Name: 小鼠背根神经节冷冻切片的程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 20 s
Description: 学习小鼠背根神经节冷冻切片技术，掌握获取高质量完整平整切片的详细步骤。该方法使用OCT包埋和冷冻切片技术，适用于神经科学和免疫组织化学研究，帮助研究人员获得可靠的DRG组织切片用于后续实验分析。

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本研究的动物实验已获得加州大学旧金山分校（UCSF）动物照护与使用委员会的批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护与使用指南》进行。实验中使用成年、8至12周龄的C57BL/6雄性和雌性小鼠（本单位繁育）。
1. 背根神经节样本制备
<ol>
	<li>用2.5%阿佛丁（Avertin）麻醉小鼠（见材料表）。通过检测对疼痛刺激无反应来确认麻醉充分。如前所述，经心脏灌注1×磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注4%甲醛14,15,16。</li>
	<li>如前所述，从小鼠脊髓中解剖背根神经节（DRG）组织14,15,16。</li>
	<li>将解剖得到的DRG在4%甲醛中室温后固定3小时。</li>
	<li>将DRG置于含30%蔗糖的PBS溶液中，4 °C过夜。</li>
	<li>制备最佳切割温度（OCT）包埋基底
	<ol>
		<li>将OCT包埋剂（见材料表）加入铝块表面，覆盖其顶部，于-20 °C冷冻5–10分钟（图1A）。</li>
		<li>使用冷冻切片机（见材料表）以30 µm厚度切去OCT顶部，直至其表面与基底OCT齐平（图1B）。</li>
		<li>在从冷冻切片机取下铝块前，在基底OCT底部（六点钟位置）做一标记，以指示其方向（图1C）。</li>
		<li>在后续步骤中，始终保持该标记位于六点钟位置，以维持相同方向，从而获得更多的DRG切片。 
		注意：若方向丢失，导致DRG样本以不同角度被切割，则无法自上而下完整切完DRG样本，部分样本将残留在基底OCT上而被浪费，因为在尝试切取DRG时会遇到基底OCT的阻碍（图1C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行DRG的OCT包埋
	<ol>
		<li>在将DRG放置于OCT前，需将其干燥。
		<ol>
			<li>在将DRG置于铝块前，务必去除样本周围的30%蔗糖/PBS溶液。</li>
			<li>将DRG样本置于干燥的培养皿上（图2A），用干燥镊子将其在培养皿内移动两到三次以干燥（图2B）。</li>
			<li>在处理下一个DRG样本前，用无绒纸巾擦干镊子（图2C）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将干燥的DRG置于基底OCT上。
		<ol>
			<li>用干燥镊子将干燥的DRG置于基底OCT的12点钟位置（图1D）。</li>
			<li>确保DRG上缘与基底OCT上缘之间至少保留5 mm距离。</li>
			<li>将DRG的背侧置于12点钟位置，腹侧置于六点钟位置（图1D）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用OCT包埋DRG组织。
		<ol>
			<li>加入更多OCT，将整个DRG样本覆盖成圆形或椭圆形，确保DRG位于中央（图1E）。</li>
			<li>确保覆盖OCT的上缘与基底OCT的上缘齐平（图1F），这有助于将切片转移至载玻片上（图3A）。 
			注意：若覆盖OCT位于基底OCT中央，则基底OCT的上缘会阻碍载玻片收集切片（图3B）。</li>
			<li>将覆盖OCT及DRG样本再次于-20 °C冷冻5分钟（图1G）。切勿修剪DRG样本周围的OCT。</li>
			<li>以30 µm厚度切去覆盖OCT的顶部，直至DRG可见。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 背根神经节的冷冻切片
<ol>
	<li>将冷冻切片机的切片厚度调整为 12 µm，以将背根神经节（DRG）组织切片切至载玻片上（图 1H）。</li>
	<li>用一支预冷至 -20 °C 的小号画笔托住 OCT 包埋块底部。 
	注意：切片时不应将整个组织完全切断，需保留 1–3 mm 不切断（图 1I）。</li>
	<li>使用室温镊子的末端轻轻触碰切片底部（六点钟位置），使其粘附于切片台表面（图 1J）。此操作可防止切片向内卷曲成卷，从而便于将切片完整转移至载玻片上。 
	注意：当切片底部粘附于切片台表面，而切片顶部仍与覆盖的 OCT 包埋介质相连时，切片呈平坦状态（图 1K），此时更易于将其完整转移至载玻片上。</li>
	<li>取一张带电荷的玻璃载玻片（见材料表），缓慢将其覆盖在切片上。一旦切片开始粘附至载玻片，即轻轻向后拉动载玻片（图 1L）。</li>
	<li>重复上述步骤，将更多 DRG 切片转移至同一载玻片上，注意避免切片相互重叠（图 1M）。确保新的 DRG 切片不覆盖在另一 DRG 切片的 OCT 包埋区域上（图 4），否则该切片无法牢固附着于载玻片，在免疫化学染色过程中易被冲洗掉。</li>
</ol>
3. 玻璃载片上背根神经节切片的尼氏染色
<ol>
	<li>用含0.1% Triton X-100的PBS洗涤切片10分钟，然后用PBS再洗涤两次。</li>
	<li>将1:300的尼氏染液（见材料表）滴加到载玻片上，在室温下孵育20分钟。</li>
	<li>用含0.1% Triton X-100的PBS洗涤切片，随后用PBS洗涤两次，每次5分钟，最后在室温下继续用PBS洗涤2小时。</li>
	<li>滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光封片剂（见材料表），盖上盖玻片以覆盖切片。</li>
</ol>

Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

<ol><li>Guan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injured+sensory+neuron-derived+CSF1+induces+microglial+proliferation+and+DAP12-dependent+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+root+ganglion+macrophages+contribute+to+both+the+initiation+and+persistence+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain.</a> Nature Communications. 11 (1), 264(2020).</li>
<li>Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+its+role+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).</li>
<li>Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+of+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+study+of+oxytocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression.</a> Molecular Brain. 15 (1), 44(2022).</li>
<li>Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuro-immune+interactions+in+chronic+pain%3A+implications+for+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain+Research%22%5BJournal%5D)">The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice.</a> Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).</li>
<li>Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+characteristics+of+the+dorsal+root+ganglion+as+a+target+for+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Medicine%22%5BJournal%5D)">Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation.</a> Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).</li>
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<li>Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+views+on+inflammatory+pain+mechanisms%3A+TRPing+over+innate+and+microglial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways.</a> F1000Research. , (2016).</li>
<li>Boadas-Vaello, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroplasticity+of+ascending+and+descending+pathways+after+somatosensory+system+injury%3A+reviewing+knowledge+to+identify+neuropathic+pain+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets.</a> Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).</li>
<li>Guha, D., Shamji, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+root+ganglion+in+the+pathogenesis+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain.</a> Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).</li>
<li>Shorrock, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBA1%2FGARS-dependent+pathways+drive+sensory-motor+connectivity+defects+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy.</a> Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).</li>
<li>Sleigh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trk+receptor+signaling+and+sensory+neuron+fate+are+perturbed+in+human+neuropathy+caused+by+Gars+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).</li>
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<li>Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+for+rapid+dissection+of+mouse+dorsal+root+ganglia+from+defined+spinal+levels%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels.</a> BMC Research Notes. 13 (1), 302(2020).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).</li>
<li>Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+dorsal+root+ganglion+neuron+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184(2020).</li>
<li>Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+transcriptional+signatures+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Common transcriptional signatures of neuropathic pain.</a> Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).</li>
<li>Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+dorsal+root+ganglia+following+peripheral+nerve+injury%3A+roles+in+inflammation%2C+cell+death+and+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception.</a> Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).</li>
<li>Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+and+chemokine+regulation+of+sensory+neuron+function%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+outgrowth%2C+neuropeptides+expression+and+receptors+tyrosine+kinase+phosphorylation+in+3D+organotypic+cultures+of+adult+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia.</a> PLoS One. 12 (7), e0181612(2017).</li>
<li>Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+nature+of+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+Linking+structure+with+polarity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiolology%22%5BJournal%5D)">The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function.</a> Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).</li>
<li>Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+sensory+afferent+compartments+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The structure of sensory afferent compartments in health and disease.</a> Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).</li>
<li>Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomic+analysis+of+human+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons.</a> eLife. 10, e71752(2021).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Hunt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRGquant%3A+A+new+modular+AI-based+pipeline+for+3D+analysis+of+the+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG.</a> Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497(2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了一种简便的分步操作流程，用于对小鼠背根神经节（DRG）进行恒冷切片，以可靠地在载玻片上获得高质量的DRG切片。本方案包含四个关键步骤。第一，在将DRG样本放置于OCT包埋基质底座上之前，必须确保DRG样本和镊子完全干燥。任何围绕DRG样本的液体都会在其周围形成冰壳，导致DRG切片从OCT上分离并向上卷曲。第二，如果铝块上没有标记，或OCT底座覆盖了铝块上的标记，则必须在OCT底座底部（六点钟位置）做一标记，并在整个操作过程中始终保持该标记位于六点钟位置。保持恒定的方向有助于获得更多的DRG切片，否则DRG无法从顶部到底部被完整切下，部分DRG样本将被遗漏而浪费。第三，OCT底座和OCT覆盖层的上边缘必须与铝块的上边缘齐平。这样可避免铝块上边缘阻碍载玻片接取DRG切片。第四，应避免将DRG切片置于邻近DRG切片的OCT区域内，否则第二个DRG切片无法直接粘附在载玻片上，从而在后续步骤中容易被冲洗掉。
背根神经节（DRG）冰冻切片技术在研究疼痛和瘙痒机制中具有重要意义1,<sup class="xref"...

