Name: 小鼠假体周围关节 白色念珠菌 感染模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: 了解如何使用钛镍丝构建小鼠白色念珠菌生物膜相关假体周围关节感染模型。该模型操作简便、成功率高，为研究PJI的预防和治疗策略提供了重要的实验工具。

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感谢陕西省自然科学基金（项目编号 2021SF-118）和国家自然科学基金（项目编号 81973409、82204631）的资助。

实验动物购自西安交通大学。所有动物实验程序均经西安交通大学机构动物伦理委员会批准（批准编号：SCXK [陕西] 2021-103）。小鼠在实验前饲养一周，每笼5只，可自由摄取食物和饮水。动物在室温（RT；24 °C ± 1 °C）及12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，直至实验开始。
1. 缓冲液与仪器准备
<ol>
	<li>C. albicans 细胞培养
	<ol>
		<li>接种单克隆菌落 白色念珠菌 使用接种环从酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）平板培养基中挑取（SC5314）菌株，接种于5 mL YPD液体培养基（YPD + 50 µg/mL 羧苄青霉素）中。</li>
		<li>振荡 C. albicans 细胞随后在30 °C、220 rpm条件下振荡培养过夜。</li>
		<li>将悬液在400 x g 在室温下孵育5分钟。重悬沉淀物 白色念珠菌 生理盐水中的细胞并稀释细胞浓度&#160;至 1 × 106 通过目视调整浊度至与0.5麦氏标准相当，使细胞浓度为cells/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生理盐水的制备
	<ol>
		<li>称取0.9 g氯化钠，溶于100 mL去离子水中，配制0.9%生理盐水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术器械准备
	<ol>
		<li>使用前将手术器械（剪刀、镊子、止血钳、持针器、缝合针）和钛镍合金丝（直径约0.5 mm）在高压灭菌器中灭菌（121 °C，30 min）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠假体周围感染模型的建立
<ol>
	<li>将30只C57BL/6小鼠（雄性，15-20 g）随机分为3组（每组10只），分别为对照组、空白植入组（植入钛镍丝但不感染C. albicans）和PJI组（植入钛镍丝并感染C. albicans）。</li>
	<li>使用1-4%异氟烷吸入麻醉小鼠，在去除左后肢毛发并用碘液消毒前确认麻醉深度，以翻正反射消失且对足趾刺激无反应为标准。在&#160;麻醉期间，双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥，并在手术及恢复期间补充热量。</li>
	<li>对于对照组小鼠，不进行任何处理，自由饮水和进食。</li>
	<li>对于空白植入组和PJI组小鼠，使用#10刀片或无菌剃刀在每只左后肢膝关节处做一条5 mm的纵向切口，暴露关节。</li>
	<li>将无菌注射器针头（26 G）插入股骨髓腔，制造一个长度为5 mm的孔洞。</li>
	<li>将一根光滑的镍钛合金丝（直径0.5 mm，长度5 mm）插入孔中，随后用剪刀剪断（图1）。</li>
	<li>对于空白植入组小鼠，在逐层缝合伤口前，沿镍钛合金丝滴加2 µL YPD培养基（逐滴加入），使用尼龙缝线（直径0.15 mm）逐层关闭切口。</li>
	<li>对于PJI组小鼠，在逐层缝合伤口前，沿镍钛合金丝向小鼠关节腔内接种C. albicans细胞&#160;（1 × 106 个细胞/mL）2 µL（逐滴加入），使用尼龙缝线逐层关闭切口。</li>
	<li>将小鼠饲养14天，期间自由饮水和进食。皮下注射美洛昔康（4 mg/kg），每24小时一次，持续最多3天。</li>
	<li>14天后，使用3%异氟烷麻醉小鼠，随后通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
</ol>
3. 假体关节感染模型评估
<ol>
	<li>主要器官感染的评估
	<ol>
		<li>处死小鼠后，采集其肾脏、肝脏和脾脏。</li>
		<li>向每种器官中加入 500 µL 无菌生理盐水，在均质器上于&#160;4 °C 条件下研磨组织。</li>
		<li>取步骤 3.1.2 制备的匀浆液 100 µL 接种至 YPD 平板，并用弯头玻璃棒均匀涂布。</li>
		<li>将 YPD 平板倒置于 37 °C 培养箱中培养 48 小时。</li>
		<li>肉眼观察并计数菌落数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察植入物表面的白色念珠菌（C. albicans）及其生物膜
	<ol>
		<li>用剪刀小心剪开小鼠关节处皮肤，随后用镊子取出植入物。</li>
		<li>将植入物浸入 2.5% 戊二醛溶液中，在 4 °C 条件下固定 48 小时。</li>
		<li>用无菌 PBS 冲洗植入物三次，随后将其浸入 1% 锇酸溶液中 3 小时。</li>
		<li>用无菌 PBS 冲洗植入物三次，再依次浸入 50%、70%、80%、90% 和 100% 乙醇溶液中各 15 分钟进行脱水。</li>
		<li>将植入物在叔丁醇中浸泡 30 分钟，重复三次，随后进行冷冻干燥。</li>
		<li>将植入物样品固定于样品台，喷金（镀金层厚度 10 nm），在高真空条件下、1.5 kV 电压下使用扫描电子显微镜（SEM）进行观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>股骨组织的病理学分析
	<ol>
		<li>处死小鼠后，用剪刀采集股骨组织。</li>
		<li>将股骨组织浸入 4% 多聚甲醛溶液中，在 4 °C 条件下固定 48 小时。</li>
		<li>将股骨组织置于 10% 福尔马林溶液中保存 1 周。</li>
		<li>将股骨组织依次浸入 50%、70%、80%、90% 和 100% 乙醇溶液中，各 15 分钟，进行脱水处理。</li>
		<li>将脱水后的股骨组织包埋于石蜡中，使用切片机切成 4 µm 厚的组织切片。</li>
		<li>按照标准方案对股骨切片进行苏木精-伊红染色，随后进行病理学分析21。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Establishing a Mouse Model for Candida albicans Biofilm-Related PJI

