Name: 牛肝细胞中脂滴大小和融合的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 了解牛肝细胞中脂滴大小和融合的评估方法，使用Oil Red O染色和活细胞成像技术观察脂滴动态变化。该研究为脂质代谢和脂肪肝机制研究提供了简单可重复的实验方案。

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本研究由国家自然科学基金（U1904116）联合资助。

所有实验程序均经河南农业大学动物护理委员会（中国河南省）伦理标准批准，并依照其规定执行。
1. 牛肝细胞培养
<ol>
	<li>解冻原代肝细胞17，在室温下以 400 × g 离心 4 分钟。 
	注意：原代肝细胞的培养与维持参照先前发表的研究方法进行17。</li>
	<li>用移液器弃去冷冻保存液，加入 1 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）重悬细胞。随后使用细胞计数板计算每毫升细胞数量，确定上述细胞悬液的浓度，并将细胞浓度调整至 1 × 107 个细胞/mL。
	<ol>
		<li>将细胞悬液加入含有 3 mL 上述培养基的 60 mm 细胞培养皿中。于 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当细胞生长至约 80% 汇合时，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，随后加入 750 µL 0.25% 胰蛋白酶消化细胞。于 37 °C 孵育 3 分钟后，加入等体积的 10% FBS 终止消化反应。收集细胞悬液，在室温下以 200 × g 离心 4 分钟。</li>
</ol>
2. 油红O染色
<ol>
	<li>向含有盖玻片的 24 孔细胞培养板的每个孔中加入 800 µL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基。取 50 µL 细胞悬液（步骤 1.3 中获得），加入 950 µL PBS 中混匀。使用细胞计数板计算每毫升的细胞数量，然后计算上述细胞悬液的浓度。最后将每个孔中的细胞浓度调整为 4 × 104/mL，在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养 24 小时。</li>
	<li>培养 24 小时后，弃去培养基，并用 PBS 洗涤。加入 800 µL 含 1 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）的 DMEM 诱导培养基悬浮细胞。</li>
	<li>将共 100 µL 的 LA（见材料表）溶解于 900 µL 无水乙醇中，配制成 100 mmol/L 的标准溶液。向 24 孔板中分别加入 0 µmol/L、100 µmol/L、150 µmol/L 和 200 µmol/L 的 LA 梯度浓度，每种处理重复四次。在 37 °C 和 5% CO2 条件下继续培养 24 小时。</li>
	<li>移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞三次。加入 400 µL 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。弃去固定液，再用 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>加入 60% 异丙醇孵育 5 分钟后弃去。加入新配制的油红 O 工作液（见材料表）（油红 O 与水按 3:2 比例混合），染色 20–30 分钟，然后弃去染色液。用 PBS 洗涤细胞 2 至 5 次，直至无多余染液残留。</li>
	<li>加入 300 µL 苏木精染色液（苏木精与水按 1:10 比例混合），复染细胞核 1–2 分钟。弃去染液，用 PBS 洗涤 2 至 5 次。从 24 孔板中取出盖玻片，滴加 10 µL 封片剂（见材料表）于载玻片上，将盖玻片（细胞面朝下）置于其上。</li>
	<li>封片后，在光学显微镜的油镜下观察并拍摄细胞内的脂滴（LDs）（见材料表）。使用 cellSens 软件测量脂滴的直径，并分析脂滴的数量和大小。</li>
</ol>
3. 脂滴大小和数量的测量
