Name: 在细胞中直接合成EM-可见金纳米颗粒，用于蛋白质定位分析，具有保存完好的超微结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习一种新型电子显微镜标记技术，用于在细胞内直接合成金纳米颗粒以定位金属硫蛋白标记的蛋白质。该方法避免醛类固定剂，可在保存超微结构的同时实现单分子可视化，适用于大肠杆菌和HeLa细胞等样本。

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本方案改编自Jiang等人（2020年）发表的文章。本研究得到了中国科学技术部（973计划项目编号：2011CB812502和2014CB849902）以及北京市政府资金的支持。

本实验中使用的所有试剂和材料均列于材料表中。当前实验方案的逐步操作流程见图1。
1. 在蓝宝石圆片上进行细胞培养
<ol>
	<li>将3 mm × 0.16 mm的蓝宝石圆片转移至含有1 mL乙醇的2 mL离心管中，在超声波清洗器中超声处理10分钟。</li>
	<li>用酒精灯火焰灼烧每一片蓝宝石圆片，直至其表面无可见残留物。 
	注意：通过上述方法，蓝宝石圆片可多次重复使用。</li>
	<li>使用耐溶剂记号笔在每片蓝宝石圆片的一面标记编号（图1A）。 
	注意：所用记号笔需预先测试其是否耐丙酮和甲醇等溶剂，以防止标记脱落。</li>
	<li>将标记好的蓝宝石圆片放置于35 mm培养皿底部，标记面朝上。</li>
	<li>将含有蓝宝石圆片的细胞培养皿置于紫外线下灭菌30分钟。</li>
	<li>用镊子将蓝宝石圆片翻转（标记面朝下），再在紫外线下额外灭菌30分钟。此时，含有蓝宝石圆片的培养皿已准备好用于细胞培养。 
	注意：蓝宝石圆片也可通过高压蒸汽灭菌法进行灭菌。</li>
	<li>将细胞接种至上述制备好的蓝宝石圆片上，在37 °C、95%湿度、5% CO2的细胞培养箱中培养至80%–90%汇合度（图1B）。 
	注意：表达MTn标签的稳定HeLa细胞系的构建方法见Jiang等人的文献26。</li>
</ol>
2. 高压冷冻（HPF）
警告：本实验使用液氮。操作液氮时，应遵循适当的安全规程并佩戴个人防护装备，以防止冻伤和窒息。
<ol>
	<li>根据制造商的说明，在实验前至少2小时准备好高压冷冻仪。</li>
	<li>将A型HPF铝载片（凹槽：0.025/0.275 mm）转移至含有1 mL乙醇的2 mL离心管中，在超声波清洗器中超声处理10分钟。</li>
	<li>将载片置于铺有中速定性滤纸的培养皿中干燥。</li>
	<li>将预清洗的载片浸入1-十六碳烯中。 
	注意：本实验不推荐使用BSA作为冷冻保护剂，因为它会干扰后续的金纳米颗粒合成。</li>
	<li>用精细镊子从培养皿中夹取带有细胞的蓝宝石圆片，用中速定性滤纸轻触标记面，以去除多余培养基。 
	注意：水的热导率极低，残留过多水分会影响冷冻效果。应保留极少量水分以防止细胞干燥。</li>
	<li>将蓝宝石圆片装入HPF样品托中，并迅速用含有1-十六碳烯的0.025 mm深铝载片封盖（图1C）。</li>
	<li>用中速定性滤纸吸除多余溶液。</li>
	<li>将样品托管装入高压冷冻仪中（图1D）。 
	注意：样品装载过程应尽可能迅速（1分钟内完成），以最大限度减少因温度、湿度、pH值和氧气含量变化引起的生理改变。</li>
	<li>在泡沫冷冻盒中，于液氮环境下卸下蓝宝石圆片-载片组件，并在使用前将组件存放在液氮中的冻存管内。 
	&#8203;注意：此处可暂停本方案。装在冻存管中的样品可在液氮杜瓦瓶中长期保存数年。</li>
</ol>
3. 冷冻置换固定（FSF）与再水化（图1E）
<ol>