背根神经节（DRG）包含初级感觉神经元、组织巨噬细胞以及围绕初级感觉神经元的卫星细胞1,2,3,4。它是处理无害性和有害性信号的关键解剖结构，在疼痛、瘙痒以及多种周围神经疾病中发挥重要作用5,6,7,8,9,10,11,12,13。尽管已有多种方法用于从小鼠脊髓中分离DRG组织14,15,16，但DRG组织的冷冻切片仍具挑战性，因为DRG组织体积较小，且冷冻切片样本容易卷曲成卷状，难以将其完整转移至载玻片上。然而，准确的DRG组织冷冻切片对于免疫组织化学研究以及DRG感觉神经元结构的观察至关重要17,18,19,20,21,22,23。此外，单细胞RNA测序结果已揭示人类24和小鼠25中DRG感觉神经元具有显著的异质性，因此，准确的DRG组织冷冻切片对于研究不同DRG细胞在各种生理和病理条件下的功能作用至关重要。
尽管组织透明化技术已应用于背根神经节三维重建的研究26 作为DRG冰冻切片的一种替代技术，组织透明化技术耗时且费力。相比之下，DRG冰冻切片操作快速且相对简便，因此仍是DRG及其他中枢神经系统区域进行免疫组织化学和结构研究的关键技术。然而，由于组织样本体积微小（如DRG及某些脑区），如何将高质量、完整且平整的冰冻切片转移至载玻片上，仍是神经科学研究中的一项挑战。目前尚无文献报道针对小尺寸组织样本（如小鼠DRG）冰冻切片的最佳操作方案。
本方案提供了一种简单、逐步的冷冻切片技术，用于对小鼠背根神经节（DRG）进行切片，可稳定地在载玻片上获得大量高质量的DRG切片，以用于后续的DRG研究。尽管该技术专为DRG样本的冷冻切片设计，但也可望用于其他样本量较小的多种组织的冷冻切片。

<table><tbody><tr><td>Avertin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td>麻醉动物</td></tr><tr><td>Epredia&amp;nbsp;Cryotome冷冻切片机用冷冻切片盒，25 mm直径，交叉网格</td><td>Fisherbrand</td><td>1910</td><td>握住OCT切片的底部&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ergo 镊子</td><td>Fisherbrand</td><td>S95310</td><td>使用镊子末端轻轻触碰底部（6 点钟位置）&amp;rsquo;时钟）使切片贴附于平台表面，以防止切片向后卷曲&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td>收集背根神经节切片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>标记笔</td><td>Fisherbrand</td><td>133794</td><td>&amp;nbsp;标记基底OCT的方向</td></tr><tr><td>Scigen&amp;nbsp;Tissue-Plus O.C.T. 包埋剂</td><td>Fisherbrand</td><td>&amp;nbsp;23730571</td><td>用于冷冻组织样本的包埋介质，以确保最佳切片温度（O.C.T.）</td></tr></tbody></table>

