: stem cells in the core.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2624-2636 (2013).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
<li>Gandia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells+improve+left+ventricular+function%2C+induce+angiogenesis%2C+and+reduce+infarct+size+in+rats+with+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction.</a> Stem Cells. 26 (3), 638-645 (2008).</li>
<li>Yong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+angiogenic+ability+between+SHED+and+DPSC+in+a+mice+model+with+critical+limb+ischemic%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of the angiogenic ability between SHED and DPSC in a mice model with critical limb ischemic.</a> Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (4), 861-870 (2022).</li>
<li>Zhang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+dental+pulp+stem+cell+transplantation+in+a+rat+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of dental pulp stem cell transplantation in a rat model of Alzheimer's disease.</a> Neural Regeneration Research. 16 (5), 893-898 (2021).</li>
<li>Kabir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imperative+role+of+dental+pulp+stem+cells+in+regenerative+therapies%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nigerian+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Imperative role of dental pulp stem cells in regenerative therapies: a systematic review.</a> Nigerian Journal of Surgery. 20 (1), 1-8 (2014).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cell+secretome+ameliorates+d-galactose+induced+accelerated+aging+in+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Function%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cell secretome ameliorates d-galactose induced accelerated aging in rat model.</a> Cell Biochemistry and Function. 40 (5), 535-545 (2022).</li>
<li>Hirata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+therapeutic+benefits+of+factors+derived+from+dental+pulp+stem+cells+for+mouse+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multifaceted therapeutic benefits of factors derived from dental pulp stem cells for mouse liver fibrosis.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1416-1424 (2016).</li>
<li>Fujii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regeneration+by+human+dental+pulp+stem+cells+using+a+helioxanthin+derivative+and+cell-sheet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">regeneration by human dental pulp stem cells using a helioxanthin derivative and cell-sheet technology.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 24(2018).</li>
<li>Ferrua, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+has+dental+pulp+stem+cells+isolation+been+conducted%3F+A+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Oral+Research%22%5BJournal%5D)">How has dental pulp stem cells isolation been conducted? A scoping review.</a> Brazilian Oral Research. 31, e87(2017).</li>
<li>Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation%2C+amplification+and+characterization+of+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biologica%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells.</a> Folia Biologica. 65 (3), 124-133 (2019).</li>
<li>Tatullo, M., Marrelli, M., Shakesheff, K. M., White, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells%3A+function%2C+isolation+and+applications+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells: function, isolation and applications in regenerative medicine.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 1205-1216 (2015).</li>
<li>Hilkens, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+isolation+methodology+on+stem+cell+properties+and+multilineage+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).</li>
<li>Hendijani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture%3A+An+advantageous+method+for+isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues.</a> Cell Proliferation. 50 (2), e12334(2017).</li>
<li>Aryal Ac, S., Islam, M. S., Samsudin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+effect+of+a+time+delay+on+the+characteristics+and+survival+of+dental+pulp+stem+cells+from+extracted+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the effect of a time delay on the characteristics and survival of dental pulp stem cells from extracted teeth.</a> Archives of Oral Biology. 119, 104896(2020).</li>
<li>Langenbach, F., Handschel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dexamethasone%2C+ascorbic+acid+and+%CE%B2-glycerophosphate+on+the+osteogenic+differentiation+of+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effects of dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate on the osteogenic differentiation of stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, 117(2013).</li>
<li>Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+purified%2C+culture-expanded+human+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 64 (2), 295-312 (1997).</li>
<li>Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+alizarin+red+S+assay+by+enhancing+mineralization+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimization of the alizarin red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (1), 723(2022).</li>
<li>Coe, C. L., Lubach, G. R., Schneider, M. L., Dierschke, D. J., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+rearing+conditions+alter+immune+responses+in+the+developing+infant+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early rearing conditions alter immune responses in the developing infant primate.</a> Pediatrics. 90, 505-509 (1992).</li>
<li>Bakopoulou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+impact+of+two+different+isolation+methods+on+the+osteo%2Fodontogenic+differentiation+potential+of+human+dental+stem+cells+derived+from+deciduous+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth.</a> Calcified Tissue International. 88 (2), 130-141 (2011).</li>
<li>Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+dental+pulp+stem+cells+differentiate+toward+functionally+active+neurons+under+appropriate+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues.</a> Stem Cells. 26 (7), 1787-1795 (2008).</li>
<li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic%2Fcementoblastic+and+neural+differentiation+of+dental+stem+cells+and+their+applications+to+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 235-244 (2012).</li>
<li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+C+terminus+of+CaV1.2+channels+plays+a+crucial+role+in+the+neural+differentiation+of+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distal C terminus of CaV1.2 channels plays a crucial role in the neural differentiation of dental pulp stem cells.</a> PLoS One. 8 (11), e81332(2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何财务或非财务利益冲突。