<ol>
	<li>采集图像：依次打开计算机和显微镜开关，将玻片放置在载物台上，打开图像分析软件（参见材料表），连接计算机以查看图像。
	<ol>
		<li>先用低倍镜找到图像，然后在成像玻片上滴加适量的雪松油。将观察倍数调整至100倍，设置自动曝光，通过调节合适的视野采集图像。每组选取三张染色细胞玻片进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>直径测量：每张图像随机选取60个脂滴（LDs）测量其直径。每张图像测量完成后，保存图像并将测量结果输出为表格，用于后续分析脂滴的平均大小及分布比例。</li>
	<li>数量测量：每张染色并拍摄的图像中选取三张图片，每张图片中随机选取三个细胞进行数量测量。统计并分析细胞周围的脂滴数量，计算细胞内脂滴的平均数量。</li>
</ol>
4. 脂滴融合的动态观察
<ol>
	<li>按照步骤1.1–1.3中所述进行细胞培养。当细胞生长至80%时，弃去培养基，用PBS洗涤，然后加入750 µL胰蛋白酶消化3 min。随后加入750 μL培养基，于200 x g 室温孵育4分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 1 mL 培养基中，计数并调整细胞浓度至 5 x 105 细胞/mL，置于35 mm培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下培养2 24 小时。</li>
	<li>当细胞生长至80%时，更换培养基为DMEM + 150 µmol/L LA，培养24小时，随后继续在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。2 以积累脂滴。</li>
	<li>24小时后，移除培养基，用PBS洗涤贴壁细胞，并与10 µg/mL BODIPY 493/503中性荧光探针孵育（参见 材料表在黑暗条件下孵育30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤培养皿中的细胞3次，然后加入DMEM + 150 µmol/L LA。 
	注意：在10 µg/mL BODIPY染色过程中及染色完成后应避免光照；1 mg/mL BODIPY用PBS按1:100稀释。</li>
	<li>将培养皿置于活细胞工作站显微镜的槽内（参见 材料表) 以观察脂滴（LDs）的动态变化。按照启动顺序打开活细胞工作站的电源，并避免光照。
	<ol>
		<li>打开电源、透射光源、显微镜电源、汞灯荧光光源、电荷耦合器件（CCD）相机电源、计算机主机电源、CO2 瓣膜，和 CO2 培养箱</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向加样平台的凹槽中加入蒸馏水，注意不要超过通气孔。</li>
	<li>打开计算机并运行 &#34;NIS-Elements&#34;首先，在4x物镜下找到合适的视野，然后依次调整至40x物镜。在显微镜下观察样品时选择E100，而在计算机上预览和拍摄样品时选择L100。 
	注意：E100 和 L100 是活细胞工作站显微镜上的调节按钮（参见 材料表），分别代表目镜和计算机屏幕。</li>
	<li>设计实验的参数，如荧光通道（例如 Ph-40x、异硫氰酸荧光素 [FITC]）、快门及预期拍摄时间。设置拍摄时间于 时间，包括每两张图像之间5分钟的拍摄间隔，总拍摄时间为6小时。 
	注意：长时间拍摄需要使用完美对焦系统（PFS）的对焦稳定功能。为此，首先调整视野和焦距，然后点击 无进展生存期 在电脑屏幕上观察，并最终调节细调焦螺旋。</li>
	<li>选择不同的通道模式，单通道或全部通道，选择不同的视野，点击 预览，调整视野，设置这些参数，然后单击 开始运行 开始拍摄。首先进行5分钟的试拍；操作正常后可能仍需要较长时间。</li>
	<li>拍摄完成后，选择 文件 &#62; 保存为 &#62; 保存类型 &#62; avi 格式 将数据导出为“avi”格式的视频。使用“.nd2”图像格式保存数据程序并导出图片。</li>
	<li>关闭设备时，应按相反顺序进行。</li>
</ol>
5. 统计学与结果分析
<ol>
	<li>使用单因素方差分析（one-way ANOVA）对数据进行分析。结果以均值 ± 标准误表示。</li>
</ol>

