Name: 离体 基于OCT的人供体眼睛多模态成像用于研究年龄相关性黄斑变性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 了解基于OCT的多模态成像技术用于研究年龄相关性黄斑变性。该方法利用人供体眼睛进行离体成像，帮助研究人员观察视网膜病理变化并识别疾病进展的关键指标。

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我们感谢 Heidelberg Engineering 提供仪器以及原始眼 holder 的设计，感谢 Richard F. Spaide 医学博士引入基于光学相干断层扫描的多模态成像技术，感谢 Christopher Girkin 医学博士协助使用临床成像设备，以及感谢 David Fisher 提供图 1。人类供体眼球的获取研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 R01EY06019（C.A.C.）、P30&#160;EY003039（Pittler）、R01EY015520（Smith）、R01EY027948（C.A.C., T.A.）、R01EY030192（Li）、R01EY031209（Stambolian）和 U54EY032442（Spraggins）、IZKF Würzburg（N-304, T.A.）、阿拉巴马州 EyeSight 基金会、国际视网膜研究基金会（C.A.C.）、Arnold 和 Mabel Beckman 黄斑变性研究倡议（C.A.C.）以及防盲研究基金会 AMD Catalyst（Schey）的支持。

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

C.A.C. 获得海德堡工程公司的研究资助，并担任艾佩利西斯、安斯泰来、勃林格殷格翰、Character Bioscience 和 Osanni 的顾问。T.A. 获得诺华公司的研究资助，并担任罗氏、诺华、拜耳、尼德克和艾佩利西斯的顾问。K.B.F. 担任基因泰克、蔡司、海德堡工程、艾尔建、拜耳和诺华的顾问。

在新冠疫情前的16个月期间，采用基于人群的筛查方法，成功获取了75例患有年龄相关性黄斑变性（AMD）的供体眼球。所有样本均在较短的死亡至摘取时间（DtoP）内获取，并通过光学相干断层扫描（OCT）锚定的宏观-微观-影像学（MMI）分期方法进行分期。年龄标准（&#62;80岁）超出了用于可移植角膜的组织回收通常所考虑的年龄范围。尽管供体年龄较大，但根据我们的标准，仍获得了涵盖年龄相关性黄斑变性（AMD）各个阶段的眼组织。许多视网膜色素上皮（RPE）表型在所有AMD阶段中均常见，而部分表型则特异存在于新生血管性AMD中3,46直接比较 离体 和 体内 成像（图7）证实了短的D到P时间是一个关键因素，此外还需要专家的操作处理（图1），在生成 离体 足以进行高级别诊断分类的外视网膜图像，其中部分样本适用于成像与组织学之间的直接对照分析<sup class="...