	<li>向自动冷冻置换仪（AFS）中加入液氮，并将腔室冷却至−90 °C。 
	注意：本实验使用液氮。操作液氮时，必须遵循适当的安全规程并佩戴个人防护装备，以防冻伤和窒息。</li>
	<li>在通风橱中，于20 mm圆形聚丙烯容器（图1E）内配制2 mL含0.01%（w/v）单宁酸的丙酮溶液（FSF溶液1），并将其在液氮中冷冻。</li>
	<li>使用预冷的镊子在液氮环境下将样品（蓝宝石圆盘-载体组件）装载至含有已冷冻FSF溶液1的容器中。</li>
	<li>将容器转移至预冷的AFS腔室中，在−90 °C下进行FSF处理。</li>
	<li>在−90 °C下保持样品1小时；然后用预冷的镊子将蓝宝石圆盘从载体上分离，并确保蓝宝石圆盘的标记面朝下。 
	注意：镊子必须充分预冷，以防止温度变化。蓝宝石圆盘应能轻松分离。</li>
	<li>继续在−90 °C下保持8–10小时；随后在3小时内升温至−60 °C。</li>
	<li>用预冷的丙酮替换容器中的FSF溶液1，并在其中孵育1小时。重复此丙酮洗涤步骤2次。</li>
	<li>在3小时内升温至−30 °C。在此期间，在2 mL离心管中配制并预冷2 mL含0.01%醋酸铀酰的丙酮溶液（FSF溶液2，由甲醇中的10%醋酸铀酰稀释而成）。 
	注意：本实验所用的醋酸铀酰具有放射性且剧毒；必须按照适当的安全规程操作，并作为危险化学废物处理。</li>
	<li>将丙酮替换为FSF溶液2，在−30 °C下孵育3小时。</li>
	<li>用预冷的丙酮替换容器中的FSF溶液2，在−30 °C下孵育30分钟。重复此丙酮洗涤步骤2次。</li>
	<li>在2小时内从−30 °C升温至4 °C。</li>
	<li>将丙酮替换为2 mL含有1 mM CaCl2和1 mM MgCl2的0.2 M HEPES缓冲液（pH 5.5）。</li>
	<li>更换一次缓冲液，在室温下孵育1小时，或在4 °C下过夜。 
	&#8203;注意：本方案可在此处暂停一晚，或继续孵育至少6小时，直至步骤5中样品再次冷冻。</li>
</ol>
基于 ANSM 的哺乳动物细胞 AuNP 合成（图 1F）
<ol>
	<li>用 PBS-A 缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将蓝宝石圆盘转移至含有1 mL PBS-A缓冲液的35 mm培养皿中，于室温下放置。 
	注意：始终使蓝宝石圆盘的标记面朝下放置，避免蓝宝石圆盘相互重叠以及摩擦导致细胞脱落。</li>
	<li>在通风橱中，将 4.28 µL 的 2-巯基乙醇加入含有 1 mL PBS-A 缓冲液的 2 mL 离心管中，充分混匀，制备还原溶液。 
	警告：2-巯基乙醇具有毒性并伴有刺激性气味，必须按照适当的安全规程进行操作。</li>
	<li>将培养皿中的 PBS-A 缓冲液更换为 1 mL 还原溶液，在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>使用前制备金前体。
	<ol>
		<li>加入80 µL 10 mM HAuCl4 在 ddH₂O 中2将 O 加入含有 1 mL 还原溶液的 2 mL 离心管中，并立即涡旋。 
		注意：溶液可能会变浑浊。</li>
		<li>向上述溶液中加入 80 µL ddH2O 配制的 500 mM D-青霉胺，并立即涡旋。 
		注意：溶液可能会再次变澄清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养皿中的溶液更换为步骤4.5中制备的1 mL金前体溶液，在4 °C下孵育2小时。 
	注意：1 毫升金前体溶液足以与约 1 × 106 细胞（在35 mm培养皿上汇合）。当金纳米颗粒（AuNPs）尺寸显著减小时，需要更大体积的前体溶液。</li>
