Name: 定量确定年龄相关性黄斑变性病变性病变性眼底自发荧光特异性变化的工作流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 了解定量自发荧光分析工作流程，用于测量年龄相关性黄斑变性特定区域的自发荧光强度变化。该方法揭示AMD病变中自发荧光降低，为视网膜生理病理学研究提供新见解。

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本工作由德国眼科学会（DOG）博士生资助项目（MW）和美国国立卫生研究院/国家眼科研究所（NIH/NEI）1R01EY027948（TA）资助。

Exploring Quantitative Autofluorescence in Age-Related Macular Degeneration

<ol><li>Schmitz-Valckenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundus+autofluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Fundus autofluorescence imaging.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100893(2021).</li>
<li>Bermond, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+granules+of+the+human+retinal+pigment+epithelium%3A+phenotypes%2C+intracellular+distribution%2C+and+age-related+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent granules of the human retinal pigment epithelium: phenotypes, intracellular distribution, and age-related topography.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (5), 35(2020).</li>
<li>Bermond, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+organelles+within+the+retinal+pigment+epithelium+in+human+donor+eyes+with+and+without+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent organelles within the retinal pigment epithelium in human donor eyes with and without age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 63 (1), 23(2022).</li>
<li>Delori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurements+of+autofluorescence+with+the+scanning+laser+ophthalmoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (13), 9379-9390 (2011).</li>
<li>Fleckenstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 31(2021).</li>
<li>Greenberg, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+in+healthy+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (8), 5684-5693 (2013).</li>
<li>Sparrow, J. R., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+lipofuscin+and+its+role+in+retinal+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology.</a> Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).</li>
<li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+quantitative+autofluorescence+in+intermediate+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Natural history of quantitative autofluorescence in intermediate age-related macular degeneration.</a> Retina. 41 (4), 694-700 (2021).</li>
<li>Reiter, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+changes+in+quantitative+autofluorescence+during+progression+from+intermediate+to+late+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Longitudinal changes in quantitative autofluorescence during progression from intermediate to late age-related macular degeneration.</a> Retina. 41 (6), 1236-1241 (2021).</li>
<li>Gliem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+in+early+and+intermediate+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence in early and intermediate age-related macular degeneration.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).</li>
<li>Hussain, R. M., Gregori, N. Z., Ciulla, T. A., Lam, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacotherapy+of+retinal+disease+with+visual+cycle+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacotherapy of retinal disease with visual cycle modulators.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 19 (5), 471-481 (2018).</li>
<li>Ammar, M. J., Hsu, J., Chiang, A., Ho, A. C., Regillo, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration+therapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration therapy: a review.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 215-221 (2020).</li>
<li>Ach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+redistribution+and+loss+accompanied+by+cytoskeletal+stress+in+retinal+pigment+epithelium+of+eyes+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).</li>
<li>Zanzottera, E. C., Messinger, J. D., Ach, T., Smith, R. T., Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subducted+and+melanotic+cells+in+advanced+age-related+macular+degeneration+are+derived+from+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Subducted and melanotic cells in advanced age-related macular degeneration are derived from retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3269-3278 (2015).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperreflective+foci%2C+optical+coherence+tomography+progression+indicators+in+age-related+macular+degeneration%2C+include+transdifferentiated+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 34(2021).</li>
<li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Project+MACULA+retinal+pigment+epithelium+grading+system+for+histology+and+optical+coherence+tomography+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The Project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3253-3268 (2015).</li>
<li>Sparrow, J. R., Duncker, T., Schuerch, K., Paavo, M., de Carvalho, dR. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+quantitative+fundus+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from quantitative fundus autofluorescence.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100774(2020).</li>
<li>Schmitz-Valckenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+the+area+of+increased+autofluorescence+surrounding+geographic+atrophy+and+disease+progression+in+patients+with+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Correlation between the area of increased autofluorescence surrounding geographic atrophy and disease progression in patients with AMD.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (6), 2648-2654 (2006).</li>
<li>Ach, T., Bermond, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+the+human+retinal+pigment+epithelium+in+normal+aging+and+in+age-related+macular+degeneration%3A+histology+and+clinical+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Klinische+Monatsblatter+Fur+Augenheilkunde%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of the human retinal pigment epithelium in normal aging and in age-related macular degeneration: histology and clinical correlation.</a> Klinische Monatsblatter Fur Augenheilkunde. 236 (5), 672-681 (2017).</li>
