Name: 用于荧光和共聚焦成像的玉米叶原基横向切片和展开整片的制备方法的改进方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 学习改进的玉米叶原基横向切片和整片展开方法，利用荧光和共聚焦成像技术观察植物发育。该方法提高了切片准确性，可用于研究禾本科植物叶片解剖结构和发育特征。

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作者感谢玉米遗传合作组织（Maize Genetics Cooperation）、玉米细胞基因组学项目（Maize Cell Genomics Project）、Dave Jackson（冷泉港实验室，纽约）、Anne W. Sylvester（海洋生物学实验室，芝加哥大学，伊利诺伊州）、Andrea Gallavotti（罗格斯大学，新泽西州）以及Carolyn G. Rasmussen（加州大学河滨分校）提供突变体和转基因材料；同时感谢密苏里大学哥伦比亚分校先进光学显微镜核心设施（Advanced Light Microscopy Core）的Robert F. Baker和Alexander Jurkevich在共聚焦显微镜实验方面的协助。JMR的研究得到了J. William Fulbright奖学金、Diane P.和Robert E. Sharp基金以及美国国家科学基金会植物基因组研究计划（IOS-1546873，项目负责人：PM）的资助。&#160;CDTC、CMRV、EDCDP 和 RJRR 获得雅典耀大学学院奖学金项目的资助。CDTC、EDCDP 和 RJRR 获得菲律宾科技部-科学教育研究所（DOST-SEI）奖学金项目的资助。&amp;#38;T 本科生奖学金。DODL 获弗朗西斯·斯坦布格勒神父学术奖学金（Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship）资助。RJRR 获 Aiducation International–高等教育之路奖学金（Aiducation International–Pathways to Higher Education Scholarship）资助。本研究得到马尼拉雅典耀大学理学与工程学院及黎刹图书馆（School of Science and Engineering and the Rizal Library, Ateneo de Manila University）的支持。

Improved Methods for Imaging Maize Leaf Primordia

作者无任何利益冲突需要披露。

我们介绍了两种用于玉米叶片原基细胞成像的制备方法。第一种方法（方案第2部分）允许对原基进行测量，以便进行横切面分析；第二种方法（方案第3部分）则可将原基展开并压平，用于整体装片分析。这些方法有助于对玉米叶片原基中的荧光蛋白（FPs）进行细胞水平成像24（如图4和 图5所示），并为成像发育中玉米叶片所面临的挑战提供了简便的解决方案。方案第2部分通过在切片前直接测量原基尺寸，而非仅依赖发育分期参数9,16，从而缩短了解剖时间并提高了取样准确性。利用市售的纳米胶带，方案第3部分解决了长期以来难以对玉米整片叶原基进行成像的问题。该方案改进了此前使用透析管的方法31，且相较于CT和MRI技术11,32,33，成本显著降低。然而，在可视化叶片解剖特征及获得最佳成像结果方面，这两种方案均存在一定局限性，具体如表2所列，并在下文中进一步详细讨论。
在方案第2部分中，我们在观察叶原基较厚的横切面时难以清晰分辨细胞轮廓，使用细胞壁或质膜结合型荧光染料进行复染也未能获得满意结果。例如，FM 4-64 的染色效果相较于质膜荧光蛋白标记物 pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39（PIP2-1-CFP；图3A-D）较差。为克服这一局限，我们建议使用振动切片机制备更薄的组织切片（约0.1 mm）58，以实现细胞轮廓清晰的明场成像，或优化复染方案47,59。
在方案第3部分中，主要局限在于固定叶片时难以避免撕裂、损伤或产生气泡，具体如方案步骤3.2.5-3.2.6所述（图3E-K）。由于玉米叶片为两侧对称结构，因此仅固定半片叶片可能已足以实现观察9。为此，可在将叶原基展开至中脉后，沿纵轴用剃刀片将其切开，仅固定其中一半。方案第3部分的另一局限是叶片厚度可能限制深部成像时荧光信号的光学分辨率。为解决此问题，可采用组织透明化技术60。然而，我们发现常用于植物组织成像的透明化试剂ClearSee61与本方案不兼容，因其会导致样品及盖玻片从纳米胶带脱落。一种可能的解决方案是在叶片样品上覆盖一层半透膜31，使样品在纳米胶带固定下仍可接受透明化溶液处理。此类允许液体溶液作用于展开叶片的方法，也可用于整体原位RNA杂交（whole-mount RNA in situ hybridization）和免疫定位（immunolocalization）技术，这些技术此前已在发育中的玉米花序中优化，但尚未应用于完整的叶原基62,63。
我们描述了玉米的实验方案，玉米在苗期就具有较大的叶原基。对于叶原基小得多的其他禾本科物种，如水稻、大麦、小麦、狗尾草（Setaria）和短柄草（Brachypodium）16,23,64,65,66，可能需要使用额外的精密工具才能有效应用这些方案。此外，这些方案并非针对活细胞成像而设计，活细胞成像能够捕捉组织形成和细胞响应的实时动态过程。然而，随着植物活细胞成像中荧光探针、成像技术及计算能力的不断进步67，未来的研究可在此基础上发展出针对禾本科植物叶原基独特特征的活细胞成像策略。