	<li>称取 0.0038 g NaBH₄4 将1 mL预冷的ddH₂O加入1.5 mL离心管中2O，并涡旋以制备新鲜的100 mM NaBH4 使用前立即</li>
	<li>加入 20–100 µL 的 100 mM NaBH₄4 向步骤4.6的溶液中加入，立即振荡混匀，并在室温下孵育5分钟。 
	注意：配制 100 mM NaBH₄4 新鲜配制以供立即使用。加入 NaBH4溶液的颜色将逐渐变为红色，随后加深。若未观察到颜色变化，则很大程度上表明实验失败。</li>
	<li>用 2 mL PBS-A 缓冲液替换溶液以终止反应。 
	注意：反应必须在30分钟内终止，因为反应时间过长会逐渐破坏金纳米颗粒（AuNPs）。</li>
</ol>
5. 高压冷冻与冷冻置换固定（图1C-F）
注意：样品经过高压冷冻和冷冻置换处理，该步骤与之前第2节和第3节所述基本相同，仅作少量修改。
<ol>
	<li>在丙酮中配制1%四氧化锇和0.1%醋酸铀酰（FSF溶液3，由丙酮中的4%四氧化锇和甲醇中的10%醋酸铀酰稀释而成）。 
	注意：四氧化锇和醋酸铀酰为高毒性化学品，必须按照适当的安全操作规程进行操作，并作为危险化学废物处理。</li>
	<li>使用预冷的镊子将样品（蓝宝石圆盘-载体组件）装载到装有液氮中冷冻的FSF溶液3的容器中。</li>
	<li>将容器转移至预冷的AFS腔室，在−90 °C下进行FSF处理，并运行以下FSF程序：在−90 °C保持8–10小时；然后在3小时内升温至−60 °C；在−60 °C保持3小时；再在3小时内升温至−30 °C；在−30 °C保持3小时；最后在2小时内升温至4 °C。</li>
	<li>当温度达到4 °C时，将样品转移至通风橱，并在室温下维持15分钟。</li>
	<li>用丙酮洗涤3次，每次15分钟。</li>
	<li>在室温下用丙酮浸泡至少2小时。</li>
</ol>
6. 树脂浸润、包埋与聚合
<ol>
	<li>使用前，按照制造商说明配制环氧树脂混合物。 
	警告：本实验所用环氧树脂在聚合前具有毒性，必须按照适当的安全规程操作。未聚合的树脂应作为危险化学废物处理，或在丢弃前完成聚合。</li>
	<li>将蓝宝石圆片转移至平底包埋胶囊中，并在室温下用树脂浸透至少30分钟。 
	注意：请保持蓝宝石圆片的标记面朝下。</li>
	<li>将样品在60 °C的烘箱中聚合至少18小时。 
	&#8203;注意：聚合完成后可在此处暂停实验流程。聚合后的样品块可在干燥容器中长期保存数年。</li>
</ol>
7. 超薄切片
<ol>
	<li>使用剃刀小心修整已聚合的样品块，以暴露蓝宝石圆片。</li>
	<li>将带有蓝宝石圆片的样品块尖端浸入液氮中数秒，然后在室温下解冻。重复多次冻融操作，以使圆片从样品块上脱离。 
	注意：避免长时间冷冻，否则可能导致样品块开裂。使用刀片轻轻剥离蓝宝石圆片，避免施加过大力量，以免损伤样品。</li>
	<li>将样品块表面修整为梯形，以便进行超薄切片（图1G）。</li>
	<li>使用超薄切片机获取70–100 nm的超薄切片（图1H）。</li>
	<li>将切片捞取至200目六边形铜网上。 
	&#8203;注意：切片完成后可在此处暂停本方案。载有切片的铜网可在干燥容器中长期保存数年。如需提高膜结构对比度，可用2%醋酸铀染色。应避免使用铅染色，因其会掩盖纳米金颗粒信号。</li>
</ol>
8. 透射电子显微镜成像（图1I）
<ol>
	<li>使用透射电子显微镜在铜网上观察超薄切片。通常，11 kX 至 30 kX 的放大倍数适用于观察细胞中的金纳米颗粒（AuNPs），并需设置适当的离焦值以确保 2–3 nm 的 AuNPs 可见。</li>
</ol>