<li>Pollreisz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+melanosomes%2C+lipofuscin%2C+and+melanolipofuscin+in+human+retinal+pigment+epithelium+using+serial+block+face+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing melanosomes, lipofuscin, and melanolipofuscin in human retinal pigment epithelium using serial block face scanning electron microscopy.</a> Experimental Eye Research. 166, 131-139 (2018).</li>
<li>Bernstein, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((meso-zeaxanthin%3A+The+basic+and+clinical+science+underlying+carotenoid-based+nutritional+interventions+against+ocular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">meso-zeaxanthin: The basic and clinical science underlying carotenoid-based nutritional interventions against ocular disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 50, 34-66 (2016).</li>
<li>Göbel, A. P., Fleckenstein, M., Heeren, T. F. C., Holz, F. G., Schmitz-Valckenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+mapping+of+drusen+by+fundus+autofluorescence+and+spectral-domain+optical+coherence+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">In-vivo mapping of drusen by fundus autofluorescence and spectral-domain optical coherence tomography imaging.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (1), 59-67 (2016).</li>
<li>Pfau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesopic+and+dark-adapted+two-color+fundus-controlled+perimetry+in+geographic+atrophy+secondary+to+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Mesopic and dark-adapted two-color fundus-controlled perimetry in geographic atrophy secondary to age-related macular degeneration.</a> Retina. 40 (1), 169-180 (2020).</li>
<li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesopic+and+dark-adapted+two-color+fundus-controlled+perimetry+in+choroidal+neovascularization+secondary+to+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Mesopic and dark-adapted two-color fundus-controlled perimetry in choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration.</a> Translational Vision Science and Technology. 8 (1), 7(2018).</li>
<li>Aumann, S., Donner, S., Fischer, J., Müller, F. Optical coherence tomography (OCT): principle and technical realization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAumann%2C+S+%22High+Resolution+Imaging+in+Microscopy+and+Ophthalmology%3A+New+Frontiers+in+Biomedical+Optics%22">High Resolution Imaging in Microscopy and Ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics</a>. , Cham (CH), Springer. 59-85 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIJI%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FIJI: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kleefeldt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence%3A+advanced+analysis+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence: advanced analysis tools.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (8), 2(2020).</li>
<li>Hong, I. H., Jung, W. H., Lee, J. H., Chang, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macular+pigment+optical+density+in+the+Korean+population%3A+a+cross+sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Macular pigment optical density in the Korean population: a cross sectional study.</a> Journal of Korean Medical Science. 35 (5), e30(2020).</li>
<li>Putnam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+imaging+of+macular+pigment+optical+density+and+spatial+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Optometry%22%5BJournal%5D)">Clinical imaging of macular pigment optical density and spatial distribution.</a> Clinical and Experimental Optometry. 100 (4), 333-340 (2017).</li>
<li>Zweifel, S. A., Spaide, R. F., Curcio, C. A., Malek, G., Imamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reticular+pseudodrusen+are+subretinal+drusenoid+deposits%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reticular pseudodrusen are subretinal drusenoid deposits.</a> Ophthalmology. 117 (2), 303-312 (2010).</li>
<li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+drusenoid+deposits+in+non-neovascular+age-related+macular+degeneration%3A+morphology%2C+prevalence%2C+topography%2C+and+biogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: morphology, prevalence, topography, and biogenesis model.</a> Retina. 33 (2), 265-276 (2013).</li>
<li>Spaide, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+retinal+atrophy+after+regression+of+subretinal+drusenoid+deposits+as+a+newly+recognized+form+of+late+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Outer retinal atrophy after regression of subretinal drusenoid deposits as a newly recognized form of late age-related macular degeneration.</a> Retina. 33 (9), 1800-1808 (2013).</li>
<li>Reiter, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+lens+opacities+and+cataract+severity+on+quantitative+fundus+autofluorescence+as+a+secondary+outcome+of+a+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Influence of lens opacities and cataract severity on quantitative fundus autofluorescence as a secondary outcome of a randomized clinical trial.</a> Scientific Reports. 11 (1), 12685(2021).</li>
<li>Gliem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+in+pseudoxanthoma+elasticum%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence in pseudoxanthoma elasticum.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (14), 6159-6165 (2017).</li>
<li>Burke, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+in+recessive+Stargardt+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2841-2852 (2014).</li>
<li>Armenti, S. T., Greenberg, J. P., Smith, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+for+the+evaluation+of+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence for the evaluation of retinal diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53577(2016).</li>
<li>Pröbster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+in+the+developing+and+maturing+healthy+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence in the developing and maturing healthy eye.</a> Translational Vision Science and Technology. 10 (2), 15(2021).</li>
<li>Duncker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+and+optical+coherence+tomography+in+PRPH2%2FRDS-+and+ABCA4-associated+disease+exhibiting+phenotypic+overlap%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in PRPH2/RDS- and ABCA4-associated disease exhibiting phenotypic overlap.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3159-3170 (2015).</li>
</ol>

