Name: 自由移动小鼠的多通道细胞外记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学习使用轻量微驱动系统在自由移动小鼠运动皮层进行多通道细胞外记录的方法。该技术可同步采集局部场电位和神经脉冲信号，帮助研究者分析行为相关的神经网络动态，为神经科学研究提供可靠的电生理数据获取方案。

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本工作得到了国家自然科学基金（31871170、32170950 和 31970915）、广东省自然科学基金（2021A1515010804 和 2023A1515010899）、广东省自然科学基金重大项目培育（2018B030336001）以及广东省重点脑疾病治疗技术攻关项目（2018B030332001）的资助。

所有小鼠均购自商业渠道，在室温22-25 °C、相对湿度50%-60%的环境下维持12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间为当地时间上午08:00）。小鼠可自由获取食物和水。所有实验均按照华南师范大学《实验动物护理与使用指南》进行，并经机构动物伦理委员会批准。实验使用3-5月龄的雄性C57BL/6J小鼠。
1. 微驱动系统组装
<ol>
	<li>使用两个撑条和一个用于固定可移动微驱动装置的螺钉，将两个计算机设计的板连接起来，并将连接器安装到其中一块板上图1A，Bi-III）。通过旋转螺丝（0.5 毫米/圈）驱动微型驱动装置。</li>
	<li>确保微型驱动装置每侧可容纳两组八根导管（长约3 cm，内径约50 µm，外径约125 µm），用于MC区域两侧，然后将其切割至相同长度（至少15 mm）； 图1Biv，v).</li>
	<li>剪切16根直径为35 µm、长约5 cm的镍铬合金丝，依次装入导引管中，随后涂胶固定图1Bi，vi，vii).</li>
	<li>剥离导线绝缘层，根据通道图将每根裸露的导线依次缠绕至连接器的各个引脚，以及参考电极和接地电极，然后缓慢地将导电漆涂覆到每个引脚上图 1Bviii-x).</li>
	<li>使用环氧树脂覆盖针脚（图1Axi，十二），然后进行镀金 通过 使用阻抗测试仪将电极尖端的阻抗降低至约 350 kOhm（图 1Bxiii，十四）。将阻抗测试仪的参数设置如下：使用含 5 mM PtCl 的镀金溶液，施加 −10.08 µA 直流电流，持续 1 秒4.</li>
	<li>最后，通过旋转螺丝将微驱动装置移至顶部。检查如图所示改装后的微驱动系统的整体尺寸 图1A （长约15 mm，宽约10 mm，高约20 mm，重量约1 g）。有关计算机设计的电路板和可动部件的详细规格，请参见 图1Ai，ii.</li>
</ol>
2. 电极阵列植入
<ol>
	<li>手术开始前，对手术器械包进行灭菌，佩戴无菌手套，并穿上医生专用的无菌白大褂。</li>
	<li>为控制疼痛，在诱导舱内对小鼠进行皮下（s.c.）注射美洛昔康&#160;注射液&#160;（5 mg/kg）。随后在诱导舱内通过腹腔（i.p.）注射戊巴比妥钠（80 mg/kg）对小鼠进行麻醉18,19。若脚趾夹捏反射仍存在，则补充戊巴比妥钠剂量（20 mg/kg/h）。</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位仪上，并使用温度控制器维持其直肠温度在 37 °C。</li>
	<li>将四环素眼膏涂抹于小鼠双眼，并在手术前再次更换无菌手套&#160;。</li>
	<li>剃除小鼠头部毛发，并使用无菌棉签蘸取聚维酮碘溶液与酒精，以同心圆方式从中心向外周交替擦拭三次，对术区进行消毒&#160;（图 2i，ii）。做一条约 15 mm 的正中切口以暴露颅骨。立即在颈部肌肉局部应用 1% 利多卡因以缓解疼痛。然后用剪刀清除残留组织，并用生理盐水浸湿的棉签清洁颅骨&#160;（图 2iii）。</li>