干细胞因其可塑性、强健性、免疫调节特性、旁分泌机制和归巢效率，被寄予治愈多种疾病的厚望。牙髓组织被认为是干细胞最有效且最有价值的来源，具有显著的可塑性和再生能力。本文中，我们展示了利用广泛采用的组织块培养法分离牙髓干细胞（DPSCs）的方法，其中细胞从牙髓组织碎片或组织块中迁移出来，生长为形态上类似纺锤形成纤维细胞样细胞的均一细胞培养物。组织块法能够获得更均一的DPSCs培养物，避免了内皮细胞和周细胞等其他细胞类型的残留，而这些细胞在酶消化法建立DPSCs培养过程中仍会存在34。我们证明，通过组织块法获得的DPSCs表达国际细胞治疗学会（ISCT）推荐的间充质细胞表面CD标志物，如CD90、CD73和CD105；同时不表达CD45、CD34和HLA-DR标志物，表明DPSCs培养物具有较高的均一性和纯度。HLA-DR的缺失也使其适用于移植用途，排斥反应的可能性极低。本实验方案中有若干关键步骤，以确保DPSCs培养的效率和纯度：组织块在放入培养板前应至少用PBS洗涤四次，以避免任何可能的污染；组织块必须牢固贴附于培养孔表面，因为脱落的组织块不会产生细胞。因此...

成体干细胞因其可塑性、旁分泌机制和免疫调节特性，已成为细胞定向治疗和疗法中一种强大的治疗工具1,2,3干细胞相关临床前研究取得的鼓舞人心的数据，激励着研究人员致力于将研究成果从实验室推向临床应用。用于干细胞治疗的干细胞类型在治疗效果中起着至关重要的作用。在临床前和临床研究中，间充质干细胞（MSCs）最主要的来源仍是骨髓4,5。然而，主要缺点在于&#160;使用骨髓来源的干细胞（BMSCs）存在一些局限性，包括其细胞数量稀少、分离过程具有高度侵入性以及扩增能力有限。因此，研究人员正在探索间充质干细胞（MSCs）的其他替代来源。在此背景下，牙源性组织因其易于获取、具有极强的可塑性、较高的再生潜能和强大的增殖能力，现已被认为是干细胞的一种丰富且具有潜力的替代来源。6,7,8,9,10.
牙髓干细胞（DPSCs）是 Gronthos 于 2000 年首次分离并鉴定的一类牙源性干细胞11牙髓干细胞因其高增殖率、显著的分化潜能、易于获取和培养，以及最重要的是可从废弃牙齿中获取而无需担忧伦理问题，已引起组织工程应用领域的广泛关注。12.&#160;牙髓干细胞（DPSCs）克服了其他干细胞来源（如骨髓间充质干细胞和脂肪来源干细胞）在分离过程及自我更新能力方面的局限性13人类DPSCs可来源于人类的乳牙、恒牙、智齿、脱落的乳牙（SHEDs）以及根尖乳头。此外，DPSCs也可从通常被丢弃的额外牙中分离获得14DPSCs 表达神经嵴相关标志物，并具有分化为神经元细胞的潜能 体外 和 体内15除了具有神经源性潜能外，在特定诱导条件下，牙髓干细胞（DPSCs）还可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞和肌细胞等其他细胞谱系。13因此，这些多能细胞在细胞治疗领域具有广阔的应用前景，可用于多种组织的再生。研究还报道了牙髓干细胞（DPSCs）在角膜重建中的潜在作用。16心肌梗死的修复17及其在肢体缺血等疾病中的潜在治疗作用18，阿尔茨海默病 19帕金森病 20，以及衰老21因此，牙源性干细胞不仅可用于牙齿再生，还可用于眼睛等非牙源性器官的修复与再生16心脏17肝脏22，骨骼23 等等。
从牙髓组织中分离MSC群体有两种特定方法——&#160;酶消化法和组织块培养法24,25。已有报道称，这两种方法均能成功建立原代培养，且在DPSC的数量和特性方面无显著差异26。本研究重点采用组织块法分离DPSCs27，因为与酶消化法相比，该方法获得的DPSCs不会受到造血细胞和内皮细胞的污染，而酶消化法可能导致成纤维细胞污染28。