Leon von der Emde 报告已收到来自 Heidelberg Engineering 的付款。Merten Mallwitz 无任何财务披露。Kenneth R. Sloan 同样无任何财务披露。Frank G. Holz 报告曾接受 Acucela、Alcon (C)、Gyroscope Allergan Apellis、Bayer Bioeq/Formycon、CenterVue、Roche/Genentech、Geuder、Ivericbio、NightStarX、Novartis、Optos、Oxurion、Pixium Vision、Stealth BioTherapeutics、Zeiss 以及 GRADE 阅读中心的咨询费或个人付款。Thomas Ach 报告曾接受 Bayer、Apellis、Roche 和 Novartis 的咨询费或个人付款。

本工作流程逐步指导如何使用开源的 FIJI 插件工具来测定和比较与年龄相关性黄斑变性（AMD）特异性病灶的自发荧光（AF）。这些插件提供了易于使用的模板，无需任何编程知识，医师可在无需技术支持的情况下独立应用27。据我们所知，这些工具是目前唯一可用于病灶特异性自发荧光定量分析的工具。
定量自发荧光（QAF）值在视网膜上自然存在差异，由于视网膜内脂褐素和黑色素脂褐素分布不均、血管自发荧光较低以及黄斑色素分布不均，周边部QAF值较高，而黄斑区较低。由于视网膜中自然存在的QAF水平变异较大，直接分析病灶的绝对QAF值并非一种可靠的方法。例如，周边部的低自发荧光病灶其绝对QAF值仍可能高于黄斑区生理性的荧光水平。采用标准视网膜（StandardRetina）以及使用z分数来测量玻璃膜疣的荧光水平，可校正这种自然存在的QAF值变异。
z分数是一种用于衡量感兴趣区域的数值相对于标准视网膜（StandardRetina）均值关系的数值指标。其计算方法为：将个体在标准视网膜相同位置的数值减去该位置的均值，再将所得结果除以标准差。这种标准化方法使得不同QAF图像之间可以进行比较，因为z分数表示某一数值偏离均值的标准差数量。正的z分数表示该数值高于均值，而负的z分数表示该数值低于均值。
需要注意的是，可能存在一些应予以考虑的潜在问题。尽管该方法考虑了眼底不同区域自发荧光（AF）水平的差异，但它可能仍不是测量和比较视网膜色素上皮（RPE）自发荧光的最准确方法。个体之间黄斑部叶黄素色素的含量和分布存在差异，且病变可能影响覆盖其上的视网膜的透光性28,29。因此，在玻璃膜疣样沉积物（SDD）区域测得的自发荧光降低（见代表性结果）可能是由于遮蔽效应所致，而非RPE内荧光团减少30,31,32。
我们目前正在开发一种工作流程，利用线性混合模型来校正视网膜反射率、厚度以及黄斑色素的量化（使用绿色和蓝色自发荧光）。此外，目前的定量自发荧光（QAF）技术采用基于年龄的校正因子来校正晶状体混浊，但该方法忽略了同龄受试者之间晶状体混浊程度的个体差异33。因此，我们正在开发一种针对个体化晶状体自发荧光和混浊的校正因子工作流程。为了可靠地从小病灶中提取自发荧光信息，需要具备足够的QAF图像的测试-重测可靠性。为进一步区分哪些QAF图像适合进行更详细的分析，我们正在研究&#34;QAF图像可靠性指数&#34;，以预测QAF图像的测试-重测可靠性。在现阶段，稳妥的做法是采集重复图像，并评估病灶特异性自发荧光的重测可靠性。
额外分析病灶等值壳（iso-hulls）的方法在技术上难以实现，因为邻近病灶的等值壳会发生融合。融合区域的等值壳可根据所考虑的病灶不同而表现出不同的特征。我们的解决方案是将同一类型的全部病灶视为一个整体病灶，并将其周围区域作为联合等值壳进行分析。然而，该方法显著降低了对单个玻璃膜疣（drusen）等值壳的测量能力，可能被视为该技术的又一局限性。未来若能采用更复杂的技术手段来处理融合的等值壳，或在融合区域暂停报告自发荧光（AF）信号，将有助于进一步推动病灶周围区域AF信号的分析。
本研究以年龄相关性黄斑变性（AMD）作为模型疾病，该工作流程也可用于研究其他疾病的病灶。迄今为止，定量自发荧光（QAF）已应用于多种脉络膜视网膜疾病，包括隐性Stargardt病、Bestrophin-1相关疾病、各种形式的视网膜色素变性、急性区域性隐匿性外层视网膜病变、弹性纤维假黄瘤以及其他疾病17,33,34,35,36,37。由于该工作流程采用开源软件，我们鼓励其他研究者复制本研究方法，以确定特定病灶的自发荧光（AF）水平，从而拓展对视网膜疾病的认识。总之，我们提出了一种用于测定和比较黄斑区不同视网膜病灶AF水平的工作流程。该流程为深入分析AF特征奠定了基础，并可能促进AMD及其他视网膜疾病中新生物标志物的开发。