Direct Synthesis of Gold Nanoparticles for Protein Localization Analysis

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究介绍了一种稳健的可克隆电子显微镜标记技术，可在细胞环境中以超微结构分辨率对蛋白质分子进行单分子水平的可视化。通过在基因编码的富含半胱氨酸标签上直接合成金纳米颗粒（AuNPs），可实现对目标蛋白的明确且精确定位。高压冷冻与冷冻置换技术可极好地保存生物样本的超微结构。综上所述，本文所展示的可克隆电子显微镜标记技术为在原位（in situ）条件下利用电子显微镜高效定位和识别单个分子提供了强有力的工具。
ANSM 机制抑制了硫醇盐-Au(I) 聚合物的自成核过程26，该过程是经典 Brust-Schiffrin 方法（BSM）27 中常见的反应，而 BSM 被广泛用于合成硫醇盐封端的金纳米簇。因此，基于 ANSM 的 AuNP 合成技术能够直接在富含半胱氨酸的标签上特异性地合成 2–6 nm 大小的 AuNP，作为电子显微镜观察中具有高信噪比和高效率的电子致密标记物。与依赖 DAB 聚合物沉积的 APEX2 或 HRP 标记技术不同，后者产生的沉积物不可计数，且不适用于细...

在后基因组时代，绿色荧光蛋白（GFP）作为光学显微镜下单分子报告分子的发展，彻底改变了现代生命科学研究领域1,2。数十年来，电子显微镜（EM）一直是直观观察细胞超微结构并实现纳米级分辨率的有力工具3；然而，蛋白质分子的精确定性和定位仍然具有挑战性。
最常用的电镜标记技术是基于抗原-抗体反应的免疫电镜（IEM）标记技术。然而，尽管在IEM标记领域已发展出多种技术，包括包埋前IEM和包埋后IEM（在树脂切片或水合冷冻切片上进行），其标记效率仍然较低（&#60;10%）4,5，这与样品制备和抗体质量有关。为了克服这些局限性，开发可遗传编码的标签具有广阔的应用前景。
近年来已深入研究了两种主要类型的电镜标记物。其中一种是DAB染色法，该方法利用APEX2等标签将3,3'-二氨基联苯胺（DAB）氧化为嗜锇聚合物，以实现电镜下的可视化6,7,8,9,10,11,12可实现亚细胞区域中高丰度蛋白的标记，但不适用于单分子计数。另一种类型则利用金属结合蛋白，如铁蛋白13 和金属硫蛋白（MT）14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26，以生成电子致密的金属沉积物 原位 用于电子显微镜观察。只有后者真正具备单分子可视化与计数的潜力。铁蛋白的分子量过大（约450 kD），难以成为有前景的标记物；而金属硫蛋白（MT）分子量小（约5 kD），且其20个半胱氨酸残基可结合多种金属离子，因而受到广泛关注。多个实验室已尝试通过直接孵育金离子（Au）来标记纯化的MT融合蛋白或表达MT的细胞。+这些尝试最初证明了MT标签能够结合金离子形成高对比度信号，但均未能真正实现细胞中单个蛋白质的有效鉴定，且适用性不广。14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
基于 ANSM 的 AuNP 合成技术通过在富含半胱氨酸的标签（例如 MT、MT 变体 MTn 和 MTα、AFP）上直接合成 2–6 nm 大小的 AuNP，作为电子致密标记物用于电镜观察，是用于细胞内蛋白质标记和单分子检测的首个可靠且适用的方法24,25,26。该方法可在分离的标签融合蛋白上特异性地合成 AuNP，并已在未固定或化学固定的原核细胞（E. coli）和真核细胞（S. pombe）中实现了前所未有的标记效率。然而，在更复杂的系统（如哺乳动物细胞甚至组织）中应用相同方案时会面临额外挑战，例如更复杂的细胞内氧化还原稳态以及更脆弱的细胞结构。
本研究介绍了一种可克隆的电子显微镜标记技术，该技术将基于新型ANSM的金纳米颗粒合成方法用于标记基因编码的富含半胱氨酸标签（MT），并结合HPF/FSF-再水化-HPF/FSF样品制备方法，实现了在HeLa细胞的内质网膜、内质网腔和线粒体基质中对标记蛋白的明确单分子识别。当前方法兼具高标记效率、高信噪比、单分子标记和强通用性的特点，在生命科学研究中具有广泛的应用前景。