在光学相干断层扫描（OCT）指导下，采用抗VEGF疗法管理新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）已有十五年，这为这一常见致盲病因的进展顺序和微观结构提供了新的认识。其中一项重要认识是，AMD是一种涉及神经感觉视网膜、视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜的三维疾病。通过对临床试验患者以及接受治疗患者的对侧眼进行OCT成像，现已认识到超出彩色眼底摄影（数十年来的临床标准）所见的多种病理特征。这些特征包括视网膜内新生血管（3型黄斑新生血管1，曾称为血管样增生）、视网膜下玻璃膜疣样沉积物（SDDs，亦称网状假性玻璃膜疣）2、RPE命运的多种演变途径3,4，以及在萎缩区域中显著胶质化的Müller细胞5,6。
缺乏黄斑（细胞和动物）的模型系统可重现这种复杂疾病的某些方面7,8,9。进一步减轻年龄相关性黄斑变性（AMD）负担的成功可能源于在人眼中发现并探索其原发性病理，理解黄斑独特的细胞组成，随后将其转化至模型系统中。本报告描述了一个学术研究实验室与眼库之间长达三十年的合作。本文所述组织表征方法的目标有两个：1）通过显微镜揭示眼底外观及成像信号来源的基础，从而推动诊断技术的发展；2）对AMD样本进行分类，以用于靶向（免疫组织化学）和非靶向分子发现技术（成像质谱，IMS，以及空间转录组学），同时保留仅含视锥细胞的中央凹及富含视杆细胞的旁中央凹和周边中央凹区域。此类研究可加速向临床光学相干断层扫描（OCT）的转化，后者可通过眼动追踪实现病程序列的观察和纵向随访。该技术旨在监测治疗效果，利用视网膜血管将一次门诊检查的扫描图像与下一次门诊的扫描图像进行配准。将眼动追踪OCT与实验室中通过破坏性技术获得的结果关联起来，可为分子发现提供新的预后价值。
1993年，该研究实验室在胶片上拍摄了死后眼底的彩色照片10这一工作受到福斯（Foos）及其同事对人眼周边视网膜出色的显微摄影与组织学研究的启发11,12,13&#160;以及Sarks等人对年龄相关性黄斑变性的广泛临床病理学相关性研究14,15自2009年起， 离体 采用以谱域光学相干断层扫描为核心的多模态成像（MMI）。这一转变受到其他研究者类似工作的启发16,17&#160;尤其是由于意识到萨克斯所描述的大量超微结构在临床中能够以三维形式随时间动态呈现18,19目标是在合理的时间范围内获取附有黄斑的眼球，以开展视网膜、视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜细胞水平表型的高统计效能研究。旨在超越以往的研究局限 &#34;每只眼&#34; 统计学 &#34;按病变类型&#34; 受以下因素影响的标准 &#34;易损斑块&#34; 心血管疾病相关概念20,21.
本报告中的实验方案基于对近400对供体眼球的处理经验，这些眼球通过多个渠道收集。2011年至2014年间，建立了年龄相关性黄斑变性（AMD）组织病理学的Project MACULA网站，其中包含了来自142例存档样本的视网膜层厚度数据和注释信息。这些眼球于1996年至2012年间使用戊二醛-多聚甲醛固定液保存，用于高分辨率环氧树脂组织学和电子显微镜检查。所有眼球在接收时均拍摄了彩色眼底图像，并在组织学处理前重新进行了光学相干断层扫描（OCT）成像。采用最初为视神经研究设计的眼球固定装置22&#160;，以黄斑中心凹为中心，获取直径为8 mm的全层组织穿孔样本。穿过黄斑中心凹及上方2 mm位置的OCT B扫描图像（与相应层次的组织学切片对应）以及彩色眼底照片均上传至该网站。OCT扫描平面的选择依据是黄斑下区域AMD病理改变的显著性23&#160;，以及黄斑上方视杆细胞丰富区域中沉着物（SDDs）的明显表现24,25。
自2013年起，生前接受过OCT锚定多模式成像（MMI）的眼球可用于直接进行临床病理学对照研究。大多数供体（10名中的7名）来自视网膜专科转诊诊所（作者：K.B.F.），该诊所为有意在去世后捐献眼球用于科研的患者提供生前预嘱登记服务。眼球由当地眼库采集并保存，随后转移至实验室，并以与Project MACULA眼球相同的方式进行处理。生前的临床OCT图像数据可直接在实验室读取，从而将生前观察到的病理特征与显微镜下所见特征精确对应26。
自2014年起，开始前瞻性采集眼组织，通过筛查无临床病史但于限定时间内（6小时）保存的供体眼球中的年龄相关性黄斑变性（AMD）。为此，对眼球固定装置进行了改进，以容纳完整的眼球，从而减少了此前使用8 mm打孔器时切缘周围发生脱离的风险。眼球采用4%缓冲甲醛固定液进行固定，用于免疫组织化学分析，并于次日转移至1%固定液中长期保存。在2016至2017年（疫情前时期），共采集了来自90名供体的184只眼球。本报告中的统计数据和图像均来源于该系列样本。在大流行期间（2020年封锁及后续阶段），针对转录组学和成像质谱（IMS）合作项目的前瞻性采集工作以较慢节奏持续进行，基本沿用2014年的方法。
目前已有其他用于供体眼球评估的方法。明尼苏达分级系统（Minnesota Grading System, MGS）27,28&#160;基于年龄相关性眼病研究（AREDS）的彩色眼底照相临床分类系统29。该方法的局限性包括将萎缩型和新生血管型年龄相关性黄斑变性（AMD）合并为“晚期AMD”一个阶段&#34;late AMD&#34;。此外，MGS要求在对视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜进行摄影记录前，先去除神经感觉视网膜。此步骤会导致视锥视杆细胞外节沉积物（SDDs）不同程度地移位30,31&#160;，并破坏外层视网膜与其支持系统之间的空间对应关系。因此，试图将视网膜的代谢需求及信号传导与RPE-脉络膜的病理变化相联系的研究可能受到阻碍。犹他系统（Utah System）采用离体（ex vivo）彩色摄影和光学相干断层扫描（OCT）技术，将用于解剖的眼球划分为不同区域，以进行RNA和蛋白质提取32。尽管该方法优于全眼杯组织提取，但其针对AMD进展最高风险区域的取材范围仅为直径3 mm，而这一区域仅占以黄斑中心凹为中心、直径6 mm的圆形组织切片面积的25%33,34&#160;。因此，能够以黄斑中心凹为参照定位病变位置的技术（例如用于免疫组织化学分析的连续切片）更具优势。