眼底自发荧光（FAF）成像可对眼底自然存在或病理状态下出现的荧光团进行无创性成图1。最常见的蓝光（488 nm 激发）自发荧光（AF）可激发视网膜色素上皮（RPE）中的脂褐素和黑色素脂褐素颗粒2,3,4。这些颗粒的分布及其增加或减少在正常衰老过程以及多种视网膜疾病（包括年龄相关性黄斑变性（AMD））中起着核心作用5。
FAF 的进一步发展——定量眼底自发荧光（QAF）——现在可实现对视网膜自发荧光强度进行准确的地形定位分析4,6。通过在 FAF 成像设备的光路中引入参考标准，可在不同设备、不同时间点及不同受试者之间比较自发荧光强度。该技术促使人们对年龄相关性黄斑变性（AMD）中一个假定的致病因素产生了范式转变，长期以来该因素被认为是由视网膜色素上皮（RPE）细胞中脂褐素过度积聚所致7。然而，组织学和临床的自发荧光定量研究表明，AMD 中的自发荧光实际上是降低的（这是由于自体荧光性脂褐素和黑素脂褐素颗粒的重新分布和丢失），而非先前推测的升高8,9,10。
监测房颤具有临床意义。Von der Emde 等人及其他研究者已表明，在高风险的中晚期年龄相关性黄斑变性（AMD）患者眼中，房颤不仅降低，且随着 AMD 病程进展进一步下降。8,9此外，组织学研究表明，大多数受年龄相关性黄斑变性（AMD）影响的视网膜色素上皮（RPE）细胞在RPE细胞丢失之前，会表现出颗粒聚集和外排的特征性行为。 通过 下陷、脱落、迁移或萎缩13,14,15,16这进一步表明，房颤的丧失可能是疾病进展的触发因素或替代性信号。
迄今为止，自发荧光（QAF）研究仅使用预制的网格极坐标系统（如QAF8/Delori网格）在全球范围内评估后极部的自发荧光17。采用预制网格测量自发荧光会导致每位受试者每只眼的预定区域产生多个自发荧光值。以这种方式分析自发荧光值可能遗漏具有病理性改变的局部区域中的变化，例如年龄相关性黄斑变性（AMD）中位于或邻近玻璃膜疣或视网膜下玻璃膜疣样沉积物（SDDs）的区域。尤其是SDDs，与进展为晚期AMD和视力丧失的高风险相关。特别是玻璃膜疣通常在多年内逐渐增大，并可能在萎缩发生前迅速恶化。可以设想，在AMD中，整体自发荧光可能降低，但在这些特定的疾病相关局灶性病灶内部及周围，自发荧光可能升高，或进一步降低。
不同的局部自发荧光（AF）模式也可能对疾病进展具有预后意义。例如，自发荧光水平可用于评估玻璃膜疣是否在增大，或是否已进入萎缩消退阶段。已有研究表明，地图样萎缩病灶周围异常的AF模式在很大程度上会影响萎缩随时间的进展过程18。此外，局部自发荧光模式还可进一步揭示视网膜色素上皮（RPE）的健康状况。很多时候，光学相干断层成像（OCT）显示脉络膜毛细血管层出现高反射信号，而RPE层看似完整。结合局部定量自发荧光（QAF）数值与OCT的多模态方法，可能有助于区分那些具有高风险RPE破坏及即将发生萎缩的病灶。
在研究中未进行空间分辨分析的原因之一是，最常用的制造商软件未提供用于此类分析的工具。不同病变的自发荧光（AF）特性随年龄相关性黄斑变性（AMD）疾病阶段而变化，这可能进一步解释AMD的发病机制。因此，开发一种能够测量区域性、病灶特异性自发荧光的工具将具有重要意义。为了准确比较位于视网膜不同区域的病灶，该工作流程需要能够校正人眼眼底自发荧光程度的差异19。其中，黄斑中心区域的自发荧光通常较低，这主要是由于黄斑色素的遮蔽效应以及颗粒数量的差异所致20,21。
自发荧光（AF）在距黄斑中心凹约9°处（即各个方向上到中心凹的距离）达到峰值，并在更远的周边区域显著减弱4。因此，若直接比较来自软性玻璃膜疣（位于黄斑中心凹及旁中心凹低AF区域）和SDDs（位于旁中心高AF区域）的AF绝对值，所得结果将不具备可比性22。受Pfau等人研究以及敏感度损失概念（在年龄相关性黄斑变性[AMD]中，将健康对照组的视野隆起区[即视网膜敏感度随距中心凹距离增加而下降]进行校正，用于眼底控制性视野检查）的启发，本研究将AF值与整个黄斑区内标准化的AF值进行比较23,24。结果以z分数形式报告（即感兴趣区域数值相对于均值的标准化数值度量）。
本研究旨在评估一种新工具在测量年龄相关性黄斑变性（AMD）患者不同类型病灶局部定量自发荧光（QAF）水平中的应用。该工具用于测量在光学相干断层扫描（OCT）图像上识别出的病灶的自发荧光水平，从而实现对软性玻璃膜疣或小玻璃膜疣沉积物（SDDs）等病灶局部自发荧光水平的评估，并可追踪病灶随时间推移的自发荧光变化。该工具的潜在价值在于提供一种新的结构生物标志物，用于评估视网膜色素上皮（RPE）的健康状况，并可能对所研究的病灶具有预后意义。