	<li>使用充满墨水的玻璃微电极，在双侧运动皮层（MC）预定植入位置做标记（图 2iv，v）。根据先前研究20，双侧运动皮层的位置如下：前囟前 0.74 mm，中线外侧 1.25 mm。</li>
	<li>植入四枚不锈钢螺钉（直径 0.8 mm）以保护微驱动系统，随后将所有螺钉通过参考电极和接地电极连接，并用混合牙科水泥覆盖形成围壁（图 2vi-xi）。</li>
	<li>使用颅骨钻在双侧运动皮层区域的颅骨上小心钻出两个小孔（约 1.5 mm2）（图 2xii）。采用双侧运动皮层的立体定位坐标：前囟前 0.74 mm，中线外侧 1.25 mm，硬脑膜下 0.5 mm。</li>
	<li>用精细镊子小心去除小孔处的硬脑膜（图 2xiii）。</li>
	<li>使用显微操作器以 10 µm/s 的速度将微驱动系统插入小孔中心（图 2xiv-xvii）。</li>
	<li>完成微驱动系统植入后，将凡士林填充至牙科水泥围壁内（图 2xviii）。</li>
	<li>用混合牙科水泥将微驱动系统的底板与牙科水泥围壁连接固定（图 2xix）。</li>
	<li>用生理盐水清洗切口，随后局部涂抹含有盐酸林可霉素和盐酸利多卡因的凝胶，以缓解术后疼痛。</li>
	<li>将导电铜箔胶带缠绕在已植入的微驱动系统周围（图 2xx）。</li>
	<li>将小鼠转移至保持在 31–33 °C 的笼盒中，并监测其从麻醉中恢复的情况。</li>
	<li>让小鼠单独饲养并恢复 1 周。连续 3 天每日检查切口，并涂抹含盐酸林可霉素和盐酸利多卡因的凝胶进行处理。</li>
</ol>
3. 自由活动小鼠双侧运动皮层的多通道记录
<ol>
	<li>轻轻且小心地固定清醒小鼠的头部。至少提前1天通过旋转微型驱动系统可移动部分上的螺丝，将电极阵列向下移动（约0.1 mm深度）（图1Aii）。</li>
	<li>轻轻且小心地固定清醒小鼠的头部。用一根细线将头级放大器的中心与一个氦气球（内含约0.02 L氦气）连接，以平衡头级放大器和微型驱动系统的重量（图3A，B）。</li>
	<li>使用记录电极和多通道系统，在记录软件中以30 kHz的采样率采集原始信号，然后通过多通道系统的数模（DA）转换器进行数字化。</li>
	<li>在记录软件中将原始数据重采样至10 kHz，提取局部场电位（LFP）信号，并使用记录软件中的陷波滤波器去除50 Hz的工频噪声。</li>
	<li>从自由活动的小鼠中记录至少60秒的稳定状态原始数据。记录结束后，缓慢断开头级放大器与微型驱动系统之间的连接，并将小鼠放回其饲养笼中。</li>
	<li>将记录的数据存储在计算机中，并进行离线分析（图4 和 图5）。</li>
	<li>实验结束后，按照机构指南实施安乐死，随后使用3 V输出的电源进行1分钟的电解损伤以标记电极位置，再通过组织学分析确认电极位置。使用冷冻切片机将小鼠脑组织切成30 µm厚的切片，收集运动皮层（MC）切片，然后用显微镜拍摄图像（图3C，D）。</li>
</ol>
4. 峰电位分类与分析
<ol>
	<li>在尖峰排序软件中，点击 文件 &#62; 打开 &#62; Nev 文件，以打开以 30 kHz 采样的尖峰数据（图 4Ai）。</li>
	<li>点击“信息”以选择未分类通道，然后选择 排序 &#62; 更改排序方法 &#62; 使用 K-均值法。按下按钮 谷值搜索排序 &#62; K-均值排序，以获得分类后的神经元单元（图 4Aii，iii）。</li>
	<li>点击 文件 &#62; 另存为，将分类后的尖峰数据以 .nev 扩展名保存，然后选择 文件 &#62; 导出每波形数据，将主成分分析（PCA）结果以 .txt 扩展名导出（图 4Aiv）。</li>
	<li>在神经生理数据分析软件中，点击 文件 &#62; 导入数据 &#62; Blackrock 文件，以打开已分类的尖峰文件（图 4Bi）。</li>