禾本科作物是全球人口重要的食物和生物燃料来源1，改善其叶片解剖结构有望提高作物产量2,3。然而，目前对禾本科植物叶片解剖结构调控机制的理解仍然有限4，亟需对叶原基进行分析，因为叶片的许多解剖和生理特征在发育早期即已预先决定5,6,7。细胞成像技术（如荧光成像和共聚焦成像）对于研究禾本科植物叶片解剖结构和细胞特征至关重要，但由于叶原基深陷并卷曲包裹于叶环内部，这些技术难以应用于禾本科叶原基的研究。为解决这一问题，我们建立了用于制备玉米叶原基横切面和展开的全叶装片的方法，以实现对这一禾本科叶片解剖与发育研究模式系统2,8的荧光与共聚焦分析。
玉米叶片与所有禾本科植物的叶片一样，由带状的叶片和包裹茎秆及发育中茎尖的叶鞘组成9,10,11,12,13。叶片以对生方式从茎尖分生组织（SAM）发育而来，每片新叶在相对于前一片叶的相反位置起始，从而在垂直轴上形成两列叶片（图1A）14。每个叶原基的发育阶段以其相对于SAM的位置来确定，最靠近SAM的原基被定义为 plastochron1（P1），随后的原基依次为P2、P3等（图1B,C）2。在发育过程中（图1D），叶原基最初在SAM基部周围呈现为新月形的突起（P1），随后生长为覆盖分生组织的帽状结构（P2）9,10,11。帽状结构的基部边缘随后向两侧扩展并相互重叠，随着顶端向上生长，形成圆锥形的原基（P3-P5）10。此后原基迅速伸长，在基部叶鞘与叶片交界处，由于叶舌（叶片近轴面一侧的 fringe-like 结构）的形成，该边界变得愈加明显（P6/P7）。最终，在稳态生长过程中，叶片从叶环中展开，此时细胞分裂局限于叶片基部较小的区域，沿近-远轴方向形成细胞扩展与分化的梯度（P7/P8）15。玉米幼苗的茎尖包含多个处于不同发育阶段的叶原基，是研究叶片发育的优良模型8。
准确分析叶片早期发育需要进行分期，或使用标准化标准，以根据其他生长或形态参数来定义原基发育的不同阶段。由于禾本科植物的叶原基隐藏在茎尖内部，研究者通常采用植株年龄或新出现叶片的大小等参数，作为预测叶原基所处阶段和大小的依据9,16。在玉米中，植株的时间年龄可通过播种或萌发后的天数（DAP/DAG）来确定17,18。营养期（V期）则由最上部具有可见叶环的叶片决定；叶环是叶片与叶鞘交界处远轴面的一条浅色线条，对应于叶舌和耳状体的位置，后者为叶片基部的一对楔形区域（图1A,B）17,19。在萌发后20至25天之间，茎尖分生组织（SAM）转变为花序分生组织，不再产生新的叶片20。玉米叶原基的生长速率可能因环境条件和植株基因型的不同而有所变化。因此，仅依靠植株年龄和新出叶片的大小无法准确预测叶原基的大小；然而，利用这些参数仍有助于在实验中预测叶原基所处阶段和大小的范围。
横切面分析是研究玉米及其他禾本科植物叶片解剖结构与发育的常用方法，因为它能够在单个切片中跨越茎尖一次性取样多个叶原基发生周期（plastochron）21,22,23。该方法也便于对新鲜样品进行细胞成像，因为周围的叶片可作为支架，在切片和制片过程中使叶原基保持在原位24。然而，该方法的一个缺点是在对完整茎尖进行切片时，难以精确定位目标叶原基发生周期及原基内的特定区域。此外，由于叶片生长在不同叶原基发生周期以及近-远轴方向上存在差异2,5，取样不精确可能导致对切片中叶原基发育阶段和区域的错误判断。因此，建立一种精确的横切面取样方法，对于确保禾本科植物叶原基解剖学与发育分析的准确性与可重复性至关重要。
整叶制片分析能够对发生在整个器官尺度上的组织和细胞过程进行系统而综合的研究，例如增殖性生长25和叶脉模式形成26,27,28。该方法可提供叶片的平行表面整体视图，有助于发现那些通过横切面分析难以检测到的独特过程和模式24,27。与拟南芥中已有成熟的整叶制片成像方法29,30不同，目前尚无针对禾本科植物未展开整叶制片成像的标准方法。先前一项关于展开分离玉米叶原基的实验方案使用了不常见的材料，且不适用于细胞水平的成像31。先进的成像技术，如计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI），可在无需分离和展开原基的情况下获取三维解剖信息11,32,33，但这些技术成本高昂，并需要专用设备。开发一种能够克服玉米及其他禾本科植物叶原基卷曲和圆锥形形态限制的技术，将有助于推动对其解剖结构和发育特征的深入研究。