<ol><li>Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+pathogenicity+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Candida albicans pathogenicity mechanisms.</a> Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms%3A+antifungal+resistance%2C+immune+evasion%2C+and+emerging+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms: antifungal resistance, immune evasion, and emerging therapeutic strategies.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 60 (5-6), 106673(2022).</li>
<li>Tong, Y., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+and+intestinal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection and intestinal immunity.</a> Microbiological Research. 198, 27-35 (2017).</li>
<li>Kanaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+salivary+protein+flow+and+indigenous+microorganisms+on+initial+colonization+of+Candida+albicans+in+an+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Oral+Health%22%5BJournal%5D)">Effects of salivary protein flow and indigenous microorganisms on initial colonization of Candida albicans in an in vivo model.</a> Bmc Oral Health. 12, 36(2012).</li>
<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms%3A+development%2C+regulation%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li>
<li>Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+biofilms+and+their+role+in+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida biofilms and their role in infection.</a> Trends in Microbiology. 11 (1), 30-36 (2003).</li>
<li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).</li>
<li>Mack, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+medical+device-related+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in medical device-related infection.</a> The International Journal of Artificial Organs. 29 (4), 343-359 (2006).</li>
<li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periprosthetic+joint+infection%3A+A+review+of+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22JBJS+Reviews%22%5BJournal%5D)">Periprosthetic joint infection: A review of antibiotic treatment.</a> JBJS Reviews. 8 (7), e1900224(2020).</li>
<li>Brown, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periprosthetic+joint+infection+with+fungal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Arthroplasty%22%5BJournal%5D)">Periprosthetic joint infection with fungal pathogens.</a> The Journal of Arthroplasty. 33 (8), 2605-2612 (2018).</li>
<li>Kojic, E. M., Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+infections+of+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Candida infections of medical devices.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 255-267 (2004).</li>
<li>Schoof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+periprosthetic+joint+infection+of+the+hip%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedic+Reviews+%28Pavia%29%22%5BJournal%5D)">Fungal periprosthetic joint infection of the hip: a systematic review.</a> Orthopedic Reviews (Pavia). 7 (1), 5748(2015).</li>
<li>Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periprosthetic+joint+infection%3A+current+concepts+and+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22EFORT+Open+Reviews%22%5BJournal%5D)">Periprosthetic joint infection: current concepts and outlook.</a> EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).</li>
<li>Tande, A. J., Patel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosthetic+joint+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Prosthetic joint infection.</a> Clinical Microbiology Reviews. 27 (2), 302-345 (2014).</li>
<li>Stocks, G., Janssen, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+patients+after+implantation+of+an+orthopedic+device%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Infection in patients after implantation of an orthopedic device.</a> ASAIO Journal. 46 (6), S41-S46 (2000).</li>
<li>Shahi, A., Tan, T. L., Chen, A. F., Maltenfort, M. G., Parvizi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-hospital+mortality+in+patients+with+periprosthetic+joint+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Arthroplasty%22%5BJournal%5D)">In-hospital mortality in patients with periprosthetic joint infection.</a> The Journal of Arthroplasty. 32 (3), 948-952 (2017).</li>
<li>Carli, A. V., Ross, F. P., Bhimani, S. J., Nodzo, S. R., Bostrom, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+clinically+representative+model+of+periprosthetic+joint+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery.+American+Volume%22%5BJournal%5D)">Developing a clinically representative model of periprosthetic joint infection.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 98 (19), 1666-1676 (2016).</li>
<li>Stavrakis, A. I., Niska, J. A., Loftin, A. H., Billi, F., Bernthal, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+infection%3A+A+primer+on+animal+models+of+periprosthetic+joint+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Understanding infection: A primer on animal models of periprosthetic joint infection.</a> The Scientific World Journal. 2013, 925906(2013).</li>