<table><tbody><tr><td>烧杯，250 mL</td><td>Fisher</td><td># 02-540K</td><td></td></tr><tr><td>瓶子，1 L，Pyrex&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td># 10-462-719</td><td>用于保存剂的储存</td></tr><tr><td>本生灯或热源</td><td>Eisco</td><td># 17-12-818</td><td>用于熔化石蜡</td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Nikon D7200</td><td>D7200</td><td></td></tr><tr><td>计算机及存储设备</td><td>Apple</td><td>iMac Pro；14 TB 外置硬盘</td><td>图像存储</td></tr><tr><td>保温容器</td><td>Fisher</td><td># 02-591-45</td><td>用于湿冰</td></tr><tr><td>容器，每位供体2个，40 mL</td><td>Fisher</td><td>Sameco Bio-Tite&amp;nbsp; 40 mL # 13-711-86</td><td>用于保存剂</td></tr><tr><td>石英坩埚，30 mL</td><td>Fisher</td><td># 08-072D</td><td>用于眼球摄影时固定眼球</td></tr><tr><td>量筒，250 mL</td><td>Fisher</td><td># 08-549G</td><td></td></tr><tr><td>消毒清洁用品&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html</td></tr><tr><td>带透镜和安装支架的眼球固定装置</td><td>联系 J. Messinger</td><td>jeffreymessinger@uabmc.edu</td><td>基于海德堡工程公司原始设计的定制改装</td></tr><tr><td>面部防护口罩</td><td>Fisher</td><td># 19-910-667</td><td></td></tr><tr><td>Harmon Fix 镊子</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td># RS-8247</td><td></td></tr><tr><td>显微有齿镊</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td># RS-5232</td><td></td></tr><tr><td>组织镊</td><td>Roboz</td><td># RS-5172</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿，Kimax</td><td>Fisher</td><td># 23064</td><td></td></tr><tr><td>钻石纹手套</td><td>Fisher</td><td># MF-300</td><td></td></tr><tr><td>GenPro 防护服</td><td>Fisher</td><td># 19-166-116</td><td></td></tr><tr><td>图像编辑软件</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 2021，Creative Suite</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes 纸巾</td><td>Fisher</td><td># 06-666</td><td></td></tr><tr><td>灯，三头蛇形管</td><td>Schott Imaging</td><td># A20800</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1000</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>SZX9</td><td>用于眼底彩色摄影</td></tr><tr><td>多聚甲醛，20%&amp;nbsp;</td><td>EMS</td><td># 15713-S</td><td>用于保存剂；稀释后储存</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td># 01-913-806</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，Sorenson's，0.2 M，pH 7.2&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td><td>EMS</td><td># 11600-10</td><td></td></tr><tr><td>环形闪光灯</td><td>B &amp;amp; H Photo Video</td><td>Sigma EM-140 DG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>红宝石珠，直径1 mm</td><td>Meller Optics</td><td># MRB10MD</td><td></td></tr><tr><td>3M 防护眼镜</td><td>Fisher</td><td># 19-070-940</td><td></td></tr><tr><td>扫描激光检眼镜</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>HRA2</td><td></td></tr><tr><td>弹簧弯剪</td><td>Roboz</td><td># RS-5681</td><td></td></tr><tr><td>锐器盒</td><td>Fisher</td><td># 1482763</td><td></td></tr><tr><td>快门线，遥控</td><td>Nikon</td><td>MC-DC2</td><td></td></tr><tr><td>谱域 OCT 设备</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA&amp;amp;OCT</td><td>https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf</td></tr><tr><td>不锈钢钢珠，直径25.4 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td># 9529K31</td><td></td></tr><tr><td>组织标记染料，黑色</td><td>Cancer Diagnostics Inc</td><td># 0727-1</td><td></td></tr><tr><td>组织切片刀片</td><td>Thomas Scientific</td><td># 6767C18</td><td></td></tr><tr><td>环钻，直径18 mm</td><td>Stratis Healthcare</td><td># 6718L</td><td></td></tr><tr><td>电视监视器（HDMI）及数码相机连接线</td><td>B&amp;amp;H Photo Video</td><td>BH # COHD18G6PROB</td><td>用于实时观察和远程相机显示功能</td></tr><tr><td>粉红色牙科石蜡</td><td>EMS&amp;nbsp;</td><td># 72670</td><td></td></tr><tr><td>木制涂药棒</td><td>Puritan</td><td># 807-12</td><td></td></tr></tbody></table>