Live Cell Imaging of Lipid Droplet Size and Fusion Using Oil Red O and BODIPY

<ol><li>Fujimoto, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+just+fat%3A+the+structure+and+function+of+the+lipid+droplet%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Not just fat: the structure and function of the lipid droplet.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838(2011).</li>
<li>Grasselli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+potential+translational+value%3A+The+effects+of+3%2C5-L-diiodothyronine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine.</a> Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).</li>
<li>Herdt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruminant+adaptation+to+negative+energy+balance%3A+Influences+on+the+etiology+of+ketosis+and+fatty+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).</li>
<li>Pino-de la Fuente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+regulation+of+hepatic+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism.</a> Life Sciences. 298, 120522(2022).</li>
<li>O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mega-stokes+pyrene+ceramide+conjugates+for+STED+imaging+of+lipid+droplets+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells.</a> Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+droplet+fusion+and+growth+by+CIDE+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).</li>
<li>Tütüncü Konyar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+insoluble+polysaccharides+and+neutral+lipids+in+the+developing+anthers+of+an+endangered+plant+species%2C+Pancratium+maritimum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Systematics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum.</a> Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).</li>
<li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY+%28493%2F503%29+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358(2011).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+characterization+of+intracellular+lipids+in+situ+by+Nile+Red+red%2Fyellow+emission+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio.</a> Micron. 39 (7), 819-824 (2008).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+polarity-sensitive+fluorescent+dyes+based+on+the+BODIPY+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Dyes+and+Pigments%22%5BJournal%5D)">The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore.</a> Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials. 11 (9), 1768(2018).</li>
<li>Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases%2C+reproductive+performance%2C+and+changes+in+milk+production+associated+with+subclinical+ketosis+in+dairy+cows%3A+A+meta-analysis+and+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review.</a> Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).</li>
<li>Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+elevated+nonesterified+fatty+acids+and+%CE%B2-hydroxybutyrate+concentrations+with+early+lactation+reproductive+performance+and+milk+production+in+transition+dairy+cattle+in+the+northeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States.</a> Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).</li>
<li>Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+experimental+steatosis+in+vitro%3A+hepatocyte+cell+culture+in+lipid+overload-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62543(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nonesterified+fatty+acids+on+the+synthesis+and+assembly+of+very+low+density+lipoprotein+in+bovine+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).</li>
<li>Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+their+interactions+with+other+organelles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).</li>
<li>Sanjabi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+hypertrophy%3A+a+crucial+determining+factor+in+insulin+regulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes.</a> Scientific Reports. 5, 8816(2015).</li>
<li>Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subtle+balance+between+lipolysis+and+lipogenesis%3A+a+critical+point+in+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis.</a> Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).</li>
<li>Yang, A., Mottillo, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+lipolysis%3A+from+molecular+mechanisms+of+regulation+to+disease+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics.</a> Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).</li>
<li>Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+liver+disease%3A+from+basic+biology+to+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).</li>
<li>Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+myocellular+fat+stores%3A+lipid+droplet+dynamics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).</li>
<li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cis-and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626(2020).</li>
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<li>Fei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphatidic+acid+in+the+formation+of+%26%2334%3Bsupersized%26%2334%3B+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for phosphatidic acid in the formation of &#34;supersized&#34; lipid droplets.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002201(2011).</li>
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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+fluorescent+dye+BODIPY+in+the+study+of+lipid+dynamics+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecules. 23 (7), 1594(2018).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

根据不同的病理状态，肝细胞中的脂滴（LDs）在大小和数量上会发生显著变化。脂滴广泛存在于肝细胞中，在肝脏健康与疾病中发挥着关键作用18。脂滴的数量和大小是当前脂滴生物发生研究的基础19。细胞和组织中脂滴的大小与数量反映了其储存和释放能量的能力。脂滴的动态变化维持了脂质代谢活动的稳定性20,21。在多种病理条件下，脂滴会出现异常积聚，可作为代谢性疾病的指标22,23。本实验方案提供了一种准确测定脂肪酸诱导的肝细胞模型中脂滴大小和数量的方法，并能更高效、直观地观察脂滴的融合过程。
研究脂滴（LDs）的大小及其动态变化对于理解脂质代谢紊乱相关疾病的发生机制及有效干预具有重要意义。本实验的关键步骤是对脂滴的大小和数量进行测量与分析。首先，使用不同浓度的亚油酸（LA...