<li>Qiao, B., Lv, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+investigation+of+interaction+of+candida+albicans+with+titanium-nickel+implant+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Electrochemical+Science%22%5BJournal%5D)">Electrochemical investigation of interaction of candida albicans with titanium-nickel implant in human saliva.</a> International Journal of Electrochemical Science. 17 (2), 22028(2022).</li>
<li>Oh, Y. R., Ku, H. M., Kim, D., Shin, S. J., Jung, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+Nickel-titanium+ultrasonic+instrument+for+biofilm+removal+in+a+simulated+complex+root+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a Nickel-titanium ultrasonic instrument for biofilm removal in a simulated complex root canal.</a> Materials. 13 (21), 4914(2020).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue Processing and Hematoxylin and Eosin Staining. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeldman%2C+AT+%22Histopathology%3A+Methods+and+Protocols%22">Histopathology: Methods and Protocols</a>. Christina E, D. ay , Springer, New York. 31-43 (2014).</li>
<li>Sinclair, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+development+for+determining+the+efficacy+of+a+combination+coating+for+the+prevention+of+perioperative+device+related+infections%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+-+Part+B+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Model development for determining the efficacy of a combination coating for the prevention of perioperative device related infections: A pilot study.</a> Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 101 (7), 1143-1153 (2013).</li>
<li>Mo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+effects+of+the+combination+of+myricetin+and+miconazole+nitrate+incorporated+to+thermosensitive+hydrogels%2C+on+C.+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo effects of the combination of myricetin and miconazole nitrate incorporated to thermosensitive hydrogels, on C. albicans biofilms.</a> Phytomedicine. 71, 153223(2020).</li>
<li>Zahar, A., Sarungi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+the+infected+total+knee+replacement%3A+a+practical+surgical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of the infected total knee replacement: a practical surgical guide.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 8 (1), 14(2021).</li>
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<li>Karczewski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+periprosthetic+joint+infections+-+risk+factors+and+outcome+between+albicans+and+non-albicans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22International+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Candida periprosthetic joint infections - risk factors and outcome between albicans and non-albicans strains.</a> International Orthopaedics. 46 (3), 449-456 (2022).</li>
<li>Cobo, F., Rodriguez-Granger, J., Sampedro, A., Aliaga-Martinez, L., Navarro-Mari, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+prosthetic+joint+infection.+A+review+of+treatment+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Infection%22%5BJournal%5D)">Candida prosthetic joint infection. A review of treatment methods.</a> Journal of Bone and Joint Infection. 2 (2), 114-121 (2017).</li>
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<li>Vila, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+implications+of+C.+albicans-S.+aureus+mixed+biofilm+in+a+murine+subcutaneous+catheter+model+of+polymicrobial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Therapeutic implications of C. albicans-S. aureus mixed biofilm in a murine subcutaneous catheter model of polymicrobial infection.</a> Virulence. 12 (1), 835-851 (2021).</li>
<li>Nishitani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+natural+history+of+biofilm+formation+in+vivo+during+the+establishment+of+chronic+implant-associated+Staphylococcus+aureus+osteomyelitis+in+mice+to+identify+critical+pathogen+and+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying the natural history of biofilm formation in vivo during the establishment of chronic implant-associated Staphylococcus aureus osteomyelitis in mice to identify critical pathogen and host factors.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (9), 1311-1319 (2015).</li>
<li>Ormsby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+osteocyte-media+ted+bone-matrix+degradation+associated+with+periprosthetic+joint+infection+%28PJI%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Evidence for osteocyte-media ted bone-matrix degradation associated with periprosthetic joint infection (PJI).</a> European Cells & Materials. 42, 264-280 (2021).</li>
<li>Garlito-Díaz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+antifungal-loaded+sol-gel+can+prevent+candida+albicans+prosthetic+joint+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A new antifungal-loaded sol-gel can prevent candida albicans prosthetic joint infection.</a> Antibiotics (Basel). 10 (6), 711(2021).</li>
<li>Harro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+and+rapid+antibody-based+diagnostic+for+chronic+staphylococcus+aureus+infections+based+on+biofilm+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a novel and rapid antibody-based diagnostic for chronic staphylococcus aureus infections based on biofilm antigens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), e01414-e01419 (2020).</li>
</ol>