	<li>点击 分析 &#62; 自相关图，获取所选单元的自相关图，然后设置参数如下：X 最小值为 −0.05 s，X 最大值为 0.05 s，Bin 值为 0.001（图 4Bii，iii）。</li>
	<li>加载已分类的尖峰数据后，点击 分析 &#62; 尖峰间间隔直方图，获取尖峰间间隔直方图，然后设置参数如下：最小间隔值为 0 s，最大间隔值为 0.1 s，Bin 值为 0.001（图 4Biv，v）。</li>
	<li>点击 分析 &#62; 互相关图，获取两个已分类单元事件之间的互相关图，然后设置参考事件及参数如下：X 最小值为 −0.1 s，X 最大值为 0.1 s，Bin 值为 0.001（图 4Bvi，vii）。</li>
	<li>点击 结果 &#62; 数值结果，将自相关图、尖峰间间隔直方图和互相关图的结果以 .xls 扩展名保存（图 4Bviii，ix）。分析数据并绘制图形。</li>
</ol>
5. LFP 分析
<ol>
	<li>在神经生理数据分析软件中，点击 文件导入数据 &#62; Blackrock 文件，以打开以 10 kHz 采样率采集的连续信号数据（图 5Ai）。</li>
	<li>点击 分析 &#62; 连续信号频谱，以分析所选通道局部场电位（LFP）的功率谱。参数设置如下：频率值数量设为 8,192，多窗值（Multiple Tapers）设为 3–5，功率谱密度（PSD）归一化方式设为总功率的百分比，频率范围设为 1 Hz 至 100 Hz（图 5Aii，iii）。</li>
	<li>点击 分析 &#62; 连续信号相干性，以分析来自运动皮层（MC）左右两侧两个 LFP 信号的相干性。参考通道及参数设置如下：计算类型设为相干性值，频率值数量设为 8,192，多窗值设为 3–5，频率范围设为 1 Hz 至 100 Hz（图 5Aiv，v）。</li>
	<li>点击 分析 &#62; 与连续变量的相关性，以分析来自运动皮层（MC）左右两侧两个 LFP 信号之间的相关性。设置参考通道（LFP 数据）及参数如下：X 轴最小值设为 −0.1 s，X 轴最大值设为 0.1 s，Bin 值设为 0.001（图 5Avi，vii）。</li>
	<li>点击 结果 &#62; 数值结果，将功率谱密度（PSD）、相干性和相关性分析结果以 .xls 文件扩展名保存（图 5Aviii，ix）。</li>
	<li>选择需要提取代表性轨迹的通道，点击 编辑 &#62; 连续变量数字滤波 以获得各频段信号，参数设置如下：滤波器频率响应设为带通（Bandpass），滤波器实现方式设为无限冲激响应（IIR）Butterworth 滤波器，滤波器阶数设为 2。最后，设定感兴趣的频率范围（图 5Bi-iv）。 
	注：此处使用的频率范围分别为：delta（δ，1–4 Hz）、theta（θ，5–12 Hz）、beta（β，13–30 Hz）、低频 gamma（low γ，30–70 Hz）和高频 gamma（high γ，70–100 Hz）振荡。</li>
	<li>分析数据并绘制图形。</li>
</ol>
6. 峰电位与局部场电位之间的相关性
<ol>
	<li>在神经生理数据分析软件中，点击 文件 &#62; 导入数据 &#62; Blackrock 文件，以打开连续信号数据和脉冲数据。</li>
	<li>点击 分析 &#62; 相干性分析，以分析所选通道中脉冲信号与局部场电位（LFP）之间的相干性。设置参考变量（脉冲时间）和参数如下：计算相干性值，频率点数设为 512，多锥体值设为 3–5，频率范围设为 1 Hz 至 100 Hz（图 5Ci，ii）。</li>
	<li>点击 结果 &#62; 数值结果，将脉冲场相干性结果保存为扩展名为 .xls 的文件（图 5Ciii，iv）。</li>
	<li>分析数据并绘制图形。</li>
</ol>

