Name: 使用电穿孔Cas9-sgRNA复合物对原代骨髓来源的巨噬细胞进行高效基因破坏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: 了解利用电穿孔技术将Cas9-sgRNA复合物递送至原代骨髓来源巨噬细胞的高效基因编辑方法。该技术无需克隆即可实现快速遗传操作，适用于免疫学研究。

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本工作由NIH资助项目5R01AI144149资助。示意图使用BioRender绘制。

1. sgRNA 设计
注意：此步骤描述了靶序列的选择和sgRNA的设计。建议设计位于首个大编码外显子中的向导序列，以便在开放阅读框的早期中断任何翻译出的蛋白质。同时建议选择位于同一外显子内的靶序列，这将简化编辑效率的分析（步骤6）。本实验方案提供的基因组编辑示例中，使用的sgRNA靶向小鼠基因组中Src基因和Cblb基因的第一个外显子，以及非编码的Rosa26位点。
<ol>
	<li>使用多种免费的在线设计工具之一，确定要靶向的20个核苷酸基因组序列表1选择每个基因内不重叠的四到五个向导RNA，因为Cas9的活性随所选向导RNA的不同而有所差异， 先验的 无法预测高活性的向导序列。 
	注意：确保向导序列相对于靶向位点序列的正确方向至关重要。设计工具通常以 5' 到 3' 方向提供向导序列，而不论其靶向的是哪一条染色体链。为验证链的方向，请检查是否存在原间隔序列邻近基序（PAM）序列 S. pyogenes Cas9（nGG）位于靶向基因组序列的紧邻3'端。sgRNA序列不包含PAM。</li>
</ol>
2. sgRNA 合成
注意：此步骤描述了如何通过 PCR 扩增合成 sgRNA，以生成用于后续实验的模板 体外 体外转录（IVT），然后使用离心柱纯化sgRNA（图1A）。定制合成的sgRNA可通过多家供应商商业购得，可作为PCR/IVT的替代方案。
<ol>
	<li>通过PCR扩增生成用于T7 RNA聚合酶的体外转录（IVT）模板。PCR反应使用包含T7 RNA聚合酶启动子和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）序列的通用引物（表2），同时加入含有基因特异性向导序列的短特异性引物。
	<ol>
		<li>此为非扩增性重叠延伸步骤。将PCR缓冲液稀释至1×，并额外添加1 mM MgCl2。然后，在总体积为46 µL的反应体系中加入0.25 µL高保真DNA聚合酶、0.5 mM脱氧核苷三磷酸（dNTP）、0.02 mM向导序列特异性引物和0.02 mM T7反向长通用引物（表2）。将反应管放入热循环仪中，运行两个循环：95 °C变性15秒，37 °C退火15秒，72 °C延伸15秒。反应结束后将样品置于冰上冷却。</li>
		<li>此为PCR扩增步骤。向每个反应体系中加入2 µL 25 mM正向扩增引物和2 µL 25 mM反向扩增引物，最终反应体积为50 µL。在95 °C下变性30秒，随后进行35个循环：95 °C 15秒，65 °C 20秒，72 °C 15秒。最后在72 °C下额外延伸2分钟。</li>
		<li>在2%琼脂糖凝胶上检测PCR产物。重叠延伸PCR应产生一个长度为127 bp的双链DNA分子，其结构为：T7启动子位于基因特异性的20个核苷酸向导序列上游，tracrRNA序列紧接其下游（图1B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>IVT模板纯化：有多种可行的实验方案和试剂盒可用于此步骤。本方案采用固相可逆固定化（SPRI）磁珠法。将50 µL PCR产物与90 µL磁珠混合，并按照试剂盒说明书操作。通过加入40 µL洗脱缓冲液（5 mM Tris，0.1 mM乙二胺四乙酸[EDTA]）并在65 °C加热5分钟完成DNA洗脱。</li>
	<li>使用260 nm波长下的吸光度测定IVT模板的DNA浓度。IVT反应需要至少50 ng/µL的DNA浓度。IVT模板可保存于-20 °C。</li>
	<li>体外转录（IVT）反应
	<ol>
		<li>使用专为高效体外转录设计的商业试剂盒（见材料表），并遵循制造商推荐的操作流程进行IVT反应。在20 µL反应体系中加入250 ng IVT模板，在37 °C孵育4–16小时。</li>
		<li>取1 µL反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳检测sgRNA的IVT产物。应观察到一条明亮的RNA条带，其迁移位置与70 bp双链DNA相近（图1C）。尽管非必需，但为获得更清晰且分辨度更高的条带，建议使用含尿素的RNA上样缓冲液，并在上样前于65 °C变性5分钟。 
		注意：由于不同向导RNA的二级结构差异，部分样本可能出现微弱的高分子量条带或轻微的迁移差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对sgRNA的IVT产物进行去磷酸化处理，以减少RIG-I（一种外源RNA感受器）的激活，从而降低电穿孔后的细胞死亡。针对每20 µL IVT反应产物，加入69 µL分子生物学级水和15 U小牛肠碱性磷酸酶（CIP），溶于1× CIP缓冲液中，在37 °C孵育2小时。</li>
	<li>降解IVT模板以减少细胞内DNA感受器的激活，避免电穿孔后引发细胞死亡。向每个IVT反应体系中加入2 U无RNase的DNase，在37 °C孵育15分钟。IVT产物可在-20 °C保存1天，或在-80 °C保存数月。</li>