<table><tbody><tr><td>BatchStandardRetina 插件</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td></tr><tr><td>FIJI（Image J）</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td></tr><tr><td>Mark_Bscans_OCT 插件</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td></tr><tr><td>Microspft office</td><td>Microsoft</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td></tr><tr><td>QAF_xml_reader 插件</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td></tr><tr><td>Register_OCT_2 插件</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td></tr><tr><td>Spectralis</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>n.a.</td><td>QAF 扩展</td></tr><tr><td>StandardRetina 插件</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td></tr></tbody></table>

一种定量分析年龄相关性黄斑变性病变特异性眼底自发荧光变化的工作流程

A Workflow to Quantitatively Determine Age-Related Macular Degeneration Lesion-Specific Variations in Fundus Autofluorescence

眼底自发荧光（FAF）成像可对眼底固有荧光团进行无创性定位，特别是视网膜色素上皮（RPE）的荧光团，如今借助基于共焦扫描激光检眼镜的定量自发荧光（QAF）技术，已可实现量化分析。研究显示，在年龄相关性黄斑变性（AMD）患者中，后极部QAF信号总体呈降低趋势。然而，QAF与各类AMD病变（如玻璃膜疣、视网膜下玻璃膜疣样沉积物）之间的关系尚不明确。
本文描述了一种用于确定年龄相关性黄斑变性（AMD）中病灶特异性定量自发荧光（QAF）的工作流程。一种多模态 体内 采用成像方法，包括但不限于谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）黄斑区容积扫描和自发荧光成像（QAF）。利用定制的FIJI插件，将相应的QAF图像与SD-OCT扫描获得的近红外图像进行配准（依据特征性解剖标志，如血管分叉处）。在OCT图像中标记中心小凹及视神经乳头边缘，并将这些标记转移至配准后的QAF图像，以精确定位分析网格。
随后可在单个OCT B扫描图像或QAF图像本身上标记与年龄相关性黄斑变性（AMD）相关的病灶。为校正眼底不同区域QAF值的平均值和标准差差异，需建立规范化的QAF图谱（通过取代表性AMD组的QAF图像平均值，构建出标准化的视网膜QAF AMD参考图谱）。插件将记录所标记区域的X和Y坐标、z分数（一种数值度量，用于描述QAF值相对于自发荧光（AF）图谱平均值的标准差倍数）、平均强度值、标准差以及标记的像素数量。该工具还可计算所标记病灶边缘区域的z分数。&#160;这一工作流程及分析工具将有助于加深对AMD发病机制的理解，并提升临床AF图像解读的准确性。