Extracellular Electrophysiological Recording in the Motor Cortex of Mice

<ol><li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Singer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+cortical+activity+and+its+putative+role+in+information+processing+and+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning.</a> Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).</li>
<li>Arroyo-García, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+spike-gamma+coupling+of+area+CA3+fast-spiking+interneurons+as+the+earliest+functional+impairment+in+the+App%28NL-G-F%29+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease.</a> Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).</li>
<li>Ozawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+resonance+in+amygdalo-cortical+circuits+supports+fear+memory+retrieval+following+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction.</a> Nature Communications. 11 (1), 4358(2020).</li>
<li>Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arousal+and+locomotion+make+distinct+contributions+to+cortical+activity+patterns+and+visual+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding.</a> Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).</li>
<li>Beck, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((long-term+dopamine+depletion+causes+enhanced+beta+oscillations+in+the+cortico-basal+ganglia+loop+of+parkinsonian+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats.</a> Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).</li>
<li>Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+activity+in+the+subthalamic+nucleus-globus+pallidus+network+to+cortical+electroencephalogram%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram.</a> Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).</li>
<li>Magill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+functional+connectivity+within+the+rat+striatopallidal+axis+during+global+brain+activation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).</li>
<li>Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+brain+machine+interfaces%3A+First-in-human+studies%2C+technology+challenges+and+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends.</a> Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).</li>
<li>Tort, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cross-frequency+couplings+of+local+field+potential+oscillations+in+rat+striatum+and+hippocampus+during+performance+of+a+T-maze+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).</li>
<li>Yamamoto, J., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+chronically+implantable+precision+motorized+microdrive+array+for+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).</li>
<li>Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+microdrive+arrays+for+chronic+neural+recordings+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50470(2013).</li>
<li>Vandecasteele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neurons+by+movable+silicon+probes+in+behaving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3568(2012).</li>
<li>Lansink, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+split+microdrive+for+simultaneous+multi-electrode+recordings+from+two+brain+areas+in+awake+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).</li>
<li>Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multi-electrode+array+design+for+chronic+neural+recording%2C+with+independent+and+automatic+hydraulic+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning.</a> Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).</li>
<li>van Daal, R. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+Neuropixels+probes+for+chronic+recording+of+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats.</a> Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).</li>
<li>Unakafova, V. A., Gail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+open-source+toolboxes+for+processing+and+analysis+of+spike+and+local+field+potentials+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57(2019).</li>
<li>Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Nrf2+enhances+the+upregulation+of+nuclear+factor-kappaB+activity%2C+tumor+necrosis+factor-alpha%2C+and+matrix+metalloproteinase-9+after+spinal+cord+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice.</a> Mediators of Inflammation. 2010, 238321(2010).</li>
<li>Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-linked+irisin+prevents+mortality+and+enhances+cognition+in+a+mice+model+of+cerebral+ischemia+by+regulating+Klotho+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070(2021).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+TDP-43+pathology+via+pyramidal+tract+induces+ALS-like+phenotypes+in+TDP-43+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15(2021).</li>
<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+oscillation+dysfunction+in+mPFC+leads+to+social+deficits+in+neuroligin+3+R451C+knockin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice.</a> Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在神经科学研究中，自由活动小鼠的多通道记录技术被认为是一种有用的方法，但对于初学者而言，信号的记录与分析仍然具有较大挑战性。本研究提供了微驱动系统的制作与电极植入的简化操作指南，以及电信号采集与分析的简化流程。 通过 神经生理数据分析软件和 spike 排序软件
鉴于定制的微型驱动系统质量对在自由活动小鼠中获取稳定且高质量的信号具有重要影响14,15,16,17，本研究设计并采用了一种更坚固且轻量化的微型驱动系统结构，初学者可轻松且清晰地遵循其制造步骤完成系统的构建。此外，该微型驱动系统的结构采用价格低廉且在五金商店易于获取的材料制成，不同于以往研究中使用的体积更大、更重的微型驱动系统14,15...

局部场电位（LFP）是细胞外信号的重要组成部分，反映了大量神经元的突触活动，这些活动构成了多种行为的神经编码1。神经元活动产生的峰电位被认为对LFP有贡献，并在神经编码中起重要作用2。已有研究证实，峰电位和LFP的改变介导了多种脑部疾病（如阿尔茨海默病）以及恐惧等情绪过程3,4。值得注意的是，许多研究强调，动物在清醒状态与麻醉状态下，其峰电位活动存在显著差异5。尽管在麻醉动物中进行记录有助于在高度明确的皮层同步状态下评估LFP，并减少伪迹干扰，但其结果在一定程度上与清醒状态下的情况有所不同6,7,8。因此，通过植入脑内的电极，在清醒状态下对各种疾病中的神经活动进行长时间、大空间尺度的检测更具意义。本文旨在为初学者提供制作微型驱动系统的方法，并介绍如何使用常用软件快速、简便地设置参数，以实现峰电位和LFP信号的记录与分析，帮助研究者迅速启动实验和数据分析工作。
尽管非侵入性脑功能记录技术（例如通过头皮记录脑电图（EEG）和事件相关电位（ERP））已广泛应用于人类和啮齿类动物研究，但EEG和ERP数据的空间和时间分辨率较低，因此无法检测特定脑区内邻近树突突触活动所产生的精确信号1。目前，通过在清醒动物中进行多通道记录，可在多次行为学测试期间，通过将微型驱动系统植入灵长类或啮齿类动物脑内，对脑深层结构的神经活动进行长期、渐进式记录1,2,3,4,5,6,7,8,9。简而言之，研究人员可构建一种微型驱动系统，用于独立调节电极或四极电极的位置，以靶向脑内不同区域10,11。例如，Chang 等人描述了通过组装轻便紧凑的微型驱动装置在小鼠中记录锋电位和局部场电位（LFP）的技术12。此外，目前已有商用的微加工硅探针及定制配件组件，可用于在行为任务期间记录啮齿类动物的多个单神经元和LFP信号13。尽管已有多种设计用于组装微型驱动系统，但在整个系统的复杂性和重量方面仍存在局限性。例如，Lansink 等人展示了一种结构复杂的多通道微型驱动系统，用于单一脑区的记录14；Sato 等人报道了一种具备自动液压定位功能的多通道微型驱动系统15。这些微型驱动系统的主要缺点是重量过大，影响小鼠自由活动，且对初学者而言组装困难。尽管多通道胞外记录已被证明是在行为学测试中测量神经活动的一种合适且高效的技术，但对于初学者而言，使用复杂的微型驱动系统进行信号记录和分析仍具挑战性。鉴于在自由活动的小鼠中启动多通道胞外记录及数据分析的完整操作流程较为困难16,17，本文提供了简化的操作指南，介绍如何使用常见组件和设置构建微型驱动系统；同时提供了常用软件中快速、直接计算锋电位和LFP信号的相关参数。此外，在本方案中，通过使用氦气气球使小鼠能够自由活动，该气球有助于抵消前置放大器和微型驱动系统的重量。总体而言，本研究描述了如何简便地构建微型驱动系统，并优化记录与数据分析流程。