作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

手术过程中由于手术器械或手术环境受到污染而引起的感染，是大多数植入物相关感染的主要原因24,25,26,27。因此，本研究构建了一种与C. albicans生物膜相关的假体关节感染（PJI）小鼠模型。与传统PJI模型中使用悬浮于生理盐水中的无菌不锈钢颗粒作为植入物的方法不同，本研究采用镍钛合金丝——一种常用的植入材料——以模拟C. albicans、植入材料与骨骼之间的相互作用，更接近临床实际情况。
本文所述的PJI模型能够完美模拟临床中PJI的生理环境。该模型仅可用于研究植入期间的感染，而不能用于研究后期的血源性感染。
C. albicans 可通过两种方式接种。一种是在手术期间直接将 C. albicans 接种至植入部位28，另一种是将植入物在含有 C. albicans 的培养体系中培养一段时间，使其表面形成成熟的生物膜后再进行外科植入29。本研究采用前一种方法，因其可实现病原体接种数量的精确控制，从而最大限度减少组间差异，并对后续治疗效果进行更为客观的评估。此外，前一种方法更符合临床实际情况。
在本方案中，植入物的插入操作较难完成。操作者需反复练习多次，以确保将植入物准确置入关节腔内，而非皮下或肌肉内。此外，白色念珠菌（C. albicans）的接种数量对于假体关节感染模型的可重复性至关重要。应通过涡旋振荡充分混匀白色念珠菌（C. albicans），以确保接种数量的准确性。同时，应沿合金导丝加入白色念珠菌（C. albicans），以模拟临床情况下的感染途径。
细菌感染后7天可检测到生物膜，随后生物膜逐渐增加，并在第14天达到平台期30。因此，在第14天评估所建立的PJI模型是否成功。通过扫描电镜（SEM）观察C. albicans在植入物表面的定植及生物膜的形成情况。通过H&amp;#38;E染色后的病理学分析，评估局部感染所致的植入物周围组织病变。研究表明，假体周围骨溶解是PJI的重要特征之一31。因此，这些指标在评估预防和治疗PJI的干预方法时也至关重要32。
微生物培养常用于临床和实验室中检测微生物感染。因此，本研究对植入物、植入物周围组织、肝脏及其他重要器官进行了微生物培养。对于植入物，采用超声处理以去除黏附在钛镍合金丝表面的C. albicans。随后，通过离心富集C. albicans，再进行微生物培养。然而，培养结果为阴性，与扫描电镜（SEM）结果不一致（图2）。SEM结果显示C. albicans已黏附于钛镍合金丝表面。因此，微生物培养结果为假阴性，可能归因于C. albicans对钛镍合金丝的紧密黏附；超声处理未能成功将C. albicans从植入物表面剥离。同样，对植入物周围组织及其他重要器官的微生物培养结果也为阴性。可能的原因有两个：（1）本研究接种的C. albicans数量仅为2000 CFU，可能过少，不足以在实验期间侵入周围组织或全身系统；（2）从组织中提取和分离病原体的方法敏感性较低。既往发表的研究指出，微生物培养容易出现假阴性结果，可能导致治疗延误33。Grocott-Gomori染色可用于检测骨与关节中菌丝的形成32。此外，增加接种量、延长实验周期或在术前使小鼠处于免疫抑制状态，可能有助于提高检测率32。但需注意，长期感染可能导致深部感染甚至全身性感染。因此，实验周期的设计应根据具体研究目的而定。
总之，本研究成功建立了一个小鼠模型 C. albicans 与生物膜相关的假体关节感染，对于研究其预防和治疗可能具有重要意义 C. albicans 与生物膜相关的种植体周围炎