离体 基于oct的多模态成像技术用于年龄相关性黄斑变性的人类供体眼研究

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

从基于光学相干断层扫描（OCT）的多模态（MMI）临床影像中学习到的年龄相关性黄斑变性（AMD）进展序列，可为实验室研究结果提供额外的预后价值。在本研究中， 离体 OCT 和 MMI 在人眼供体视网膜组织切片前应用于眼球。眼球取自年龄 ≥80 岁的非糖尿病白人供体，死亡至保存时间（DtoP）≤6 小时。眼球在原地获取后，使用 18 mm 环钻进行划痕以方便角膜移除，并浸入缓冲的 4% 多聚甲醛中。在移除前节结构后，使用解剖显微镜和单反相机，通过透射、反射及闪光照明在三种放大倍数下获取彩色眼底图像。眼球被置于定制设计的腔室内的缓冲液中，腔室配备 60 屈光度透镜。随后使用谱域 OCT（30° 黄斑立方体扫描，30 µm 间距，平均次数 = 25）、近红外反射、488 nm 自发荧光和 787 nm 自发荧光进行成像。年龄相关性黄斑变性（AMD）眼球显示视网膜色素上皮（RPE）改变，伴有玻璃膜疣或视网膜下玻璃膜疣样沉积物（SDDs），伴或不伴有新生血管，且无其他病因证据。2016 年 6 月至 2017 年 9 月期间，共获取 94 只右眼和 90 只左眼（DtoP：3.9 ± 1.0 小时）。在 184 只眼球中，40.2% 存在 AMD，包括早期或中期（22.8%）、萎缩型（7.6%）和新生血管型（9.8%）AMD，39.7% 黄斑区无明显异常。通过 OCT 鉴定出玻璃膜疣、SDDs、高反射灶、萎缩区域和纤维血管瘢痕。观察到的伪影包括组织混浊、脱离（杆锥层、视网膜、RPE、脉络膜）、中心凹囊样改变、RPE 波浪状形态以及机械性损伤。为指导冷冻切片，OCT 体积数据用于定位中心凹和视盘解剖标志以及特定病理改变。 离体 体积通过以下方式进行了配准 体内 通过选择眼动追踪的参考函数来确定体积。 离体 病理表现的可见度 体内 取决于保存质量。在16个月内，通过临床MMI方法获取并分期了75例处于AMD各阶段的快速DtoP供体眼。