本文介绍了制备玉米叶原基横切面和展开的整体装片的方法，用于荧光和共聚焦成像。我们利用这些方法结合荧光蛋白（FPs）24，对玉米叶原基中的维管数目进行定量，并绘制其时空激素分布图。第一种方法是使用剥线钳去除玉米幼苗较老叶片的上部组织（图1E）。通过暴露叶原基尖端（P5-P7），可在不完全移除周围较老叶片的情况下测定其长度，从而实现简便而精确的切片操作。第二种方法是利用透明双面纳米胶带将整片叶原基（P3-P7）展开并固定（图1F）。这些方法适用于多种荧光蛋白的可视化24，但在使用荧光染料和透明试剂时需要进一步优化。此外，我们还概述了在ImageJ/FIJI34中对z轴层扫图像进行展平、图像拼接和通道合并的一些操作步骤，这些处理适用于上述两种方法所获得的图像。这些方法不仅适用于玉米叶片的常规荧光或共聚焦成像，也可推广应用于其他模式禾本科植物，如水稻、狗尾草（Setaria）和短柄草（Brachypodium）。
<img alt="显示叶片发育阶段、切片步骤和成像技术的植物切片与成像过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：玉米叶原基的结构与形态及方法概览。（A）玉米幼苗的示意图。玉米具有对生叶序，新叶在前一片叶的对侧位置起始发育。叶片编号表示自萌发以来叶片出现的时间顺序（即第一叶，L1；第二叶，L2；第三叶，L3；依此类推）。每片叶包括远端的叶片和基部的叶鞘，两者之间由叶环分隔，对应于叶舌和叶耳。最上方可见叶环的叶片指示植株所处的营养生长阶段。本示例中的幼苗处于V2阶段，L2叶环（箭头）可见。剪刀图标表示在中胚轴（me）处剪切幼苗以进行取样的位置。（B）解剖后的茎尖示意图，显示分离出的L1至L4叶，而L5至L9叶原基在（C）中以放大图展示。叶原基的叶龄期（plastochron）编号表示其相对于茎尖分生组织（SAM）的位置，最年轻的叶原基（P1）最靠近SAM，较老的叶原基（P2、P3、P4等）依次远离2。（D）玉米P1至P5叶原基形态的示意图。（E）玉米叶原基横切面分析方法的示意图概览。（1）使用剥线钳修剪较老的叶片。（2）测量叶原基并切割茎尖。（3）将切片置于载玻片上用于成像和后续处理（4, 5）。（F）玉米叶原基整体染色分析方法的示意图概览。（1）去除周围叶片以提取目标叶原基。（2）切开并将叶原基在纳米胶带上展平。（3）装载样品用于成像和后续处理（4, 5）。缩写：L = 叶；bl = 叶片；sh = 叶鞘；co = 叶环；me = 中胚轴；V = 营养期；P = 叶龄期；SAM = 茎尖分生组织。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>丙烯酸凝胶透明双面纳米胶带 5米 × 3厘米，厚2毫米</td><td>EZlifego 商店（亚马逊）</td><td>B07YB1ZXG6</td><td>1卷</td></tr><tr><td>Bellucci 探针曲头微型探针 16.8 厘米，6.6 英寸</td><td>Bausch &amp;& 罗姆</td><td>N1692 9</td><td>1 个</td></tr><tr><td>Clayman导向微探针Sinskey钩，弯轴，11.6 cm，4.6 in</td><td>Storz 眼科器械</td><td>E0542</td><td>1 个</td></tr><tr><td>牙科探针，弯头针，14 