<table><tbody><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>阿利新蓝染色液</td><td>EZstain 软骨细胞染色试剂盒，HiMedia</td><td>CCK029</td><td></td></tr><tr><td>茜素红 S 染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-008</td><td>成骨染色</td></tr><tr><td>抗生素混合液</td><td>Himedia</td><td>A002-5X50ML</td><td>防止培养污染</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Himedia</td><td>TC094-25G</td><td>软骨诱导</td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>用于神经诱导</td></tr><tr><td>bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）</td><td>Gibco</td><td>PHG0024</td><td>用于神经诱导</td></tr><tr><td>CD 105</td><td>BD-Pharmingen</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>CD 35</td><td>Biolegend</td><td>343604</td><td></td></tr><tr><td>CD 45</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td></td></tr><tr><td>CD 73</td><td>Biolegend</td><td>344016</td><td></td></tr><tr><td>CD 90</td><td>Biolegend</td><td>328107</td><td>表征分析</td></tr><tr><td>十六烷基吡啶氯化物（CPC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1104006</td><td>用于茜素红提取</td></tr><tr><td>地塞米松 21-磷酸二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1159-100MG</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Himedia</td><td>TS1006-5L</td><td>用于洗涤</td></tr><tr><td>EGF（表皮生长因子）</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>用于肝细胞和神经&amp;nbsp;诱导</td></tr><tr><td>EVOS LED 显微镜</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>用于&amp;nbsp;荧光成像</td></tr><tr><td>EZ stain 软骨细胞染色试剂盒</td><td>Himedia</td><td>CCK029-1KT</td><td>软骨染色试剂盒</td></tr><tr><td>FACS Canto 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>用于细胞表征</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>用于原代培养</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>G5 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17503012</td><td>用于神经诱导</td></tr><tr><td>HGF（肝细胞生长因子）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1404</td><td>用于肝细胞诱导</td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>Biolegend</td><td>307605</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;人 TGF-&amp;beta;3</td><td>Peprotech</td><td>#100-36E-10U</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸预混液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td>用于肝细胞诱导</td></tr><tr><td>ITS 预混液</td><td>Corning</td><td>354350</td><td></td></tr><tr><td>LDL 摄取检测试剂盒</td><td>Abcam</td><td>ab133127</td><td>用于肝细胞表征</td></tr><tr><td>低糖 DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td>用于肝细胞诱导</td></tr><tr><td>MAP2 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4403</td><td>用于神经表征</td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>用于神经诱导</td></tr><tr><td>神经基础培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>用于神经诱导</td></tr><tr><td>NFM 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4142</td><td>用于神经表征</td></tr><tr><td>Nikon Elipse TS100 显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于&amp;nbsp;荧光成像</td></tr><tr><td>油红 O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01391-250Ml</td><td>脂肪染色</td></tr><tr><td>抑癌素 M</td><td>R&amp;D Systems</td><td>295-OM-010/CF</td><td>用于肝细胞诱导</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Tarson</td><td>460090-90MM</td><td>用于组织切割</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15655-100G</td><td>成骨诱导</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q13827</td><td>用于油红 O 提取</td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液</td><td>Sigma life sciences</td><td>S8636-100ML</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>用于细胞传代</td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>merck</td><td>WHA1001325</td><td>滤纸</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-最低必需培养基（&amp;alpha;-MEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643-10X 1L</td><td>原代培养用培养基</td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