<table><tbody><tr><td>2.54 mm 针式排针</td><td>YOUXIN 电子有限公司</td><td>1 × 5</td><td>申请可沿其支架滑动的可移动微型驱动装置。</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>优化 GraphPad 图像。</td></tr><tr><td>BlackRock Microsystems</td><td>Blackrock Neurotech</td><td>Cerebus</td><td>该系统包括前置放大器、数模转换器、放大器和计算机。</td></tr><tr><td>黄铜螺母</td><td>东莞高斯科技有限公司</td><td>M0.8 黄铜螺母</td><td>螺母固定螺钉的位置。</td></tr><tr><td>黄铜螺丝</td><td>东莞高斯科技有限公司</td><td>M0.8 × 11 mm 黄铜螺丝</td><td>固定可移动微驱动器的螺钉。</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>广东智源生物医药科技有限公司</td><td>N/A</td><td>12 周龄</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Biosharp</td><td>15 mL；BS-150-M</td><td>用蔗糖溶液保存小鼠脑组织。</td></tr><tr><td>导电涂料</td><td>Structure Probe, Inc.</td><td>7440-22-4</td><td>提高连接器引脚与镍丝之间铅连接的质量。</td></tr><tr><td>导电铜箔胶带</td><td>3M</td><td>1181</td><td>为减少干扰。</td></tr><tr><td>连接器</td><td>YOUXIN 电子有限公司</td><td>2 x 10P</td><td>将头帽连接至微型驱动系统。</td></tr><tr><td>直流电源</td><td>Maisheng</td><td>MS-305D</td><td>一种用于&amp;nbsp; 电解损伤</td></tr><tr><td>牙科粘固剂</td><td>上海新世纪齿科材料有限公司</td><td>N/A</td><td>在完成植入后，将电极阵列固定在小鼠颅骨上。</td></tr><tr><td>数模转换器</td><td>Blackrock</td><td>128通道</td><td>一种将数字数据转换为模拟信号的设备。</td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>Alteco</td><td>N/A</td><td>用于覆盖针脚。</td></tr><tr><td>Excel</td><td>微软</td><td>N/A</td><td>分析后总结数据。</td></tr><tr><td>眼科剪</td><td>江西玉源医疗设备有限公司</td><td>N/A</td><td>用于手术或切割镍铬丝</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>江西玉源医疗设备有限公司</td><td>N/A</td><td>用于手术。</td></tr><tr><td>镊子</td><td>江西玉源医疗设备有限公司</td><td>N/A</td><td>用于手术或组装微型驱动系统。</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td>&amp;nbsp;切开小鼠&amp;rsquo;将大脑切成薄片</td></tr><tr><td>熔融石英毛细管管材</td><td>郑州英诺赛普科技有限公司</td><td>TSP050125</td><td>至&amp;nbsp; 作为镍铬丝的导向管。</td></tr><tr><td>玻璃微电极</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>BF100-50-10</td><td>使用填充的墨水标记植入的预定位置。</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad Software</td><td>N/A</td><td>分析并可视化结果。</td></tr><tr><td>导管</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150020</td><td>加载镍铬丝。</td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>Blackrock</td><td>N/A</td><td>信号传递工具</td></tr><tr><td>氦气球</td><td>Yili Festive products Co., Ltd.</td><td>24 英寸</td><td>用于平衡头件和微型驱动系统的重量。</td></tr><tr><td>墨水</td><td>Sailor Pen Co.,LTD.</td><td>13-2001</td><td>标记所需的植入位置。</td></tr><tr><td>碘酊</td><td>广东恒健制药有限公司</td><td>N/A</td><td>对小鼠头皮进行消毒。</td></tr><tr><td>盐酸林可霉素与利多卡因&amp;nbsp; 盐酸凝胶</td><td>湖北康正药业有限公司</td><td>10g</td><td>一种用于减轻炎症的药物。</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>Vicki Biotechnology Co., Ltd.</td><td>71125-38-7</td><td>减轻小鼠术后疼痛。</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Scientifica</td><td>Scientifica IVM Triple</td><td>用于电极阵列植入。</td></tr><tr><td>显微镜&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td>ECLIPSE Ni-E</td><td>&amp;nbsp;拍摄脑切片图像</td></tr><tr><td>nanoZ 阻抗测试仪</td><td>Plexon</td><td>nanoZ</td><td>用于多通道微电极阵列的阻抗测量或电极阻抗谱（EIS）分析。</td></tr><tr><td>NeuroExplorer</td><td>Plexon</td><td>NeuroExplorer</td><td>一种用于分析电生理数据的工具。</td></tr><tr><td>NeuroExplorer&amp;nbsp;</td><td>Plexon，美国</td><td>N/A</td><td>一种软件。</td></tr><tr><td>镍铬丝</td><td>California Fine Wire Co.</td><td>M472490</td><td>35 &amp;mu;m 镍铬丝。</td></tr><tr><td>离线分选器</td><td>Plexon</td><td>离线分选器</td><td>一种用于对记录的多通道单位进行分类的工具。</td></tr><tr><td>PCB板</td><td>杭州杰佩信息技术有限公司</td><td>N/A</td><td>计算机设计的电路板</td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>麻醉小鼠。</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td>对小鼠进行麻醉。</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>更长</td><td>BT100-1F</td><td>用于灌注的装置</td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500684-0500</td><td>固定小鼠脑组织所用固定液的主要成分&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PtCl&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>天津金博兰精细化工有限公司</td><td>13454-96-1</td><td>镀金液的配制</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>广东恒健制药有限公司</td><td>N/A</td><td>清洁小鼠颅骨。</td></tr><tr><td>银丝</td><td>苏州新业电子有限公司</td><td>2 mm 直径</td><td>安放接地电极和参考电极。</td></tr><tr><td>颅骨钻孔</td><td>RWD生命科学</td><td>78001</td><td>在小鼠颅骨上小心钻两个小孔。</td></tr><tr><td>不锈钢螺钉</td><td>YOUXIN电子有限公司</td><td>M0.8 × 2</td><td>用于保护微驱动系统，并连接接地电极和参考电极。</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>RWD生命科学</td><td>68513</td><td>进行双侧运动皮层的立体定位坐标操作。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Damao</td><td>57-50-1</td><td>对小鼠大脑进行脱水&amp;nbsp; 灌注后</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Henkel AG &amp;amp; Co.</td><td>PSK5C</td><td>固定导管和镍铬丝。</td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>哈佛仪器公司</td><td>TCAT-2</td><td>保持小鼠直肠温度在37&amp;deg;C</td></tr><tr><td>四环素眼膏</td><td>广东恒健制药有限公司</td><td>N/A</td><td>手术过程中保护小鼠的眼睛。</td></tr><tr><td>穿线</td><td>拉帕拉</td><td>N/A</td><td>连接球囊与前置放大器。</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>联合利华 plc</td><td>N/A</td><td>用于填补电极阵列与小鼠颅骨之间的间隙。</td></tr></tbody></table>