厘米（5.5 英寸）</td><td>Ted Pella</td><td>13553</td><td>1 个</td></tr><tr><td>DOWELL 10-22 AWG 剥线钳</td><td>道威尔商店（亚马逊）</td><td>10-22 AWG</td><td>1 件</td></tr><tr><td>双刃碳钢刀片</td><td>Ted Pella</td><td>121-9</td><td>pkg/10；用于精细切片</td></tr><tr><td>磨砂端玻璃显微镜载玻片，75 mm × 25 mm × 1–1.2 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260442</td><td>pkg/144</td></tr><tr><td>GEM 单刃，不锈钢未涂层刀片</td><td>Ted Pella</td><td>121-1</td><td>盒/200；用于常规切割/切片</td></tr><tr><td>甘油</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PI17904</td><td>1 升</td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI 配备 EDF 插件（版本 17.05.2021）和 Grid/Collection 拼接插件</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>版本 2.9.0/1.54秒</td><td>EDF 插件由 Alex Prudencio、Jesse Berent 和 Daniel Sage 为生物医学成像小组开发， &amp;Eacute;巴黎综合理工学院&amp;eacute;d&amp;eacute;洛桑联邦理工学院（EPFL；http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/）。网格/图像拼接软件由斯特凡·普赖比施（Stephan Preibisch）为马克斯·普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所（MPI-CBG）开发。</td></tr><tr><td>Kimwipes Ex-L 小号 111.76 毫米 × 213.36 毫米</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td>箱/280 英尺</td></tr><tr><td>微型盖玻片，22 mm × 22 mm × 0.13 - 0.16 mm 厚</td><td>Ted Pella</td><td>260140</td><td>1 盎司</td></tr><tr><td>PU凝胶透明双面纳米胶带 29.5 英尺 × 1.18 英寸，厚度 1 毫米</td><td>Yecaye 商店（亚马逊）</td><td>L354 W1.18</td><td>2卷</td></tr><tr><td>超滑盖玻片，24 mm × 50 mm × 0.13 - 0.16 mm 厚</td><td>Ted Pella</td><td>260166</td><td>1 盎司</td></tr><tr><td>超滑盖玻片，24 mm × 60 mm × 0.13 - 0.16 mm 厚</td><td>Ted Pella</td><td>260168</td><td>1 盎司</td></tr><tr><td>钢化玻璃切菜板</td><td>哈卡罗亚（亚马逊）</td><td>B09XMXBT5S</td><td>4 件</td></tr></tbody></table>