Candida albicans（C. albicans）可共生存在于人体多个部位1，同时也是最常见的机会性病原真菌，尤其在免疫功能低下患者中可引起危及生命的侵袭性真菌感染2,3。C. albicans 作为一种多形性真菌，可在酵母相和菌丝相之间相互转化。菌丝相具有更高的毒力，对细胞和组织的黏附性及侵袭能力更强4,5。此外，C. albicans 还可在义齿、导管和支架等生物医学材料表面形成生物膜1,6,7。生物膜致密的三维结构限制了抗真菌药物的渗透，同时表达耐药基因，并下调真菌细胞的代谢以抵抗免疫系统的清除作用6,7。因此，与生物膜相关的感染&#160;在临床上极具治疗挑战性8。
Staphylococcus aureus、凝固酶阴性葡萄球菌和肠杆菌是导致PJI的主要病原体9。尽管真菌性PJI的发病率相对较低（约1%）10，但与细菌性PJI相比，其治疗费用更高11，治疗周期更长11，且治疗成功率更低10。近年来，真菌性PJI的发病率逐年上升10。念珠菌性PJI占真菌性PJI的77%–84%10,12，其中C. albicans是最常见的念珠菌种类（占54%）。因此，有必要对真菌性PJI进行深入研究。
目前，假体关节感染（PJI）的治疗采用翻修手术，包括以下步骤：（1）移除受感染的植入物，（2）清创，（3）抗菌治疗，以及（4）重新植入假体。在彻底清创后，植入含抗生素的骨水泥，并对患者进行全身性抗生素治疗，持续超过6周，以在植入新假体前有效控制感染13。然而，该方法无法完全清除组织中的病原体，且长期使用抗菌治疗处理的复发性感染极易导致耐药菌株的产生14,15,16。
建立PJI的动物模型对于研发PJI的新药或治疗方法至关重要。在PJI的发展过程中，假体周围会形成较大的死腔，导致血肿形成，进而阻断周围组织的血液供应，并削弱抗生素的疗效11,15。由于难以模拟假体周围的微环境，传统的动物模型无法准确再现PJI的实际状况17,18。
本研究通过使用临床上广泛应用的钛镍丝模拟关节植入物，构建了一种小鼠C. albicans生物膜相关性人工关节感染（PJI）模型19,20。该PJI模型具有操作简便、成功率高、重复性好以及与临床相关性强等优点，有望成为研究C. albicans生物膜相关性人工关节感染预防与治疗的重要模型。