自由移动小鼠中的多通道胞外记录

Multichannel Extracellular Recording in Freely Moving Mice

本方案旨在通过将电生理信号与自发性行为和/或特定行为相关联，揭示执行特定任务的行为小鼠中神经元放电特性及神经网络局部场电位（LFPs）的特征。该技术是研究这些行为背后神经网络活动的有力工具。本文提供了在自由活动的清醒小鼠中进行电极植入及随后细胞外记录的详细而完整的操作流程。研究内容包括微电极阵列植入的详细方法、利用多通道系统记录运动皮层（MC）中的局部场电位和神经元锋电位信号，以及后续的离线数据分析。在清醒动物中进行多通道记录的优势在于，可以获得并比较更大量的放电神经元及神经元亚型，从而评估特定行为与相关电生理信号之间的关系。值得注意的是，本研究中所述的多通道细胞外记录技术及数据分析方法在对行为小鼠进行实验时，亦可应用于其他脑区。

应用高通滤波器（250 Hz）以从原始信号中提取多单位放电尖峰信号图6A）。此外，通过主成分分析（PCA）对正常小鼠运动皮层（MC）记录的神经元单位进行了验证（图7A-D），并记录了小鼠运动皮层（MC）中神经元单位的谷宽和波形持续时间。结果表明，小鼠MC中假定的锥体神经元（Pyn）的谷宽和波形持续时间均高于假定的中间神经元（IN）的相应值（图7E,F；双样本 Mann-Whitney 检验；对于谷宽，假定的 Pyn：0.636 ms ± 0.004 ms，假定的 IN：0.614 ms ± 0.001 ms， p = 0.002；对于波形持续时间，假定的Pyn：0.095 ms ± 0.004 ms，假定的IN：0.054 ms ± 0.002 ms， p = 1.402 × 10−16），对应于先前研...