改进的玉米叶原基横切面与展平全组织制片方法用于荧光及共聚焦成像

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

在玉米（Zea mays）及其他禾本科植物（Poaceae）中，叶原基深陷并被包裹在叶鞘内，呈卷曲状态，这使得早期叶发育的研究十分困难。本文介绍了制备玉米叶原基横切面和展开的整体装片的方法，用于荧光和共聚焦成像。第一种方法使用剥线钳去除较老叶片的上部组织，暴露叶原基的顶端，以便准确测量并更精确地进行横切面取样。第二种方法使用透明双面纳米胶带将整个叶原基展开并固定，用于成像观察。我们展示了这两种方法在可视化和分析玉米中荧光蛋白报告基因表达方面的应用价值。这些方法解决了玉米叶原基独特形态结构所带来的技术挑战，将有助于在玉米及其他禾本科物种中对叶的解剖结构和发育特征进行可视化观察与定量分析。

玉米叶原基横切面分析 
我们采用第2部分的实验方案，利用荧光蛋白（FPs）对玉米叶原基横切面中的维管束数量进行定量，并表征激素响应模式。图 4)24为了评估植物激素生长素在叶片生长和叶脉形成中的作用，我们对一种生长素缺乏的玉米突变体的叶原基中的叶脉数目进行了定量分析。 vanishing tassel254在早期叶序中，发育中的叶脉在玉米叶原基的中层细胞层表现出明显的细胞分化。21,22然而，使用常规组织学技术识别和计数血管22 可能费时且劳动强度大。因此，为了定量分析维管束，我们采用了玉米生长素外排蛋白标记 pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP41 （以下称为PIN1a-YFP），可标记发育中的维管束和原形成层束（PCSs； 图4A）。利用第2节中的实验方案，我们能够在切片前通过测量原基来标准化横切面取样（图4B, C）。我们发现了一种趋势，即 vt2 原基更宽，叶脉比正常情况多（图4D，E)24，这与完全展开叶片的数据一致55，表明缺陷在于 vt2 在叶片发育早期便已开始。利用第2部分的实验方案，我们还能系统地检测激素响应FP报告基因在叶原基中的表达模式（见图像示例于 图4F-I通过标准化的横切面取样方案，我们绘制了生长素、细胞分裂素（CK）和赤霉素（GA）响应在叶原基不同叶序周期及区域中的分布图谱，发现了若干新的响应模式，我们推测这些模式对叶片生长和叶脉形成具有重要意义。24因此，这些代表性结果证明了方案第2部分在玉米叶原基横切面分析中的实用性。
<img alt="植物原基生长、PIN1a-YFP、图表、显微图像、植物学研究中的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：玉米叶原基横切面分析的代表性结果。 （A-E）利用生长素外排蛋白标记PIN1a-YFP对正常植株和vanishing tassel2突变体叶原基中维管束数目及原基宽度的定量分析。(A) 表达PIN1a-YFP的P5至P7期叶原基横切面的代表性荧光图像，显示发育中的维管束和原形成层束。使用配备FITC滤光片（激发波长495-519 nm）的落射荧光显微镜获取横切面图像。利用FIJI/ImageJ软件中的多点工具和自由手绘线工具分别对维管束数量和原基宽度进行量化。(B) 一株玉米幼苗，其上部叶鞘已被剥线钳移除，以暴露第四片叶（L4）的顶端。括号标示的是原基的投影长度，虚线表示其中点位置。(C) P5至P7期原基形态变化的示意图，说明在不同发育阶段，中点处（水平虚线）的维管束数量和原基宽度可能发生变化。(D,E) 正常植株与vt2突变体L4叶原基中点横截面上原基宽度(D)和维管束数量(E)的测量结果。趋势线表示测量值的10 mm滑动平均值，误差线为均值标准误（SEM）。(F-I) 表达多种荧光标记的叶原基横切面代表性共聚焦图像，包括PIN1a-YFP、生长素响应报告基因DR5-RFP、细胞分裂素响应报告基因TCS-Tomato、赤霉素响应标记GAR2-YFP，以及mDII-Venus（一种突变形式的生长素信号输入报告基因DII-Venus）。每幅图像中荧光通道信号叠加于明场通道之上。比例尺 = 200 µm (A)；10 mm (B)；100 µm (F-I)。本图经Robil和McSteen24许可修改并重印。缩写：DAG = 萌发后天数；P = 叶龄期（plastochron）；vt2 = vanishing tassel2；PCS = 原形成层束；YFP = 黄色荧光蛋白；FITC = 异硫氰酸荧光素；RFP = 红色荧光蛋白；PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP；DR5-RFP = DR5rev::mRFPer；TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato；GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP；mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
玉米叶原基的整体分析 