小鼠背根神经节冷冻切片操作流程

A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

高质量的小鼠背根神经节（DRG）冷冻切片对于炎症性疼痛、神经病理性疼痛、瘙痒以及其他周围神经系统疾病研究中的免疫组织化学染色和RNAscope分析至关重要。然而，由于DRG组织样本体积微小，要始终如一地获得高质量、完整且平整地贴附于载玻片上的冷冻切片仍是一项挑战。迄今为止，尚无文献详细描述DRG冷冻切片的最佳操作方案。本方案提供了一种逐步解决DRG冷冻切片过程中常见困难的方法。本文详细说明了如何去除DRG组织样本周围的液体，将DRG切片以一致的方向置于载玻片上，并使切片在载玻片上保持平整而不翘起。尽管该方案是为DRG样本的冷冻切片而开发，但也可适用于其他多种小样本量组织的冷冻切片操作。

本研究从一只小鼠的L4背根神经节（DRG）收集了约16张连续且高质量的DRG切片。所获得的切片无任何变形。 图1 展示了冰冻切片的逐步操作流程。组织切片中多余液体的去除过程如图所示。 图2组织的OCT包埋过程在下文重点说明 图3. 图4 显示背根神经节切片在玻片上的正确放置位置。 图5 显示小鼠DRG切片生理结构的共聚焦荧光显微镜图像。尼氏染色显示不同大小的DRG感觉神经元，DAPI染色显示围绕神经元的周围细胞。该图像展示了采用本方案所获得DRG切片的质量。可使用不同抗体对DRG进行免疫组织化学研究，包括鉴定DRG中不同类型的神经元。
<img alt="切片过程：石蜡...

本文介绍了如何稳定获取高质量的背根神经节冰冻切片的方法。

高质量的小鼠背根神经节（DRG）冷冻切片对于疼痛研究中的免疫化学染色和RNAscope分析至关重要。

如何持续获得高质量、完整且平整的小鼠背根神经节冷冻切片仍是一个挑战。本研究旨在解决如何获取理想的小鼠背根神经节冷冻切片的问题。本方案提供了一种简便的逐步操作技术，用于制备高质量、完整且平整的小鼠背根神经节横切面冷冻切片。本文介绍如何去除小鼠背根神经节（DRG）样本组织周围的液体，将DRG切片以相同方向置于载玻片上，并使DRG切片平整展开而不翘起。其中一个主要难点在于，小鼠DRG的OCT切片容易卷曲成条状，难以平整地放置在玻璃载玻片上。此外，由于小鼠DRG体积较小，从一个样本中获取足够数量的切片也具有挑战性。首先，将从麻醉小鼠脊髓中分离的DRG组织置于4%多聚甲醛中，在室温下后固定3小时。随后，将组织在4°C条件下，于PBS中的30%蔗糖溶液中过夜孵育。接下来，通过加入OCT包埋剂并覆盖铝块的顶面，制备基础OCT支撑底座。将覆盖的铝块在零下20摄氏度冷冻5至10分钟。使用冷冻切片机以30微米厚度切去OCT包埋剂的顶部，直至其表面与基底OCT齐平。在将铝块从冷冻切片机取下之前，于基底OCT的六点钟位置做标记。为了进行背根神经节（DRG）的OCT包埋，先将DRG组织置于干燥的培养皿上，用干燥镊子将其在培养皿内移动两到三次以吸干水分。然后用干燥镊子将干燥的DRG放置于OCT包埋底座的12点钟位置。确保DRG上缘与OCT底座上缘之间至少保持5毫米的距离，背侧朝向12点钟位置，腹侧朝向6点钟位置。接下来，将OCT以圆形或椭圆形方式加入，使背根神经节（DRG）位于中央并完全包埋于组织中。将覆盖OCT及DRG的样本置于-20摄氏度下冷冻5分钟。完成后，以30微米厚度切去上方的覆盖OCT，直至可见DRG组织。使用预先在 20 摄氏度下冷却的小号画笔，从底部固定最佳切割温度的 DRG 切片，开始进行冷冻切片。用室温镊子的尖端轻轻接触切片底部，使其粘附在平台表面。接着，缓慢将一张带电荷的玻片覆盖在切片上。一旦切片贴附到载玻片上，轻轻向后拉动载玻片。按照相同步骤，将更多DRG切片转移至载玻片上，注意切片之间不要重叠。正确的DRG切片放置位置应确保组织之间互不重叠，且各DRG切片的OCT包埋剂也不相互重叠。共聚焦荧光显微镜图像展示了采用本方案获得的背根神经节切片的质量。利用该技术，可使用不同的抗体对背根神经节进行免疫组织化学研究。