查看输出结果 
为了充分分析结果并得出结论，理解 Mark_Bscans_OCT 的输出文件至关重要。前三个列分别标注为病例编号、文件的侧别以及所选择的成像模式。第四列以模式命名，并标记为z分数。需要注意的是，截至撰写本文时，Mark BScans 仅能一次性计算所有病灶；表格中的每一行对应一个等值壳层（iso-hull），其距病灶外缘的距离在电子表格的下限和上限列中指定。等值壳层用于测量病灶周围特定周长范围内的自发荧光（AF）z分数（在定量自发荧光QAF情况下）。注意，等值壳层中像素的最小值可在标记为min的列中找到，而标记为median、max、mean和stdev的列则分别包含该等值壳层内像素值的中位数、最大值、均值及标准差。列n包含一个等值壳层中的像素总数。图1展示了一名84岁男性患者（患有中度年龄相关性黄斑变性，iAMD）单个标记的软性玻璃膜疣。
图2 显示了一名代表性患者的左眼，其SDD病灶由QAF-Workflow工具标记（图3）。该患者的SDD病灶区域表现为自发荧光（AF）降低（z分数 = -0.4 ± 0.2）。类似地，SDD周围等信号轮廓区（iso-hulls）的AF也较标准视网膜（StandardRetina）降低（例如，最近的等信号轮廓区 = -0.3 ± 0.3）。这一现象可能的解释是SDD病灶对视网膜色素上皮（RPE）产生的遮蔽效应（透光性降低）。SDD的应用具有代表性，该工具还可用于评估其他病灶（如玻璃膜疣）的局部AF水平，并支持对病灶随时间推移的AF变化进行追踪。
<img alt="通过病灶检测进行视网膜成像分析；包含定量评估数据表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65238/65238fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：一名84岁男性患者单个显著软性玻璃膜疣，诊断为中度年龄相关性黄斑变性（iAMD）。（A）左眼的QAF图像，显示标记的玻璃膜疣。（B）玻璃膜疣的放大图：棕色中心代表标记的玻璃膜疣，彩色条带代表周围的等值轮廓（iso-hulls）。下方表格展示了输出文件。QAF玻璃膜疣数值与标准视网膜（StandardRetina）中相应偏心度的QAF值进行比较，从而得出z分数，表示与无病变区域均值的偏离程度。蓝色框从左到右显示：病例ID、眼别、成像方式及所需输出结果（本例为z分数）。橙色框内的列表示测量区域的边界（单位为毫米，lower = 下限，upper = 上限）。绿色框标注了显示QAF测量值的列，从左到右依次为：最小值、中位数、最大值、像素数量、均值及均值的标准差。每一行代表一个等值轮廓，蓝色框内的行表示病灶内部的数值，紫色框内的行表示围绕每个病灶的等值轮廓（由上至下，距病灶距离递增）。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65238/65238fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示视神经和血管的视网膜分析；用于模式识别的像素映射示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65238/65238fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：一名80岁女性早期年龄相关性黄斑变性（AMD）患者的定量自发荧光（QAF）图像中显著标注的SDD。（A）QAF图像中可见SDD。同一QAF图像显示了SDD的叠加标注。（B）在每个标注病灶周围，以颜色编码方式描绘出等值轮廓（浅绿色、深绿色和红色）。（C）蓝色矩形区域的放大图。每个SDD的外缘以蓝色标出。