牙髓干细胞的原代培养

Primary Culture of Dental Pulp Stem Cells

人牙髓是一种具有优异再生能力的多能干细胞资源库，可从拔除的牙齿中获取。牙髓干细胞（DPSCs）起源于神经嵴来源的外间充质组织，具有高度可塑性，这使其在组织修复与再生中具备多重优势。目前，研究人员正在探索多种获取、维持和扩增成体干细胞的实用方法，以用于再生医学领域。本研究中，我们展示了通过组织块培养法从牙源组织建立原代间充质干细胞培养体系的过程。所分离的细胞呈纺锤形，并贴附于培养板的塑料表面。对这些干细胞的表型鉴定显示，其高表达国际细胞治疗学会（ISCT）推荐的间充质干细胞表面标志物，如CD90、CD73和CD105。此外，造血细胞标志物（CD45）和内皮细胞标志物（CD34）几乎不表达，HLA-DR标志物的表达低于2%，证实了DPSC培养物的均一性与纯度。我们进一步通过诱导其向成脂、成骨和成软骨方向分化，验证了其多向分化潜能。同时，通过添加相应的诱导刺激培养基，我们还成功诱导这些细胞分化为类肝细胞和类神经元细胞。该优化后的实验方案有助于在实验室中培养出可高度扩增的间充质干细胞群体，可用于基础研究或临床前研究。类似的方案也可整合至临床操作体系中，用于开展基于DPSC的治疗实践。

在此，我们介绍研究人员如何建立牙髓干细胞（DPSCs）的纯培养体系 通过 外植体法6,7,8,9,10 并诱导其向多个谱系分化，以确定培养物的纯度，用于后续应用。
我们建立了源自患者第三磨牙牙髓小块组织的牙髓干细胞（DPSCs）原代培养，如图所示 图1A最初，在组织块接种后的第四和第五天，仅在组织块或组织周围观察到极少数的圆形细胞。然而，到第12天th 天，从组织块中迁移出的细胞数量增加，至第二周末（14th-16th 第几天时，大部分外植块周围已出现大量具有纺锤形形态的贴壁细胞。此时可将外植块从培养板中移除，继续在完...

本文提供了利用组织块培养法建立牙髓干细胞原代培养的逐步操作指南，并依据ICSCRT指南对这些细胞进行表征。通过本方案分离获得的细胞可被视为间充质干细胞，用于后续应用。