我们按照方案第3部分，对玉米叶原基全叶制片中的FP表达进行可视化与分析图5）。通过使用 PIN1a-YFP 可视化维管束模式，我们发现维管束的形成在早期叶序发生时期发生在整个原基中，但在发育后期该过程逐渐局限于近端区域。图5A)24与横切面分析相辅相成，全叶铺片分析揭示了维管束形成过程中激素响应在组织和发育阶段上的特异性模式24一个例子是CK响应报告基因TCSv2::NLS-tdTomato的表达模式37 (TCS-番茄)，相对于PIN1a-YFP表达（图5B)24通过遵循方案第3部分，我们能够对叶原基中的荧光蛋白（FP）表达进行定性和定量分析图 5D-F；未发表数据）。我们检测了生长素响应报告基因 DR5rev::mRFPer 的表达模式41 （DR5-RFP）以及一个对赤霉素响应的标记，pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 （GAR2-YFP）在单突变体和双突变体的整片叶制片中的表达 vt2 和 矮化植株3 (d3），一种赤霉素缺陷型突变体56 (图 5D）。我们还比较了正常与病变细胞间的相对增殖水平 vt2 利用p标记叶原基ZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 （细胞周期蛋白D2B-YFP），是细胞周期中G1/S期转换的标志物57 (图5E，F）。尽管正常组与 vt2，Cyclin-D2B-YFP 的表达与早期叶序发生周期中已知的细胞增殖模式一致31我们得出结论：方案第3部分是分析玉米叶原基整体装片的有效方法，此类样本因其卷曲形态而难以成像。
<img alt="植物发育，蛋白质定位分析，PIN1a-YFP，DR5-RFP，GAR2-YFP，荧光显微镜观察" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5玉米叶原基整体染色分析的代表性结果 (A) 7日龄玉米幼苗叶原基的代表性荧光图像，显示由生长素外排蛋白标记物PIN1a-YFP标记的发育中叶脉和原形成层束。P3-P6原基从基部切下，展开并展平，近轴面向上。插图为P3和P4的放大图像。在P5和P6中，虚线标示增殖区远端边界，该区域大部分原形成层束仍处于发育和延伸阶段。B，C代表性共聚焦图像，显示 PIN1a-YFP 和细胞分裂素响应报告基因 TCS-Tomato 在 P5 原基近轴边缘区域的表达。D) 正常植株及单突变体和双突变体中P4原基的代表性荧光图像，显示生长素响应报告基因DR5-RFP和赤霉素响应标记GAR2-YFP的表达情况 vanishing tassel2 和 矮化植株3. (EP3和/或P4期代表性的共聚焦图像，显示细胞周期G1/S期转换报告基因Cyclin-D2B-YFP的表达。F正常和P3/P4叶原基中细胞增殖的相对量 vt2 通过使用 ImageJ/FIJI 测量原基区域内 Cyclin-D2B-YFP 信号的积分密度来进行定量。柱状图表示平均测量值 ± 平均值的标准误。比例尺 = 500 µm (A、D、E); 200 µm (B); 100 µm (C). 图4A-C 已根据 Robil 和 McSteen 的授权进行修改和转载24，而 图 4D-F 为作者未发表的数据。缩写：DAG = 萌发后天数；P = 叶序期 vt2 = 花序消失2；d3 = 矮秆3 YFP = 黄色荧光蛋白；RFP = 红色荧光蛋白；PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP；TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato；DR5-RFP = DR5rev::mRFPer；GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP；Cyclin-D2B-YFP = pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP；ns = 无显著差异；au = 任意单位 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充文件 1：玉米幼苗叶片发育分期示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S1：实验方案中使用的植物样品和材料。（A,B）一株7-8天龄（DAG）的玉米幼苗，其上部叶鞘已用剥线钳去除。（B）插图显示茎尖部分的放大图像，其中P6原基暴露清晰。（C-G）去除上部叶鞘的玉米幼苗茎尖，用于横切面分析（C,D），以及完全去除周围叶片后用于整体装片分析的茎尖（E-G）。（H）一卷透明聚氨酯凝胶双面纳米胶带。（I,J）P6叶原基（I）和P8叶近端区域（J）被展开后，利用纳米胶带固定于载玻片上。（K）载玻片上固定有展开的叶原基，并置于落射荧光显微镜载物台上。缩写：DAG = 发芽后天数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