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小鼠背根神经节冷冻切片的程序

我们介绍了一种在轴突损伤后从背根神经节组织中进行染色质免疫沉淀的方法。该方法可用于鉴定特定转录因子的结合位点以及组蛋白和DNA的表观遗传修饰，这些修饰对于周围和中枢神经系统中受损轴突的再生具有重要意义。...

脊髓背根神经节组织在轴突损伤后的染色质免疫沉淀

本视频展示了一种无需使用酶的机械解离技术，用于从小鼠背根神经节（DRG）中分离巨噬细胞。在对新鲜采集的DRG组织进行匀浆处理后，使用针对巨噬细胞表面受体的抗体对细胞进行荧光标记，随后通过流式细胞术确认样本中巨噬细胞的存在。...

利用机械解离法从小鼠背根神经节中分离巨噬细胞

本视频展示了一种从背根神经节（DRG）中分离神经元的方法。从大鼠脊柱分离背根神经节（DRG），经酶处理后，通过机械解离获得单细胞悬液。利用密度梯度离心法将神经元与胶质细胞分离，并在生长培养基中进行培养。...

一种用于神经元培养的背根神经节收获与解离技术

本文介绍了一种在同一啮齿类动物中进行脊髓液压挤出以及特异性背根神经节（DRGs）识别与分离的实验方案。与传统的脊髓分离方法相比，该方法显著缩短了操作时间，并降低了组织损伤的风险。...

啮齿类动物脊髓的液压挤出及背根神经节的分离

本文介绍一种机械解离方案，用于快速从背根神经节中分离巨噬细胞，以进行表型鉴定和功能分析。...

快速分离背根神经节巨噬细胞

介绍了一种便捷的重力灌注法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析。在帕金森病小鼠模型中，展示了磷酸化α-突触核蛋白的免疫荧光检测。本研究还全面描述了经心脏灌注、解剖、组织冷冻/包埋以及冷冻切片等步骤。...

一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的重力驱动经心灌注方法

本文描述了一种用于成年小鼠背根神经节的免疫平皿分离技术。通过将抗体固定在培养板上，我们可以进行阴性筛选并去除非神经元细胞。我们证明，采用该方案获得的培养物中神经元比例显著提高，从而能够深入研究神经元对各种干预措施的反应。...

成年小鼠背根神经节神经元培养物的免疫平皿富集

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca2+指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca2+成像。...

体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

本文介绍了一种采用推拿疗法治疗大鼠背根神经节慢性受压的方法，并提供了一种基于疼痛行为和组织病理学结果评估其疗效的方案。...

推拿对背根神经节受压痛大鼠模型镇痛作用的研究

本方案描述了一种实用策略，可在使用染料和冷冻切片进行病毒示踪前，加快立体定位注射坐标的验证步骤。...

通过冰冻切片法对立体定位注射坐标的初步验证

背根神经节（DRG）包含初级感觉神经元的胞体，并将外周感觉信号传递至脊髓。本方案描述了一种适用于小鼠背根神经节的解剖方法，可实现结构完整神经节的标准化分离、解剖节段的准确定位、为初学者提供直观操作指导，并减少操作过程中的组织损伤。...

小鼠背根神经节的解剖与分离

学习小鼠背根神经节冷冻切片技术，掌握获取高质量完整平整切片的详细步骤。该方法使用OCT包埋和冷冻切片技术，适用于神经科学和免疫组织化学研究，帮助研究人员获得可靠的DRG组织切片用于后续实验分析。

小鼠背根神经节冷冻切片操作流程

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