肝细胞中脂滴（LD）的积聚是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的典型特征，该疾病可进一步发展为肝纤维化和肝细胞癌。研究发现，脂肪肝疾病的最早表现是脂肪变性，其特征是肝细胞胞质中出现脂滴积聚1。肝脂肪变性总是伴随着脂滴数量的增加和/或体积的扩大2。脂滴被认为起源于内质网（ER），其核心成分为甘油三酯（TG），外周包裹着蛋白质和磷脂3。作为负责甘油三酯储存的亚细胞器，脂滴在大小、数量、脂质组成、相关蛋白以及与其他细胞器相互作用等方面表现出不同的特性，这些特性均影响细胞的能量稳态4。甘油三酯水平与脂滴大小呈正相关，细胞内较高的甘油三酯含量可形成更大的脂滴5。脂滴通过局部甘油三酯合成、内质网中的脂质整合以及多个脂滴的融合而增大体积6。含有大脂滴的细胞（如脂肪细胞、肝细胞等）具有一种特殊机制，可通过脂滴融合高效增加脂质储存。脂滴的动态变化反映了细胞不同的能量代谢状态。因此，开发能够观察和分析正常与异常肝细胞中各类脂滴的技术方法至关重要。
脂滴的主要非荧光染料为苏丹黑B和油红O。苏丹黑B可染色中性脂质、磷脂和类固醇7。油红O主要用于骨骼肌、心肌细胞、肝组织、脂肪细胞等的脂滴染色8，并被认为是检测小鼠和人类肝脏脂肪变性的标准工具9。脂滴的动态变化主要通过荧光染色进行观察。尼罗红和BODIPY均为常用的荧光脂质染料10,11。与尼罗红相比，BODIPY具有更强的组织渗透性，并能更有效地与脂滴结合12。BODIPY标记的脂滴可用于活细胞染色以及与其他细胞器的共定位分析13。
脂肪肝疾病在反刍动物中的发病率显著高于单胃动物14。在围产期，奶牛处于负能量平衡状态3。大量非酯化脂肪酸（棕榈酸、油酸、亚油酸等）在牛肝细胞内被合成为甘油三酯（TGs），导致肝功能异常，显著降低乳制品质量和生产效率15。本研究旨在提供一种分析脂滴（LDs）大小和数量的方法，并监测脂滴融合动态过程。我们通过在肝细胞中添加不同浓度的亚油酸（LA）构建了脂滴形成模型16，并利用油红O染色观察该过程中脂滴大小和数量的变化。此外，还通过BODIPY 493/503染色观察了脂滴快速融合的过程。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>试剂</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>试剂</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>invitrogen</td><td>2295015</td><td>试剂</td></tr><tr><td>雪松油</td><td>Solarbio</td><td>C7140</td><td>试剂</td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td></td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>康宁</td><td>353002</td><td>材料</td></tr><tr><td>Cell Sens 软件&amp;nbsp;</td><td>奥林巴斯 IX73</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>试剂</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>2492319</td><td>试剂</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>丁国</td><td>AR0712</td><td>试剂</td></tr><tr><td>图像视图</td><td></td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>亚油酸</td><td>Solarbio</td><td>SL8520</td><td>试剂</td></tr><tr><td>活细胞工作站</td><td>尼康 A1 HD25</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>NIS-Elements&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>油红O</td><td>Solarbio</td><td>G1260</td><td>试剂</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>奥林巴斯 IX73</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>青霉素 &amp;amp; 链霉素 100&amp;times;</td><td>NCM Biotech</td><td>CLOOC5</td><td>试剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>HyClone</td><td>SH30258.01</td><td>试剂</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>密封剂</td><td>Solarbio</td><td>S2150</td><td>试剂</td></tr></tbody></table>

牛肝细胞中脂滴大小与融合的评估

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

脂滴（LDs）是细胞中参与脂质代谢和中性脂储存的重要细胞器。它们与多种代谢性疾病相关，例如肥胖、脂肪肝病和糖尿病。在肝细胞中，脂滴的大小和数量是脂肪肝病的标志。此外，氧化应激反应、细胞自噬和凋亡通常也伴随着脂滴大小和数量的变化。因此，脂滴的尺寸和数量是当前研究脂滴生成机制的基础。本文以脂肪酸诱导的牛肝细胞为例，介绍如何使用油红O染色脂滴，并检测脂滴的大小和数量。对脂滴的大小分布进行统计学分析，并通过活细胞成像系统观察小脂滴融合为大脂滴的过程。本研究提供了一种直接观察不同生理条件下脂滴尺寸变化趋势的方法。

细胞脂滴的染色结果如图1所示。红色斑点代表细胞脂滴，蓝色斑点代表细胞核。可以看出，在亚油酸（LA）处理下，每张图片中脂滴的大小和数量均有所不同。
随着LA剂量的增加，脂滴（LDs）的平均直径和数量均表现出显著上升趋势，且与LA浓度相关（图2）。如图2A所示，每个细胞中脂滴的数量与不同浓度的LA呈负相关。100 µmol/L LA处理组每个细胞的脂滴中位数为136，150 µmol/L和200 µmol/L LA处理组则分别下降至118和105。对照组中脂滴的平均直径为0.72 µm，100 µmol/L LA处理组为1.38 µm，150 µmol/L LA处理组为1.51 µm，200 µmol/L LA处理组为1.64 µm（图2B）。
在本研究中，直径为 &lt;1 µm 被定义为小型...