<table><tbody><tr><td>0.5 Mactutrius turbidibris</td><td>上海路径科技有限公司</td><td>5106063</td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C 冰箱</td><td>伊莱克斯（中国）电器有限公司</td><td>ESE6539TA</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>北京奥博星生物技术有限责任公司</td><td>01-001</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>岛津</td><td>ATX124</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>三洋</td><td>MLS-3750</td><td></td></tr><tr><td>羧苄西林</td><td>Amresco</td><td>C0885</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ci 尼康 upright 光学显微镜&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td>Eclipse Ts2-FL</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>麦克林&amp;nbsp;</td><td>D823520</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>251586</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>RWD</td><td>20210103</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>西安京西双和制药有限公司</td><td>20180108</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>碧云天生物技术</td><td>P0099</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>北京奥博星生物技术有限责任公司</td><td>01-001</td><td></td></tr><tr><td>RWD R550 多通道小动物麻醉机&amp;nbsp;</td><td>RWD</td><td>R550</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>日立</td><td>TM-1000</td><td></td></tr><tr><td>恒温培养箱</td><td>上海智楚仪器有限公司</td><td>ZQTY-50N</td><td></td></tr><tr><td>超纯水机</td><td>Heal Force</td><td>NW20VF</td><td></td></tr><tr><td>超声波仪</td><td>Do-Chrom</td><td>DS10260D</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;Oxoid</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠假体周围candida albicans感染模型

A Periprosthetic Joint Candida albicans Infection Model in Mouse

假体周围关节感染（PJI）是Candida albicans（C. albicans）引起的一种常见感染，日益引起外科医生和科学家的关注。通常，C. albicans会在感染部位形成生物膜，从而使其免受抗生素和免疫清除的影响。目前治疗PJI的金标准是手术干预，包括移除感染假体、清创、抗微生物治疗以及假体再植入。因此，建立动物PJI模型对于研发针对PJI的新药或治疗方法具有重要意义。本研究中，在将C. albicans沿导丝接种至关节腔之前，先将一根表面光滑的镍钛合金丝（骨科临床广泛应用的一种植入物）插入C57BL/6小鼠的股骨关节内。14天后，通过扫描电子显微镜（SEM）观察到植入物表面已形成成熟且厚实的生物膜。感染关节组织标本的H&amp;E染色显示骨小梁显著减少。综上所述，本研究成功建立了一种操作简便、成功率高、重复性好且临床相关性强的小鼠PJI模型。该模型有望成为研究C. albicans生物膜相关PJI预防的重要临床前模型。

将样本接种至平板培养基，经 overnight 培养后计数菌落，是评估病灶局部病原负荷的常用方法22,23。在本研究中，肝脏、肾脏和脾脏样本的微生物培养结果均为阴性，表明本研究所建立的模型仅导致小鼠局部感染，而未引起全身性感染23。
空白植入组中，镍钛合金丝表面未见白色念珠菌（C. albicans）黏附或定植；而PJI组镍钛合金丝表面可见成熟且厚实的生物膜，表明术后14天小鼠体内成功构建了与C. albicans生物膜相关的假体关节感染（PJI）模型。图2展示了植入物的扫描电镜图像23。
H&amp;股骨组织的E染色结果如图所示 图3对照组中可见清晰完整的骨小梁结构，而空白植入组的股骨组织中可见少量骨小梁组织缺损。图3，黄色箭头）。在PJI组中，骨小梁数量显著减少23这些结果表明 C. albicans 小鼠生物膜相关性PJI模型成功建立，并伴有明显的股骨组织病理损伤。
<img alt="啮齿类动物肿瘤研究，肿瘤切除手术，切除后肿瘤组织的特写，实验室研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65263/65263fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：植入手术示意图。 左侧图中的红色方框标示了手术部位，即光滑的镍钛合金丝插入的位置。右侧图显示了带有镍丝的部分股骨（红圈所示）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65263/65263fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="植入物表面的扫描电镜图像，放大倍数分别为1000倍和5000倍，显示表面纹理差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65263/65263fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：空白组与PJI组植入物表面的扫描电镜图像。 放大倍数1000×（比例尺 = 500 µm）和5000×（比例尺 = 100 µm）的图像作为代表性结果展示。本图经Mo等23许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65263/65263fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="骨组织病理学比较：空白植入物组、PJI组、对照组；200× 和 400× 放大倍数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65263/65263fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：股骨组织的H&amp;E染色结果。图中展示了植入物组、PJI模型组和对照组典型的H&amp;E染色图像。对照组显示出清晰且完整的骨小梁结构。空白植入物组股骨组织中可见少量骨小梁组织缺损（黄色箭头所示）。然而，PJI组中骨小梁数量明显减少。图中所示放大倍数分别为200×（比例尺 = 150 µm）和400×（比例尺 = 75 µm）。本图经Mo等23许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65263/65263fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>