缩写：QAF = quantitative autofluorescence（定量自发荧光）；AMD = age-related macular degeneration（年龄相关性黄斑变性）；SDD = subretinal drusenoid deposit（视网膜下类 drusen 沉积物）。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65238/65238fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="视网膜图像处理工作流程；OCT配准、平均化、标注、分析图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65238/65238fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：确定病灶房颤（AF）的流程。 该图展示了确定病灶特异性 AF 所需的软件插件。A图像显示了一个彩色编码的QAF图像，可用于可视化QAF值的分布，但不应用于进一步分析. (B前景显示一幅QAF图像，背景为SD-OCT扫描的红外图像，用于通过血管分叉可视化对齐情况。此操作可使用Register_OCT_2插件完成。C) 用于测量病灶 z 值的标准视网膜图（StandardRetina）。可通过 StandardRetina/BatchStandardRetina 创建标准视网膜图。D) 一幅B扫描图像，蓝色箭头指向SDDs，黄色线条标出其位置（注：无论在z方向上的具体位置如何，病灶始终标记在RPE下方）。E所有标记的病灶均可见于QAF图像上（参见 图1）。最后两个步骤使用 Mark_BScans_OCT 插件完成。缩写：AF = 自发荧光；QAF = 定量自发荧光；SDD = 视网膜下玻璃膜疣沉积物；IR = 红外；RPE = 视网膜色素上皮；SD-OCT = 光谱域光学相干断层成像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65238/65238fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本研究描述了一种工作流程，用于在考虑眼底不同区域自发荧光水平变化的情况下，测定并比较来自特定感兴趣区域（例如年龄相关性黄斑变性 [AMD] 中的玻璃膜疣和视网膜下玻璃膜疣样沉积物）的自发荧光水平。

眼底自发荧光（FAF）成像可实现对眼底内在荧光团的无创性成像，尤其是视网膜色素……

迄今为止，定量自发荧光（QAF）分析仅限于使用预制网格对眼后极部的总体自发荧光进行分析。我们的方案可实现对特定感兴趣区域的自发荧光强度进行测量和比较。QAF 发现，在年龄相关性黄斑变性中，自发荧光强度降低。事实上，这一重要发现与年龄相关性黄斑变性（AMD）中病理性脂褐素积聚的传统观点相矛盾。如今，新的视网膜色素上皮细胞水平的组织学数据可以很好地证实这些临床发现。眼底的特征性自发荧光水平表现出显著的区域差异。自体荧光与视杆感光细胞密度之间似乎存在密切关系。要准确比较自体荧光，需要考虑区域差异，这具有挑战性。我们首次证实，年龄相关性黄斑变性（AMD）的典型病灶（如玻璃膜疣）除了患者整体自体荧光水平降低外，其自体荧光强度进一步下降。目前，我们正致力于对活体及离体条件下视网膜色素上皮中荧光基团所发射光的光谱分析。通过这一方法，我们希望更深入地了解健康与病变眼组织中光感受器及视网膜色素上皮的生理与病理生理学特征。

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定量确定年龄相关性黄斑变性病变性病变性眼底自发荧光特异性变化的工作流程

视网膜色素上皮（RPE）通过回收视觉循环副产物支持感光视网膜，这些副产物会以脂褐素形式累积。这些物质具有自发荧光性，可进行定性成像 体内本文介绍了一种利用共焦扫描激光眼底成像技术对视网膜色素上皮细胞脂褐素进行定量成像的方法。...