该方案描述了在运动皮层（MC）进行细胞外记录的方法，以揭示自由活动的清醒小鼠的细胞外电生理特性，以及局部场电位（LFPs）和锋电位的数据分析方法，这对于评估与特定行为相关的神经网络活动具有重要意义。

该方案旨在通过研究执行特定任务的行为小鼠，揭示其神经元放电特性及神经网络局部场电位（LFPs）的特征。

我们的目标是通过将电生理信号与行为相关联，揭示在执行特定任务时活动小鼠的神经元放电特性及神经网络局部场电位的特征。微驱动系统进行的多通道细胞外记录已被证明是在行为测试期间监测中等规模神经活动的一种合适且高效的技术。在自由活动小鼠中进行多通道记录被公认为是神经科学研究中一项有用的技术，但对于初学者而言，信号的获取与分析仍然具有相当大的挑战性。我们介绍了如何使用更稳定且轻便的微型驱动系统，在自由活动的小鼠中进行多通道胞外记录，并针对初学者优化了记录和数据分析的流程。在新版本中，我们将增加通道数量并减小微型驱动系统的体积。首先组装微型驱动系统。使用两个颅骨和一个固定可移动微驱动装置的螺钉连接两个计算机设计的板，并将连接器固定到其中一块板上。确保微驱动装置能够承载用于大脑运动皮层（MC区域）两侧的两组八通道导管。将导管切割至相同长度。剪取16根镍铬丝，每根长约五厘米，直径为35微米。将镍铬丝装入导管中，并用胶水固定。剥除导线绝缘层，根据通道图以及参考电极和接地电极的位置，将每根裸露的导线分别与连接器上的对应针脚拧接在一起。然后，缓慢地将导电漆涂覆到每个针脚上。使用环氧树脂覆盖针脚，再通过阻抗测试仪进行镀金处理，使电极尖端的阻抗降低至约 350 千欧姆。进行电极阵列植入时，将麻醉后的小鼠固定于立体定位仪中，并使用温度控制器维持其直肠温度在 37 摄氏度。然后，做一个小的正中切口以暴露颅骨。使用剪刀去除残留组织，并用浸有无菌生理盐水的棉签清洁颅骨。使用装有墨水的玻璃微电极，在双侧运动皮层（MC）预定植入位置做标记。接下来，使用颅骨钻，在MC区域的颅骨左右两侧各小心钻出两个小孔。用精细镊子轻轻去除孔上的硬脑膜。然后，使用显微操作器以每秒10微米的速度将微驱动系统插入孔的中心位置。完成插入后，将石蜡油填充至牙科水泥壁内，并用混合好的牙科水泥将微驱动系统的底板与牙科水泥壁连接固定。对于多通道记录，在提前一天通过旋转微驱动系统可动部分上的螺丝来下放电极阵列。轻轻且小心地固定清醒小鼠的头部，然后用一根细线将头件的中心与一个氦气球连接，以抵消头件和微驱动系统的重量。使用记录电极和多通道系统，在记录软件中以 30 千赫兹的采样率采集原始信号，然后通过多通道系统的模数转换器进行数字化。通过对原始数据以 10 千赫兹重采样，并应用陷波滤波器去除 50 赫兹的工频噪声，提取局部场电位（LFP）信号。进行 spike 分选与分析时，在 spike 分选软件中点击文件，然后选择打开 NEV 文件，以导入以 30 千赫兹采样率采集的 spike 数据。单击信息以选择未分类通道，然后选择排序，更改排序方法，并使用K均值法。按下“谷值搜索排序”按钮，再进行K均值排序以获得已分类的神经元单元。接下来，在神经生理学数据分析软件中，通过单击文件、导入数据和Blackrock文件，打开已分类的脉冲文件。要获取所选单元的自相关图，请点击分析，然后选择自相关图并设置参数。加载已分类的峰电位数据后，点击分析，再选择峰电位间间隔直方图，以获得峰电位间间隔直方图，然后设置所需的参数。点击分析，然后选择互相关图，以获取两个已分类单元事件之间的互相关图，接着设置参考事件和相关参数。进行局部场电位（LFP）分析时，点击文件，导入数据，选择Blackrock文件以打开以10千赫兹采样的连续信号数据。然后，点击分析，再选择连续信号频谱，以分析所选通道LFP的功率谱。接下来，点击分析，再选择连续信号相干性，以分析来自运动皮层（MC）左右两侧两个LFP之间的相干性。随后，点击分析，再选择与连续变量的相关性，以分析来自运动皮层（MC）左右两侧两个LFP之间的相关性。完成后，点击结果，再选择数值结果，将功率谱密度、相干性和相关性结果保存为扩展名为.xls的文件。要分析锋电位与局部场电位（LFP）之间的相关性，请点击文件，然后选择导入数据和Blackrock文件，以打开连续信号数据和锋电位数据。接着，点击分析，再选择相干性分析，以分析所选通道中锋电位与LFP之间的相干性。最后，点击结果，然后选择数值结果，将锋电位-场相干性结果保存为扩展名为.dot XLS的文件。小鼠运动皮层（MC）中神经元单元的谷值宽度和波形持续时间显示，小鼠MC中假定的锥体神经元的谷值宽度和波形持续时间均高于假定的中间神经元。假定锥体神经元与中间神经元之间的交叉相关图表明，假定锥体神经元的放电发生在假定中间神经元之前，时间窗为18毫秒。在局部场电位（LFP）分析中，正常小鼠左右MC的LFP功率谱相似，提示左右MC之间存在同步活动。此外，还计算了左右MC之间的相干性和相关性。正常小鼠运动皮层中，假定的中间神经元相较于锥体神经元表现出更强的低γ频段锋电位-场相干性。