由危险病原体引起的假体周围关节感染（PJI）在临床骨科中较为常见。现有的动物模型无法准确模拟PJI的实际状况。本文中，我们建立了一种与白色念珠菌（Candida albicans）生物膜相关的PJI小鼠模型，用于研究和开发针对PJI的新疗法。

小鼠假体周围Candida albicans感染模型

人工关节周围感染（PJI）是白色念珠菌（C. albicans）引起的常见感染之一，正日益引起外科医生的关注和……

本研究针对白色念珠菌生物膜相关性人工关节周围感染，采用常用于模拟关节植入物的镍钛丝，在小鼠体内构建了白色念珠菌感染模型。该人工关节感染（PJI）模型操作简便、成功率高，且具有良好的临床相关性，将有助于深入理解白色念珠菌生物膜相关性PJI的预防与治疗。由于周围环境复杂，传统的动物模型无法准确模拟假体关节感染（PJI）的实际状况。白色念珠菌生物膜相关的小鼠PJI模型可弥补这一研究空白。建立PJI动物模型对于PJI相关研究以及新药或治疗方法的开发至关重要。本文建立的白色念珠菌生物膜相关小鼠假体关节感染（PJI）模型，有望成为预防和治疗白色念珠菌生物膜相关PJI的重要模型。首先，用接种环从YPD平板上挑取一株白色念珠菌单克隆菌落。将该菌落转移至5毫升YPD液体培养基中，培养基中添加50微克/毫升羧苄西林。将细胞在30摄氏度下以220 RPM的恒定速度振荡过夜。然后在室温下以400 × g离心细胞悬液5分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于生理盐水溶液中，并通过将细胞悬液的浊度与0.5麦氏标准比浊管匹配来调整细胞浓度。制备0.9%生理盐水溶液时，称取0.9克氯化钠，溶于100毫升去离子水中。接下来，将手术器械和镍钛合金丝在使用前于121摄氏度下高压灭菌30分钟。然后将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、空白植入组和PGI组。麻醉小鼠后，去除左后肢的毛发，并用碘对剃毛区域进行消毒。通过观察翻正反射消失来确认麻醉深度。对于对照组的小鼠，不给予任何处理。对于空白植入物组和PGI组的小鼠，使用10号刀片在左后肢膝部做一条5毫米的纵向切口，以暴露关节进行后续操作。随后，插入无菌注射器针头，在股骨髓腔内钻出一个5毫米长的孔。小心将一根镍钛合金丝插入孔中，然后用剪刀将其剪断。然后，对于空白植入组的小鼠，将2 µL YPD培养基沿镍钛合金丝逐滴注入。使用尼龙缝线逐层缝合伤口。接着，在假体关节感染组中，将2 µL白色念珠菌细胞沿镍钛合金丝接种至小鼠关节腔内。使用尼龙缝线逐层缝合伤口。将小鼠饲养在可自由获取水和食物的环境中，持续14天。首先，建立白色念珠菌生物膜相关假体关节感染（PJI）小鼠模型。模型建立14天后，处死小鼠并取其肾脏、肝脏和脾脏。对每个器官加入500 µL无菌生理盐水，在4 °C条件下使用匀浆机研磨组织。然后取100微升制备好的匀浆液加入YPD平板中，用弯头玻璃涂布棒将其均匀涂布。将YPD平板倒置于37摄氏度培养箱中培养48小时。培养结束后，肉眼观察平板并计数可见的菌落。

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