改进的玉米叶原基横切面与展平全组织制片方法用于荧光及共聚焦成像

像玉米这样的禾本科植物，其叶原基在茎尖内呈卷曲状态，难以进行研究。我们通过改进玉米叶片转移切片及激素处理的实验方案，解决了这一问题，从而更便于进行荧光和共聚焦成像。第一种方案使用剥线钳剪除较老的叶片，以便在切片前对叶原基进行测量。

第二种方案使用透明双面纳米胶带展平完整的叶原基。这些方案提高了横切面切片的准确性，并实现了叶原基的展平，而由于叶原基具有卷曲的圆锥形态，此前极难实现。这些方法将有助于在玉米及其他禾本科植物中对叶的解剖学特征和发育性状进行可视化观察与定量分析。

基于这些方法，我们计划开发生活方式成像策略，以研究禾本科叶片发育中的问题。首先使用小刀或剪刀在中胚轴组织处切取所需年龄的玉米幼苗。用画笔清洁幼苗。

然后手持剥线钳，使其钳口朝向导槽。将导槽对准所选的孔位，并捏紧剥线钳的手柄。将剥线钳从导槽处向外滑动，以修剪叶片的上部。

使用直尺测量从叶原基顶端到叶鞘基部的长度。开始叶原基成像时，将叶鞘置于体视显微镜下约0.8倍放大倍数处的平滑表面上并固定稳定。使用剃刀刀片或解剖刀，在目标区域略上方进行初步切割，以去除叶鞘的远端部分。

然后沿原基的长度方向，在所需位置获取约 0.25 至 0.8 毫米厚的薄切片。完成后，将叶片切片置于洁净的载玻片上。用移液器向切片滴加几滴水，然后盖上盖玻片。

如有需要，可从盖玻片边缘再滴加几滴。将载玻片置于落射荧光显微镜载物台上，调整设置以观察荧光染料。通过该方法，在切片前测量原基以实现横切取样的标准化。

研究发现，vanishing tassel two 突变体的叶原基比正常植株更宽，且具有更多的维管束，表明该突变体的缺陷在叶片发育早期即已出现。该方法还可实现对激素响应荧光蛋白报告基因在叶原基中表达模式的系统性观察。开始制备载玻片时，先剪取一块矩形透明双面纳米胶带，将其粘贴至洁净载玻片中央，注意不要揭去胶带上表面的保护塑料膜。

接下来，使用剥线钳去除老叶的上部，解剖导管。然后用牙科探针握住中胚轴并小心去除周围的叶片，以分离出目标原基。在固定原基时，需从胶带上撕下保护膜。

将暴露的叶原基置于胶带上，用剃刀刀片在基部切割，弃去基部茎段和下胚轴。为更顺畅地展开，可将针尖浸入100%甘油，涂抹于叶内侧或近轴面以润滑。

使用带有弯针的牙科探针展开原基。将针尖与表面平行放置，轻轻按压外基部边缘使其贴附于胶带上并展开。当外边缘已粘附在胶带上时，将针尖与叶片的长轴方向保持平行。

轻轻将针头横向滑动，使叶片展开并平铺在胶带上。在展开的叶原基上滴加一滴水。立即在水滴和叶原基上放置盖玻片。

轻轻按压盖玻片边缘，使其粘附于胶带上。完成后，将玻片置于落射荧光显微镜载物台上，以观察荧光染料。该方法用于观察和分析玉米叶原基中荧光蛋白的表达。

与横切面分析相辅相成，全叶整体装片分析揭示了在发育过程中激素响应的组织特异性和阶段特异性模式。整体装片分析方法实现了对玉米叶原基中荧光蛋白表达的定性与定量分析，表明该方法在研究玉米叶原基方面具有有效性，而玉米叶原基由于其卷曲的形态结构，通常难以成像观察。