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神经科学

自由移动小鼠的多通道细胞外记录

本文介绍了在小鼠颅骨上植入超薄聚酰亚胺基微电极阵列（PBM-array）以获取小鼠模型高密度脑电图（EEG）的手术步骤及操作要点。...

基于聚酰亚胺的微电极对自由活动小鼠进行高密度脑电图记录

该视频展示了将网状电子探针注入小鼠脑内，以实现单个神经元水平的稳定长期记录。将已麻醉且颅骨暴露的小鼠固定在立体定位仪上，通过颅骨钻孔将探针的网状装置区域注入脑内。探针的输入-输出焊盘连接至电路，并通过数据采集系统获取记录信号。...

用于小鼠大脑稳定单神经元记录的可注射网状电子器件

本视频展示了对小鼠大脑中处理听觉刺激的特定区域的神经元活动的研究。该技术包括施加一种抑制性神经传递阻断剂，并在药物作用于局部脑区前后，比较神经元对听觉刺激的反应。...

在清醒小鼠中研究抑制性神经递质阻断剂存在下的听觉神经元反应

本方案描述了一种用于在清醒大鼠中监测皮层下脑区神经元活动的头部固定装置的设计与外科植入方法。该方案详细说明了通过邻细胞记录配置分离单个神经元并有效确定其解剖位置的操作步骤。...

清醒且头部固定的雄性大鼠皮层下脑区单个神经元的紧密细胞外记录与定位

关键词：紧密细胞外记录，单神经元记录，皮层下脑结构，清醒动物，头部固定，大鼠

该方法为小鼠在显微成像或单细胞电生理记录期间提供了一个可感知且熟悉的环境，使其能够在动物头部被牢固固定的情况下进行导航与探索。...

平底式气浮平台：一种将清醒自由活动啮齿类动物行为学与显微成像或电生理记录相结合的新方法

我们介绍了用于构建电极的方法，可在清醒小鼠中同时记录细胞外神经活动，并在记录位点附近释放多种神经活性物质。该技术能够对目标神经元的潜在局部突触输入进行详细分析。...

清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

介绍了一种用于自由活动大鼠的多通道神经记录与刺激的无线双向系统。该系统轻便紧凑，对动物的行为模式影响极小。此外，这种双向系统为评估脑激活模式与行为之间的因果关系提供了先进的工具。...

一种无线双向接口 体内 在自由活动大鼠中记录与刺激神经活动

本文介绍了一种利用同步视频、脑电图（EEG）和心电图（ECG）记录小鼠脑部和心脏生物信号的实验方案。同时，我们还描述了分析所得EEG-ECG记录数据的方法，用于检测癫痫发作、EEG频谱功率、心脏功能及心率变异性。...

同步视频-脑电图-心电图监测用于识别癫痫小鼠模型中的神经心脏功能障碍

提出一种低成本脑电图记录系统，并结合毫米级线圈，用于在活体小鼠大脑中进行经颅磁刺激。in...

低成本脑电图记录系统结合毫米级线圈用于活体小鼠脑部经颅刺激 体内

本方案旨在建立一种可靠且易于操作的系统，用于记录自由活动啮齿类动物的脑电图（EEG）。...

一种经济高效且微创的自由活动小鼠多部位慢性脑电图记录方案

本方案描述了一种两阶段手术方法，用于在小鼠中创建一个大尺寸、可重复密封且保留硬脑膜的颅窗。该技术能够在数周时间内对分布式的深部脑网络（如默认模式网络）进行长期、多模态的电生理记录。...

用于小鼠默认模式网络纵向多模态电生理记录的大尺寸可重复密封颅窗手术方案

学习使用轻量微驱动系统在自由移动小鼠运动皮层进行多通道细胞外记录的方法。该技术可同步采集局部场电位和神经脉冲信号，帮助研究者分析行为相关的神经网络动态，为神经科学研究提供可靠的电生理数据获取方案。

自由移动小鼠中的多通道胞外记录

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