<table><tbody><tr><td>0.025 mm/0.275 mm 铝制载片</td><td>北京乌伦德斯生物科技有限公司，或 M. Wohlwend 工程办公室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M HEPES 缓冲液</td><td></td><td></td><td>将 HEPES (0.2 M) 溶解于 980 mL 去离子水（ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）中，然后分别加入 10 mL 100 mM MgCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;和 10 mL 100 mM CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;（终浓度为 1 mM），调节 pH 至 5.5</td></tr><tr><td>1.5 mL MaxyClear 扣盖微量离心管</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 聚丙烯螺口微量离心管</td><td>Biologix</td><td>81-0204</td><td></td></tr><tr><td>200 目六边形铜网</td><td>Tedpella 公司</td><td>G200HEX</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Amresco</td><td>0482-250ML</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯离心管</td><td>Corning</td><td>430928</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>北京同光精细化工公司</td><td>31025</td><td></td></tr><tr><td>自动冷冻置换仪</td><td>Leica</td><td>AFS2</td><td></td></tr><tr><td>定制 3.05 mm × 0.66 mm 高压冷冻样品夹</td><td>北京乌伦德斯生物科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-青霉胺</td><td>TCI</td><td>P0147</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基</td><td>GBICO</td><td>C11965500BT</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GBICO</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>平底包埋胶囊</td><td>Tedpella 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>泡沫冷冻盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 树脂</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>HAuCl4</td><td>Sigma</td><td>4022-1G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>高压冷冻仪（HPF 仪）</td><td>Wohlwend&amp;nbsp;</td><td>HPF compact01</td><td></td></tr><tr><td>甲醇&amp;nbsp;</td><td>北京同光精细化工公司</td><td>12397</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Sigma</td><td>480886-25G</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>PBS-A 缓冲液</td><td></td><td></td><td>将 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;(1.125 mM)、Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;(3.867 mM) 和 NaCl (100 mM) 溶解于 1 L 去离子水（ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）中，调节 pH 至 7.4</td></tr><tr><td>定性滤纸（中速）</td><td>碧云天生物技术公司</td><td>FFT08</td><td></td></tr><tr><td>蓝宝石圆片</td><td>北京乌伦德斯生物科技有限公司，或 M. Wohlwend 工程办公室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>耐溶剂记号笔</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>62053-B</td><td></td></tr><tr><td>SPI-Pon 812 树脂</td><td>SPI 公司</td><td>02659-AB</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 spirit</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>GBICO</td><td>C25200-056</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica</td><td>FC7</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