人牙髓是一种极具潜力的多能干细胞库，具有卓越的再生能力，可从一种...中获取

我们正在研究DPCs在基于细胞和无细胞的疾病模型中的应用潜力，同时探讨组织再生过程中涉及的细胞与分子机制。此外，我们正在探索干细胞来源的安全因子在调控干细胞命运和促进组织再生中的作用。目前的研究重点是利用3D培养技术，深入理解与组织再生相关的分子机制、遗传及表观遗传变化。我们正在整合下一代测序、RNA测序和染色质免疫沉淀测序等先进技术，以揭示调控多种细胞过程的功能区域。利用组织块法分离真皮乳头细胞（DPC），可高效地获得纯一的干细胞群体，避免内皮细胞和周细胞等其他细胞类型的污染。而采用酶消化法建立DPC时，这些细胞类型会残留在细胞培养物中。我们以DPCs作为细胞模型开展药物染色和组织再生研究，有望开发出新型治疗方法，推动个体化医学的发展，并在再生医学领域产生深远影响，包括颅面重建以及牙体拔除后的宝贵骨组织再生。目前，我们正在研究DPCs在修复长骨和颅骨缺损等骨缺损中的应用。此外，我们还在探索DPCs分泌分子在多种疾病模型中的潜在治疗作用，包括神经再生和胰高血糖素相关研究。首先，用无菌生理盐水冲洗提取的牙齿，以去除任何血液。在用无菌生理盐水冲洗的同时，使用碳化钨裂钻小心地将牙齿纵向切割成两部分。随后，将牙齿及其完整的牙髓置于冰上的无菌α-MEM培养基中，运送至细胞与组织培养实验室，然后将提取的牙齿样本放入无菌培养皿中，并用无菌PBS彻底冲洗三到四次。使用锋利的挖匙和镊子，小心地取出根管内的牙髓组织，并用无菌 PBS 彻底冲洗以去除血迹。接着将培养皿表面分为四个区域，每个区域加入一到两毫升无菌 PBS。将牙髓组织样本置于其中一个区域，用手术刀将其切成小块。用PBS将组织块逐次转移至不同区域。同时，在六孔板中加入约0.8至1毫升含非必需氨基酸、10% FBS及抗生素混合液的α-MEM培养基，并轻轻晃动使培养基均匀分布。图中展示了牙髓干细胞原代培养的不同阶段。从第二天开始，可观察到牙源组织中出现圆形气泡样细胞。第四天时，可见细胞从组织中伸出，形成网状结构。然而，到第13天时，从组织块中迁移出的细胞数量增加，至第二周结束时，大多数组织块周围均被大量具有纺锤形形态的贴壁细胞所包围。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外...

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

我们提供了基于直接和间接共培养方法评估牙髓来源间充质干细胞与前列腺癌细胞相互作用的实验方案。使用条件培养基和Transwell小室膜适用于分析间接的旁分泌作用。将不同染色的细胞共同接种是研究直接细胞间相互作用的合适模型。...

从牙髓组织中分离间充质干细胞并与癌细胞共培养以研究其相互作用

本文介绍了一种人牙髓干细胞的分离与扩增方案，旨在评估朊蛋白在神经元分化过程中的表达情况。...

人牙髓干细胞的分离、扩增及神经元分化过程中朊蛋白表达

本方案重点介绍通过酶消化法从牙髓中分离、培养和保存多能干细胞的方法。此外，还展示了这些细胞向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能，强调了操作过程中精确性和一致性的关键作用。...

从人类乳牙和恒牙中分离、培养及鉴定牙髓干细胞

本方案演示了如何维持健康且未分化的人类胚胎干细胞（ES细胞）。...

人类胚胎干细胞的培养与维持

原代肝细胞为在生理相关的实验体系中评估生化、分子及代谢功能提供了有价值的工具。本文描述了一种可靠的大鼠原位肝脏灌注方案，该方法可稳定地从每次制备中获得高达 1.0 × 108 个细胞的肝细胞，细胞活力维持在 88 ~ 96%...

大鼠肝细胞的分离与原代培养

本文描述了一种在多种细胞类型中诱导上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）的简便方法，并包含了通过免疫细胞化学分析处于EMT状态细胞的方法。...

上皮间质转化的诱导与分析

本文介绍了一种从小鼠胰腺中快速、便捷地分离和培养原代胰腺腺泡细胞的方法。该方法为研究新鲜原代正常/未转化的外分泌胰腺细胞的生理学特性提供了一种有价值的途径。...

小鼠原代胰腺腺泡细胞的分离与培养

本文详细介绍了一种利用组织切片机在下颌骨切片中培养牙胚的方法。该方法能够在牙齿发育过程中对其进行独特地观察和干预，为操作和谱系示踪提供了极佳的机会，而这些优势是传统培养方法所无法实现的。...

切片培养法用于观察牙胚在器官培养中的发育过程

分离和培养静息状态的卫星细胞（一种肌肉干细胞群体）的纯细胞群体，对于理解肌肉干细胞生物学与再生机制，以及用于杜氏肌营养不良症和其他退行性疾病的干细胞移植治疗至关重要。...

肌肉卫星细胞的分离、培养与移植

学习利用外植体培养法从牙髓组织中分离原代牙髓干细胞，建立均一细胞群用于组织再生研究。该方法可推进颅颌面重建及骨缺损修复的再生医学应用。

牙髓干细胞的原代培养

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