表1 显示在2016至2017年间，来自94名非糖尿病白人供体的184只眼睛 &gt;80岁。平均死亡至保存时间间隔为3.9小时（范围：2.0–6.4小时）。在回顾的184只眼球中，75只（40.2%）确诊为年龄相关性黄斑变性（AMD）。所识别的分类如下：无明显异常（39.7%）、可疑（11.4%）、早期-中期AMD（22.8%）、萎缩型（7.6%）、新生血管型（9.8%）、其他（8.7%）以及未知/未记录/不可分级（&lt;1%). 图2, 图3, 图4，以及 图5 显示多尺度、多模态 离体 对本系列中保存极为完好的眼球进行成像。这些眼球的评估由一位专注于视网膜疾病的眼科医生（J.A.K.）协作完成。尽管某些眼球在个别特征上显示更清晰，但这些病例因整体质量高而被选中。
如上所述<sup cla...

实验室检测可利用基于光学相干断层扫描（OCT）的年龄相关性黄斑变性（AMD）多模态纵向成像的预后价值。在组织切片前，对患有和不患有AMD的人类供体眼球分别进行OCT、彩色成像、近红外反射扫描激光检眼镜以及两种激发波长下的自发荧光成像。

离体 基于OCT的多模态成像技术用于年龄相关性黄斑变性的人类供体眼研究

年龄相关性黄斑变性（AMD）的进展序列，基于光学相干断层扫描（OCT）的多模态（MMI）临床影像学学习获得

本方案为年龄相关性黄斑变性（AMD）的新疗法和预防措施提供了可能。AMD 是一种以中枢神经退行性变为主要特征的重大疾病，然而，由于眼部结构精确且可进行视网膜细胞水平的临床成像，我们认为该疾病是最具可干预性的。针对 AMD 基础疾病的新生血管并发症，已在患有该并发症的 15% 患者中成功治疗了 15 年。最近，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个用于该疾病晚期阶段的药物。单细胞RNA测序技术揭示了视网膜及支持性脉络膜血管中一百多种细胞类型的分子图谱。我追踪了光学相干断层扫描（Optical Coherence Tomography，简称OCT）技术的发展，该技术使我们能够在临床中观察到细胞水平的详细病变进展过程。目前用于AMD研究的细胞和动物模型系统无法准确预测人类的病理特征和疾病进展风险。这阻碍了新疗法和预防措施的开发。本实验室在AMD研究领域贡献了多项重要发现，包括与夜间视觉相关的大范围视杆细胞在早期即出现丢失。还观察到，黄斑区结构保存较好且神经感觉视网膜附着的样本与临床OCT成像直接相关。年龄相关性黄斑变性（AMD）的许多病理特征在临床OCT中变得可见，该技术可提供视网膜和脉络膜的横截面图像。人类供体眼的OCT结果可直接与临床影像学发现进行比较。如果实验室能够通过采用光学相干断层扫描（OCT）来表征眼球或检测样本，并结合基因表达或蛋白质组学等实验室检测结果，同时利用临床影像的纵向时间线来聚焦最具信息价值的风险指标，将大有裨益。首先，将从眼球供体获取的完整眼球置于盛有石蜡的培养皿中。在尽量减少对附着于睫状体的厚层玻璃体环造成扰动的前提下，去除前节残留组织。标记上极以确定方位后，将眼球置于培养皿中，使其前面朝下。找到上直肌和上斜肌的腱性止点后，用木制涂药棒沿前后方向涂抹一条10毫米长的标记墨水线。在拍照前用冷索伦森磷酸盐缓冲液填充真菌。将一个1毫米的红宝石珠插入眼底作为内部比例尺。用镊子将眼球的后极插入一个30毫升的石英坩埚中。