细胞内直接合成电磁可见金纳米颗粒用于超微结构良好保存的蛋白质定位分析

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

以超微结构分辨率分析蛋白质分子在细胞内的精确定位，对于研究所有生物体的各种生理或病理过程具有重要意义。因此，开发可用于电子显微镜探针的可克隆标签具有重要价值，正如荧光蛋白在光学成像领域发挥的关键作用一样。最近发现了自成核抑制机制（ANSM），该机制能够实现金纳米颗粒（AuNPs）在富含半胱氨酸的标签（如金属硫蛋白（MT）和抗冻蛋白（AFP））上的特异性合成。
根据法国国家药品安全局（ANSM）的研究，开发出一种电子显微镜标记技术，能够以前所未有的标记效率特异性检测原核和真核细胞中的标记蛋白。本研究展示了一种在超微结构保存良好的哺乳动物细胞中检测MTn（一种经过改造、不含醛反应性残基的MT变体）融合蛋白的实验方案。该方案采用高压冷冻结合冷冻置换固定技术，并使用非醛类固定剂（如单宁酸、醋酸铀酰）进行固定，以保持接近天然状态的超微结构，同时避免醛类交联对标签活性造成的损害。
在基于ANSM的金纳米颗粒合成之前，采用了一步简单的复水方法。结果表明，标记的蛋白质能够高效且特异地靶向多种细胞器，包括内质网（ER）的膜和腔室，以及线粒体基质。该研究为生物学家提供了一个可靠的实验方案，可在细胞超微结构背景下以单分子水平回答广泛的生命科学问题。

基于ANSM的AuNP合成技术是一种利用透射电子显微镜（TEM）标记和检测MT标签蛋白的极为有用的工具26。为验证该技术在哺乳动物细胞中的可靠性，构建了三种在Hela细胞中稳定表达EGFP-MTn-KDEL、Ost4-EGFP-MTn或Mito-acGFP-MTn的细胞系。KDEL是一种经典的C端内质网（ER）滞留/回收序列，可使融合蛋白EGFP-MTn-KDEL保留在内质网腔或核膜（NE）的核周间隙中。Ost4是寡糖基转移酶复合物的一个亚基，该复合物是一种定位于内质网和核膜的膜蛋白复合物，负责新生多肽链的N-糖基化反应。Ost4融合蛋白Ost4-EGFP-MTn的C端朝向细胞质。Mito是一种线粒体靶向序列，可将融合蛋白Mito-acGFP-MTn靶向至线粒体基质中。
采用HPF/FSF样品制备方法，并结合使用鞣酸和醋酸铀代替醛类固定剂，可良好地保存超微结构并获得优异的膜对比度（图2、图3 和 <strong cl...