本实验方案描述了如何使用油红O染色脂滴（LDs），在脂肪酸诱导的脂肪变性肝细胞模型中计算脂滴的大小和数量，并利用BODIPY 493/503通过活细胞成像观察小脂滴融合为大脂滴的过程。

脂滴（LDs）是细胞中在脂质代谢和中性脂质储存方面发挥重要作用的细胞器。它们与多种...

我们的研究重点是亚油酸在肝细胞中诱导的脂滴数量和大小。此外，我们旨在深入揭示脂肪肝的发病机制。该领域近期的研究进展表明，胆碱、CCTα以及已建立的诱导型自噬能够调控牛肝细胞中脂滴的大小。此外，活细胞工作站的观察表明，磷脂对脂滴融合具有显著影响。目前，基因辅助、荧光镊子、液相色谱、组学分析、单细胞色谱、流式细胞术及其他技术正被用于整合该领域的大量研究。该实验方法存在一定的局限性。例如，有限视野的现象仅能在脂滴视野中观察到，且需在特定的废弃物飞行条件下才能显现。与脂滴荧光染色相比，油红O染色更为便捷、成本更低，且更广泛用于测量脂滴的表观大小。该方法操作简单，所需设备较少。此外，我们通过活细胞工作站直接观察到脂滴融合这一现象。本研究提供了一种简单且可重复的方法，用于观察脂滴大小及融合过程，可广泛应用于细胞脂质代谢研究中的脂滴分析。我们将继续深入研究脂滴，重点探讨脂滴融合的机制以及奶牛脂肪肝的结构变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

牛肝细胞中脂滴大小和融合的评估

介绍了两种分离细胞脂滴的方法，分别来自1）酵母细胞和2）人胎盘。这两种方法的核心步骤均为密度梯度离心，其中含有脂滴的上浮层可通过肉眼清晰观察，随后可被提取，并通过蛋白质印迹分析检测其纯度。...

从酵母细胞和人胎盘中分离细胞脂滴：两种纯化技术

从头脂肪生成和β-脂肪酸氧化是肝细胞中的关键代谢途径，这些途径在多种代谢性疾病（包括脂肪肝病）中发生紊乱。本文中，我们演示了小鼠原代肝细胞的分离，并描述了β-脂肪酸氧化和脂肪生成的定量方法。...

小鼠原代肝细胞中脂肪酸氧化与脂质生成的测定

脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。...

脂滴分离用于定量质谱分析

本方案建立了一种利用已成熟的小鼠内质网分离试剂盒，从小鼠肝脏中分离和纯化脂滴的新方法。...

使用成熟细胞器分离试剂盒快速分离脂滴的实验方案

本研究中，我们描述了一种使用脂肪酸盐油酸钠在分化型HepaRG细胞中诱导肝泡性脂肪变性的详细方案，并介绍了脂质积聚的检测与定量方法，包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像、细胞荧光分析、油红O染色以及定量PCR。...

在分化型HepaRG细胞中诱导并表征囊泡性脂肪变性

基于三维重建技术分析荧光染色脂滴以评估肝脂肪变性

本文描述了使用油酸诱导的HepG2细胞作为代谢功能障碍相关脂肪性肝病的模型。...

代谢功能障碍相关脂肪性肝病中脂肪沉积的体外建模

本方案利用同步化的肝癌细胞，可重复地观察有丝分裂过程中脂滴和细胞器的动态变化。...

一种基于荧光的方法用于可视化肝癌细胞有丝分裂过程中脂滴与细胞器的动态变化

原代肝细胞为在生理相关的实验体系中评估生化、分子及代谢功能提供了有价值的工具。本文描述了一种可靠的大鼠原位肝脏灌注方案，该方法可稳定地从每次制备中获得高达 1.0 × 108 个细胞的肝细胞，细胞活力维持在 88 ~ 96%...

大鼠肝细胞的分离与原代培养

我们开发了一种细胞融合检测方法，通过β-半乳糖苷酶的激活表达来定量SNARE介导的膜融合事件。...

使用酶促细胞融合检测法分析SNARE介导的膜融合

了解牛肝细胞中脂滴大小和融合的评估方法，使用Oil Red O染色和活细胞成像技术观察脂滴动态变化。该研究为脂质代谢和脂肪肝机制研究提供了简单可重复的实验方案。

牛肝细胞中脂滴大小与融合的评估

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