玉米叶片原基深陷于叶鞘中且呈卷曲状，难以进行研究。本文介绍了制备玉米叶片原基横切面和展平的整体装片的方法，适用于荧光和共聚焦成像。

在玉米（Zea mays）和其他禾本科植物（Poaceae）中，叶原基深陷于叶鞘内并呈卷曲状，难以进行研究……

像玉米这样的禾本科植物，其叶原基在茎尖内呈卷曲状态，难以进行研究。我们通过改进玉米叶片转移切片及激素处理的实验方案，解决了这一问题，从而更便于进行荧光和共聚焦成像。第一种方案使用剥线钳剪除较老的叶片，以便在切片前对叶原基进行测量。第二种方案使用透明双面纳米胶带展平完整的叶原基。这些方案提高了横切面切片的准确性，并实现了叶原基的展平，而由于叶原基具有卷曲的圆锥形态，此前极难实现。这些方法将有助于在玉米及其他禾本科植物中对叶的解剖学特征和发育性状进行可视化观察与定量分析。基于这些方法，我们计划开发生活方式成像策略，以研究禾本科叶片发育中的问题。首先使用小刀或剪刀在中胚轴组织处切取所需年龄的玉米幼苗。用画笔清洁幼苗。然后手持剥线钳，使其钳口朝向导槽。将导槽对准所选的孔位，并捏紧剥线钳的手柄。将剥线钳从导槽处向外滑动，以修剪叶片的上部。使用直尺测量从叶原基顶端到叶鞘基部的长度。开始叶原基成像时，将叶鞘置于体视显微镜下约0.8倍放大倍数处的平滑表面上并固定稳定。使用剃刀刀片或解剖刀，在目标区域略上方进行初步切割，以去除叶鞘的远端部分。然后沿原基的长度方向，在所需位置获取约 0.25 至 0.8 毫米厚的薄切片。完成后，将叶片切片置于洁净的载玻片上。用移液器向切片滴加几滴水，然后盖上盖玻片。如有需要，可从盖玻片边缘再滴加几滴。将载玻片置于落射荧光显微镜载物台上，调整设置以观察荧光染料。通过该方法，在切片前测量原基以实现横切取样的标准化。研究发现，vanishing tassel two 突变体的叶原基比正常植株更宽，且具有更多的维管束，表明该突变体的缺陷在叶片发育早期即已出现。该方法还可实现对激素响应荧光蛋白报告基因在叶原基中表达模式的系统性观察。开始制备载玻片时，先剪取一块矩形透明双面纳米胶带，将其粘贴至洁净载玻片中央，注意不要揭去胶带上表面的保护塑料膜。接下来，使用剥线钳去除老叶的上部，解剖导管。然后用牙科探针握住中胚轴并小心去除周围的叶片，以分离出目标原基。在固定原基时，需从胶带上撕下保护膜。将暴露的叶原基置于胶带上，用剃刀刀片在基部切割，弃去基部茎段和下胚轴。为更顺畅地展开，可将针尖浸入100%甘油，涂抹于叶内侧或近轴面以润滑。使用带有弯针的牙科探针展开原基。将针尖与表面平行放置，轻轻按压外基部边缘使其贴附于胶带上并展开。当外边缘已粘附在胶带上时，将针尖与叶片的长轴方向保持平行。轻轻将针头横向滑动，使叶片展开并平铺在胶带上。在展开的叶原基上滴加一滴水。立即在水滴和叶原基上放置盖玻片。轻轻按压盖玻片边缘，使其粘附于胶带上。完成后，将玻片置于落射荧光显微镜载物台上，以观察荧光染料。该方法用于观察和分析玉米叶原基中荧光蛋白的表达。与横切面分析相辅相成，全叶整体装片分析揭示了在发育过程中激素响应的组织特异性和阶段特异性模式。整体装片分析方法实现了对玉米叶原基中荧光蛋白表达的定性与定量分析，表明该方法在研究玉米叶原基方面具有有效性，而玉米叶原基由于其卷曲的形态结构，通常难以成像观察。

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生物学

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改进的玉米叶原基横切面与展平全组织制片方法用于荧光及共聚焦成像

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