本实验方案描述了一种可克隆的电子显微镜标记技术，该技术利用基于新型自成核抑制机制的金纳米颗粒合成方法，用于检测细胞中金属硫蛋白标签蛋白。

以超微结构分辨率分析蛋白质分子在细胞内的精确定位，对于研究各种生物学过程具有重要意义。

蛋白质的检测与定位在生物研究中至关重要。我们的实验方案描述了一种利用基因编码标签的新型电镜标记技术，可在超微结构良好保存的情况下实现原位单分子可视化。必须避免过度固定。该标记方法基于标签中半胱氨酸的活性，这些半胱氨酸对醛类交联剂高度敏感。我们的实验方案避免使用醛类固定剂，同时保留了标签活性和超微结构。电镜标记一直具有挑战性，常面临形态学保存不佳或标记效率低下的问题。本方案通过在单个蛋白质上直接合成残留纳米颗粒，实现对目标蛋白质的清晰精确定位，具有高信噪比、高效率和高特异性。迄今为止，我们已在分离的蛋白质、大肠杆菌细胞、东方鲎细胞和HeLa细胞中实现了优异的标记效果。接下来，我们将探索并优化该方法在组织样本中的应用。结合当前的冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）和冷冻电镜（cryo-EM）技术，将使我们能够解决重要的生物学问题。将3毫米×0.16毫米的蓝宝石圆片转移至含有1毫升乙醇的2毫升离心管中，并在超声波清洗器中超声处理10分钟。将每片蓝宝石圆片在酒精灯火焰上灼烧，直至表面无可见残留物。使用耐溶剂笔在每片蓝宝石圆片的一侧标记编号。将标记好的蓝宝石圆片放入35毫米培养皿底部，标记面朝上。将含有蓝宝石圆片的细胞培养皿置于紫外线下照射30分钟以进行灭菌。用镊子翻转蓝宝石圆片，确保标记面朝下，并在紫外光下额外灭菌30分钟。将表达MTN标签的稳定HeLa细胞系接种到制备好的蓝宝石圆片上，并在细胞培养箱中培养至80%至90%汇合度。根据制造商的说明，在开始实验前至少两小时准备高压冷冻（HPF）设备。将A型HPF铝载网转移至含有1毫升乙醇的2毫升离心管中，并在超声波清洗器中超声处理10分钟。将载网置于铺有定性滤纸的培养皿中干燥。将预清洁的载体浸泡在1-十六碳烯中。用精细镊子从HeLa细胞培养皿中取出预先准备好的蓝宝石圆片。用定性滤纸接触标记面，以去除多余的培养基。将蓝宝石圆盘装入高压冷冻样品载 holder 中，并迅速用含有 1-十六碳烯、深度为 0.025 毫米的铝制载具封盖圆盘。用定性滤纸吸除多余溶液。将样品载具装载至高压冷冻仪中进行冷冻。在泡沫低温盒中，于液氮环境下卸下蓝宝石圆盘载体组件。在通风橱中，于一个20毫米圆形聚丙烯容器内准备2毫升游离置换固定液（FSF溶液1），并用液氮将其冷冻。使用一对预冷的镊子，在液氮环境中将蓝宝石圆盘及载体组件装载到盛有已冷冻FSF溶液1的容器中。将此容器转移至预冷的自动冷冻置换装置腔室中，在零下90摄氏度条件下进行冷冻置换处理。保持样品在零下90摄氏度环境中一小时。随后使用预冷镊子将蓝宝石圆片从载具上分离，确保蓝宝石圆片的标记面朝下。将标本在零下90摄氏度条件下继续保存8至10小时，然后在3小时内升温至零下60摄氏度。将容器中的FSF溶液1更换为预冷的丙酮，并在零下60摄氏度下孵育1小时。重复此丙酮洗涤步骤两次。在三小时内升温至零下30摄氏度。同时，在2毫升离心管中准备并预冷2毫升FSF溶液2，置于零下30摄氏度环境中。用FSF溶液2替换丙酮，并在零下30摄氏度孵育三小时。然后，将容器中的 FSF 溶液 2 替换为预冷的丙酮，并在 -30 °C 下孵育 30 分钟。重复此丙酮洗涤步骤两次。在两小时内将温度从 -30 °C 升至 4 °C。用两毫升 0.2 摩尔的 HEPES 缓冲液替换丙酮。更换一次缓冲液，于室温或 4 摄氏度下孵育过夜。取预先制备的经高压冷冻和快速冷冻置换处理的含稳定 HeLa 细胞的蓝宝石圆片，用 PBSA 缓冲液洗涤 5 分钟，并重复此过程 3 次。将蓝宝石圆片转移至含有1毫升PBSA缓冲液的35毫米培养皿中，于室温下孵育。用1毫升还原溶液替换培养皿中的PBSA缓冲液，并于室温下孵育1小时。在1毫升还原溶液中配制金前体溶液，并立即通过涡旋振荡充分混匀。向金前体溶液中加入80微升500毫摩尔的双蒸水中二巯基丙胺，立即涡旋。将培养皿中的溶液更换为1毫升金前体溶液，在4摄氏度下孵育2小时。向金前体溶液中加入20至100微升 freshly prepared 硼氢化钠溶液。立即轻轻振荡以充分混匀，并在室温下孵育五分钟。用两毫升 PBSA 缓冲液替换溶液以终止反应。随后，根据制造商说明书配制环氧树脂混合液。将蓝宝石圆片转移至平底包埋胶囊中，并在室温下用树脂浸透至少30分钟。将样品置于60摄氏度的烘箱中聚合至少18小时。通过使用刀片小心修块以暴露蓝宝石圆片，对聚合后的样品制备超薄切片。将带有蓝宝石圆片的模块尖端浸入液氮中数秒，然后在室温下解冻。重复冻融操作数次，以使圆片从模块上脱落。EGFP-Mtn-KDEL 蛋白表现为直径两至五纳米的金纳米颗粒，特异性分布于周边内质网腔以及核膜的核周间隙中。保存完好的超微结构使得能够对标记蛋白进行单分子鉴定，并有助于分析细胞器之间的相互作用，例如内质网与线粒体的相互作用。Ost4-EGFP-MTn 蛋白的纳米颗粒在核膜外膜上勾勒出内质网膜的轮廓。同样，表达 Mito-acGFP-MTn 的细胞在线粒体基质中显示出特异性标记。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在细胞中直接合成EM-可见金纳米颗粒，用于蛋白质定位分析，具有保存完好的超微结构