视网膜疾病评估中的定量眼底自发荧光技术

实验室检测可利用基于光学相干断层扫描（OCT）的年龄相关性黄斑变性（AMD）多模态纵向成像的预后价值。在组织切片前，对患有和不患有AMD的人类供体眼球分别进行OCT、彩色成像、近红外反射扫描激光检眼镜以及两种激发波长下的自发荧光成像。...

离体 基于OCT的多模态成像技术用于年龄相关性黄斑变性的人类供体眼研究

在缺乏明确表型标志物的小鼠骨髓移植模型中，确定供体细胞植入情况具有挑战性。我们描述了一种定量分析雄性供体细胞在雌性移植受体小鼠中植入程度的方法。该方法适用于所有小鼠品系，可用于造血干细胞（HSC）功能的研究。...

利用定量实时 PCR 检测在竞争性小鼠骨髓移植模型中供体细胞的植入情况

通过尾静脉注射进行吲哚菁绿血管造影（ICGA），可获得高质量的ICGA时程图像，用于表征小鼠脉络膜的异常情况。...

通过时间序列吲哚菁绿血管造影检测年龄相关性黄斑变性小鼠模型中脉络膜血管的异常

焦点形成实验提供了一种简单直接的方法，用于评估候选癌基因的转化潜能。...

焦点形成：一种基于细胞的检测基因致癌潜能的实验方法

视网膜图像分析是一种用于可视化微循环的无创性操作。心血管疾病危险因素的影响可能导致视网膜血管管径发生变化。本文描述了获取眼底图像的操作流程以及计算血管管径的具体步骤。...

眼底摄影作为流行病学研究中用于观察心血管疾病危险因素对微血管反应影响的便捷工具

微生物群体中存在显著的细胞异质性，这种异质性可决定群体的整体行为。通过流式细胞术进行分子探针分析能够确定细胞的生理状态，但其应用效果在不同物种之间存在差异。本研究提供了一种准确测定蓝细菌群体中细胞死亡率的实验方案，可避免低估细胞死亡率或产生假阳性结果。...

利用流式细胞术优化分子探针以测定光合生物（Microcystis aeruginosa）的细胞死亡率

本文介绍了一种在老年雌性大鼠中建立永久性远端大脑中动脉闭塞的实验方案，同时闭塞颈动脉以产生较大的皮层梗死灶并形成持续性神经功能缺损。我们通过脑卒中后24小时和8周时的结构磁共振成像（MRI）验证了梗死灶的大小。...

在老年大鼠中实施永久性远端大脑中动脉联合颈总动脉闭塞以研究伴有持续性功能障碍的皮层缺血

骨关节炎（OA）或退行性关节疾病是一种致残性疾病，常伴有疼痛，而现有镇痛药物对其缓解作用有限。目前正开发动物模型以增进对骨关节炎相关疼痛机制的理解。本文描述了小鼠单碘乙酸钠骨关节炎疼痛模型的建立方法。...

小鼠骨关节炎疼痛的单碘乙酸盐模型

眼底摄影通常需要专用的眼底相机，但这类设备并非在所有临床环境中都具备。 本文介绍一种使用智能手机摄像头和常规高正度手持间接检眼镜镜片记录眼底图像的简单方法。...

智能手机眼底摄影

了解定量自发荧光分析工作流程，用于测量年龄相关性黄斑变性特定区域的自发荧光强度变化。该方法揭示AMD病变中自发荧光降低，为视网膜生理病理学研究提供新见解。

一种定量分析年龄相关性黄斑变性病变特异性眼底自发荧光变化的工作流程

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