将单反相机安装到体视显微镜上，使用透射-落射照明和闪光照明，在三个标准放大倍数下获取彩色图像，以突出显示特定区域。开始进行离体彩色眼底摄影时，将高清多媒体接口相机设置为手动 ISO 模式。将两个光源相互垂直排列，并将落射照明光源调至最大功率。在解剖显微镜下，将一毫米的红宝石珠插入眼球后极。接着，将眼球的后极插入盛有缓冲液的30毫升石英坩埚中。当组织下沉后，在眼球与坩埚壁之间插入一个支撑物。将装有眼球的坩埚置于体视显微镜载物台上，通过显微镜观察眼内眼底结构。使用最低放大倍数，通过识别位于12:00位置的组织标记、视神经乳头以及位于视神经乳头下方五度的中央凹来定位眼球。首先，打开激光检眼镜仪器。通过移动整个设备并调节其高度来定位OCT镜头。通过旋转旋钮对图像进行对焦，然后通过拧紧手拧螺钉固定镜头的位置。将眼球样本放入持镜器中。手动调整持镜器内眼球的位置，并使用垫片固定，避免压迫巩膜。调整持镜器方向，使上直肌朝上。打开OCT设备的专有可视化与分析软件后，左侧栏将显示按内部编号索引的患者列表。选择新建患者图标，并在点击“确定”前完成患者信息的填写。完成后，从下拉菜单中选择操作者和检查项目。查看时，按下控制面板上的黄色按钮以开始图像采集。在控制模块上选择红外OCT。让激光获取眼底的实时SLO图像和OCTB扫描。通过设备上的黑色旋钮调节OCT激光头，以获得相对位置和焦点。旋转控制面板上的圆形黑色旋钮以调节强度。使用黑色旋钮对100帧进行平均。当眼底聚焦清晰后，OCTB扫描图像将显示在屏幕的上三分之一区域。按下“采集”按钮前，使用光标移动眼底图像上的蓝色线条，使黄斑中心凹居中。在控制模块中选择红外光（IR）和体积扫描模式，以采集OCT图像。调整所有OCT控制参数和扫描设置。当近红外反射眼底图像被蓝色的B扫描线覆盖后，在右上角窗口重新检查OCT的位置，然后在控制模块上点击“采集”以完成容积扫描。图像采集完成后，选择“退出”以保存图像。处理完成后，图像将显示在屏幕上。开始扫描激光检眼镜检查时，将置于 holder 中的眼球移至扫描激光检眼镜设备。在检眼镜上选择 R 位置，然后选择 IR 模式以对眼球进行对准和定位。调整摄像头方向。通过旋转旋钮对焦图像。使用拇指螺丝旋转并固定摄像头的位置。然后，将黑色拨杆调至 R 位置。图像聚焦后，将选择旋钮从 R 位置转至 A 位置。选择 ICGA、100% 强度、30 度视野范围以及单相成像。按下黑色圆盘进行平均后，选择“采集”。来自供体的正常黄斑离体成像结果显示，正常黄斑区域及低反射的大脉络膜血管清晰可见。两层之间为具有反射性的视网膜色素上皮（RPE）BBL Brooks 带。对一例早期中期年龄相关性黄斑变性（AMD）黄斑区进行的多模态离体成像，展示了黄斑中心凹的近观图像，显示与卵黄样病变相对应的色素沉着过度。在早期中期 AMD 中，可见特征包括软性玻璃膜疣、基底部的低反射线、低反射灶、视网膜下玻璃膜疣样沉积物以及卵黄样改变。类似地，研究了伴有萎缩性AMD的黄斑区以及由新生血管性AMD继发的黄斑萎缩的黄斑区。此外，供体眼球的离体OCT成像有助于研究死后组织中的常见伪影。

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离体 基于OCT的人供体眼睛多模态成像用于研究年龄相关性黄斑变性

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