我们描述了一种在电子显微照片中定位荧光标记蛋白的方法。首先在超薄切片上利用光激活定位显微镜对荧光信号进行定位，然后将这些图像与同一切片的电子显微照片进行配准对齐。...

纳米级荧光-电子显微：利用光激活定位显微镜与电子显微镜进行蛋白质定位

本视频介绍了BiFC-PALM技术——即光激活定位显微镜与双分子荧光互补技术的结合，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。双分子荧光互补（BiFC）技术涉及将两种目标相互作用蛋白分别与两个荧光蛋白片段融合。当这两个蛋白发生相互作用时，荧光蛋白片段被拉近至彼此邻近的位置，从而能够结合并重建出具有功能的完整荧光蛋白。通过PALM技术，可在单分子水平上对细胞内单个荧光分子的荧光信号进行精确定位。...

双分子荧光互补偶联光激活定位显微镜技术

酵母内体系统的纳米金标记用于超微结构分析

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。...

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

通过将双分子荧光互补（BiFC）与光激活定位显微镜（PALM）相结合，可在细胞中以纳米级空间分辨率可视化蛋白质-蛋白质相互作用。本文描述了在U2OS细胞中利用BiFC-PALM成像Ras-Raf相互作用，以观察单个Ras-Raf复合物的纳米级簇集和扩散行为。...

双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

后包埋免疫胶体金法是进行特定分子亚细胞定位高分辨率分析的最有效方法之一。本文介绍了一种定量分析视网膜带状突触处谷氨酸受体的实验方案。...

视网膜带状突触膜受体的高分辨率定量免疫金分析

我们介绍了一种合成生物相容性10 nm金纳米颗粒的方法，通过在表面包被聚乙二醇对其进行功能化。这些颗粒可用于 体外 和 体内...

功能化10 nm聚合物包被金颗粒的合成及其在内皮靶向与药物递送中的应用

我们提出了一种研究线粒体和内质网在基因改造后于全细胞中分布的方案，该方案结合了相关光镜与三维电子显微镜技术，包括抗坏血酸过氧化物酶2和辣根过氧化物酶染色、在同一切片中对含有或不含目标基因的细胞进行连续切片，以及通过电子显微镜进行连续成像。...

线粒体与内质网的光与体电子显微镜关联成像

本文描述了一种可靠且易于重复的方法，用于制备可功能化、近红外发射的光致发光金纳米簇，并通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜直接检测其在HeLa细胞内的存在。...

近红外发光金纳米簇的合成及其生物应用

本方案描述了冷冻APEX（cryoAPEX）方法，该方法可在超微结构得到最佳保存的细胞内，通过透射电子显微镜对带有APEX2标签的膜蛋白进行定位。...

用于超微结构完整细胞中膜蛋白定位电子显微镜分析的CryoAPEX方法

本方案介绍了一种在结构保持完整的染色质中对复制位点进行高分辨率定位的技术 原位...

通过电子断层扫描技术在超微结构保存的染色质中成像复制结构域

学习一种新型电子显微镜标记技术，用于在细胞内直接合成金纳米颗粒以定位金属硫蛋白标记的蛋白质。该方法避免醛类固定剂，可在保存超微结构的同时实现单分子可视化，适用于大肠杆菌和HeLa细胞等样本。

细胞内直接合成电磁可见金纳米颗粒用于超微结构良好保存的蛋白质定位分析

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