基于图像的方法研究气孔谱系细胞中的膜运输事件

该技术通过研究植物地上表面气孔（促进光合作用和蒸腾作用的微孔）发育过程中的膜运输事件，来揭示其发育机制。目前有多种技术被用于研究植物气孔的发育，包括分子生物学、细胞生物学或显微技术、化学生物学、质谱分析、生物化学以及结构生物学。

单个气孔异步形成。每个气孔由三次超越细胞命运的转变形成。因此，在特定细胞命运阶段收集到足够数量的气孔谱系细胞是主要挑战之一。

膜运输对于细胞的存活和生长至关重要，气孔谱系细胞也不例外。本方案介绍了研究气孔谱系细胞中膜运输事件的常用方法。

在气候变化的背景下，植物面临着严峻的环境挑战。气孔是植物进行气体交换的通道，能够高度灵活地响应环境胁迫以适应变化。我们的研究兴趣在于，通过聚焦气孔谱系细胞中特定蛋白质的膜运输过程，探讨非生物胁迫如何影响气孔的发育。

为了开始对双色标记的F1代拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行药理学分析，解剖并去除七天龄转基因幼苗的子叶。在1.5毫升微量离心管中加入500微升浓度为30微摩尔的布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA）溶液，将解剖后的幼苗浸入其中。

将一个10毫升注射器紧密连接到微量离心管上，施加真空持续1分钟。在成像前，先将样品在溶液中孵育30分钟，孵育前需移除注射器。接着，将解剖的7日龄幼苗浸入25毫摩尔的渥曼腺素（wortmannin）溶液中。

在将样品浸入后，先施加真空处理一分钟，再孵育30分钟。在转基因植物中研究ERL1的运输途径发现，暴露于布雷菲德菌素A溶液30分钟后，可在称为BFA小体的大区室中检测到ERL1-YFP。这表明布雷菲德菌素A能够阻断ERL1的运输，提示ERL1存在回收或内吞作用。

当转基因植株用渥曼青霉素处理30分钟后，ERL1-YFP标记出称为Wm小体的环状结构。这表明ERL1-YFP被转运至多泡体，提示ERL1经由根部途径被运输至液泡进行降解。为了开始对双色荧光F1代拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行药理学分析，解剖并去除七天龄转基因幼苗的子叶。

在1.5毫升微量离心管中加入500微升浓度为30微摩尔的布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA）溶液。将解剖后的幼苗浸入其中。将一个10毫升注射器紧密连接到微量离心管上，施加真空处理1分钟。

成像前，先将样品在溶液中孵育30分钟，然后移除注射器。接着，将七日龄的幼苗浸入25毫摩尔的渥曼腺素（wortmannin）中，施加一分钟真空，随后将浸没的样品孵育30分钟。

在转基因植株中研究ERL1的运输途径发现，经布雷菲德菌素A溶液处理30分钟后，可在称为BFA小体的大型区室中检测到ERL1-YFP。这表明布雷菲德菌素A能够阻断ERL1的运输，提示ERL1存在循环利用或内吞作用。当转基因植株经渥曼青霉素处理30分钟后，ERL1-YFP标记出被称为Wm小体的环状结构。

结果显示ERL1-YFP被转运至多泡体，表明ERL1通过根部途径被运输至液泡进行降解。开始样品制备时，使用锋利的剃须刀片从经药物处理的转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）样品中分离出真叶。将真叶置于载玻片上的一滴水中，背面朝上。

用盖玻片缓慢覆盖真叶，避免产生气泡。成像时，选择514纳米激光用于黄色荧光蛋白（YFPX 引用）的光路设置。通过使用高激光功率以获得高质量图像。

打开 PMT 或 HyD，并根据 YFP 荧光团的光谱设定发射光波段的上限和下限阈值。设置 530 至 570 纳米的检测窗口以收集 YFP 信号。对于第二种颜色的顺序成像，单击 Seq 按钮并添加新通道。

在序列2中，选择555纳米激光用于红色荧光蛋白（RFP）的激发，并设置570至630纳米的检测窗口以收集RFP信号。选择系统上的63x/1.2 W Corr物镜，用于成像保卫细胞前体细胞内的亚细胞膜运输活动。以1024 × 1024像素的图像尺寸开始成像。

然后，根据缩放倍数和物镜设置优化图像分辨率。接着，设置扫描头的扫描速度。初始速度设为400赫兹，并根据样品的具体情况进一步优化该参数。

若要在不更换物镜的情况下放大特定区域，可输入1倍的缩放系数，并根据实验的具体需求进行优化。线平均值是指对每条X线扫描以获得平均结果的次数。观察膜运输事件成像时，可从2次X线平均开始，并根据需要进行优化。

在采集模式中选择 xyt 扫描模式以启用时间序列功能。接着，在时间间隔下选择时间点之间的等待时间。通过选择帧数来定义需要采集的帧数。

使用Z-Stack扫描模式并结合最大强度投影，以获取整个细胞内膜 trafficking 事件的三维信息。然后在采集模式中选择xyz扫描模式，此时Z-Stack功能将可使用。选择Z-Wide选项。

在扫描模式下，使用“开始”和“结束”按钮定义Z轴层扫的顶部和底部图像。接着，通过点击Z轴步进大小来设定Z步进的厚度。要处理图像，请点击共聚焦软件中的主要“处理”选项卡。

在最左侧的“打开项目”选项卡中，选择感兴趣的 Z-Stack 文件。然后，在名为 ProcessTools 的中间选项卡中，选择投影（Projection）功能。在方法的下拉面板中选择“最大值（Maximum）”，然后点击应用（Apply）按钮。

在“打开项目”选项卡下将生成Z轴层扫投影图像。要从时间序列图像生成视频，请在Fiji软件中点击“文件”选项卡，使用“打开”功能按正确顺序逐一打开所有时间序列图像。或者，也可将图像拖放到ImageJ中，以按正确顺序打开数据。

然后，在“图像”选项卡中找到“堆栈”功能，选择“图像堆栈”以生成视频。完成后，以所需的帧速率将文件保存为 avi 格式。在七日龄携带 ERL1 启动子 ERL1-YFP 的转基因植物的真叶中，YFP 信号标记出了一些散在的细胞，其中 ERL1-YFP 标记了细胞质膜。

还观察到多个点状信号，表明 ERL1 也定位于内体。RFP-Ara7 在几乎所有细胞中均显示出多个点状信号，指示这些细胞中的多泡体（MVBs）。当 RFP-Ara7 与 ERL1-YFP 信号合并时，大多数点状信号重叠，表明部分 ERL1-YFP 分子被转运至多泡体中。

携带 ERL1-YFP 和 MVB 标记蛋白 RFP-Ara7 的真叶时间序列显示，YFP 标记的内体在气孔谱系细胞内与 RFP-Ara7 共同移动。这证实了 ERL1-YFP 定位于多泡体中。