	<li>使用离心柱法纯化IVT产物。此步骤中，SPRI磁珠纯化试剂盒效果较差。
	<ol>
		<li>向IVT产物中加入220 µL结合缓冲液，再加入1 mL 100%分子生物学级乙醇，充分混匀后上柱。随后按照制造商说明书操作。最后的洗涤步骤应在层流生物安全柜中进行，以避免sgRNA污染。</li>
		<li>洗脱步骤也应在层流罩内完成，以防污染。使用30 µL无菌的10 mM Tris缓冲液（pH 8.0）进行RNA洗脱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过测定260 nm波长处的吸光度来确定sgRNA的浓度。 
	注意：典型的sgRNA产量至少为100 µg。</li>
	<li>将sgRNA储存于-80 °C。分装保存，避免经历超过三次的冻融循环。</li>
</ol>
3. 电穿孔的准备工作
注意：所有步骤均应在层流罩中进行，以避免污染。本方案使用市售的电穿孔系统（见材料表），并配备 10 µL 吸头。
<ol>
	<li>使用前 48–72 小时解冻 BMDM，并在非组织培养（TC）处理的培养板上进行扩增。 
	注意：每反应需要 4 × 105 个细胞。</li>
	<li>对用于反应体系构建的 PCR 管进行灭菌。每个反应准备一支 PCR 管，在热循环仪中于 98 °C 加热 10 分钟。可批量处理并密封保存。使用前将灭菌后的 PCR 管置于冰上。</li>
	<li>用 70% 乙醇清洁电转工作站，并将其放入超净工作台中。设置参数为 1,900 V、20 ms，单次脉冲。</li>
	<li>小心从包装中取出一支转染管，保持无菌状态，并加入 3 mL &#34;E&#34; 缓冲液。确保 E 缓冲液在电穿孔前已恢复至室温。将转染管插入工作站，并向下按压直至发出咔嗒声。</li>
	<li>每个反应中加入 2.5 µL 浓度为 1,100 ng/µL 的 sgRNA。用含 0.9 mM CaCl2 和 0.5 mM MgCl2 的冷磷酸盐缓冲液（PBS + Ca/Mg）稀释 sgRNA。置于冰上备用。</li>
	<li>准备两块培养板：一块 12 孔未包被板用于培养细胞，另一块 24 孔板用于盛放培养基。将每反应 1.5 mL 无抗生素培养基分装至 24 孔板的各孔中。</li>
	<li>准备 Cas9 蛋白。目前有多种商业或学术来源可提供无菌纯化的 Cas9 蛋白。用冷的 PBS + Ca/Mg 将 Cas9 稀释至终浓度为 20 µM。每个电穿孔反应向无菌 PCR 管中分装 1 µL 20 µM Cas9。置于冰上备用。</li>
	<li>准备用于电穿孔的细胞。
	<ol>
		<li>移除生长培养基。使用不含 CaCl2 和 MgCl2 的 PBS（PBS-Ca/Mg）洗涤细胞，以去除促进贴壁的血清和二价阳离子。然后加入含 1 mM EDTA 的 PBS，室温孵育约 5 分钟，直至细胞开始脱落。</li>
		<li>轻柔吹打使细胞脱落。将细胞转移至低蛋白吸附的 15 mL 离心管中，在 500 × g 条件下离心 5 分钟收集细胞。 
		注意：巨噬细胞易贴附于塑料器皿。使用低蛋白吸附离心管可显著提高细胞回收率。</li>
		<li>操作应迅速，避免细胞在 PBS + EDTA 中长时间孵育。吸除大部分上清液，保留约 1 mL 上清液。用残留的上清液重悬细胞，然后转移至低蛋白吸附的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		<li>取少量细胞用于计数。将剩余细胞在室温下以 500 × g 离心 5 分钟收集。</li>
		<li>离心期间进行细胞计数，并将 Cas9 和 sgRNA 管恢复至室温。</li>
		<li>完全吸除细胞沉淀中的上清液。用 PBS + Ca/Mg 将细胞重悬至浓度为 4 × 107 个细胞/mL（每 10 µL 反应含 4 × 105 个细胞）。 
		注意：每个试剂盒提供的电穿孔缓冲液（Buffer R、Buffer T）量有限。但我们发现，使用 PBS + Ca/Mg 的电穿孔效率与专用缓冲液相当。</li>
		<li>当对不同基因的 sgRNA 进行电穿孔时，应将细胞分装至不同的低蛋白吸附管中，以避免不同 sgRNA 之间的交叉污染。细胞在电穿孔前保持室温。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. RNP 复合物组装
<ol>
	<li>将sgRNA和Cas9置于室温下，以避免沉淀。在无菌PCR管中，将2.5 µL sgRNA加入1 µL稀释后的Cas9中。缓慢加入sgRNA，持续约15秒，并同时混匀，以防止沉淀产生。</li>
	<li>在室温下孵育5分钟，以促进RNP复合物的形成。</li>
</ol>
5. 通过电穿孔递送RNP
<ol>
	<li>准备电穿孔枪头（比色皿）。按下活塞以伸出杆部，将杆部插入枪头中。 
	注意：确保枪头安装牢固，且活塞滑动顺畅并伸出枪头套管之外。若枪头未正确安装，可能在枪头内引入气泡，导致枪头失效。</li>
	<li>通过反复吹打重悬细胞，然后将细胞加入电穿孔枪头中。吸取枪头全部10 µL体积容量，避免产生气泡。</li>
	<li>从阴性对照sgRNA开始，将电穿孔枪头中的10 µL细胞转移至含有3.5 µL RNP（来自步骤4）的样本管中。上下吹打三次以充分混匀。再将10 µL混合液重新吸入枪头中，确保无气泡存在。</li>
	<li>将枪头放入电穿孔仪中，缓慢浸入缓冲液。避免枪头接触塑料表面以保持无菌状态。按下触摸屏上的开始按钮。</li>
	<li>完成后，屏幕将显示脉冲成功。从仪器中取出移液枪，并将细胞放入已标记的未包被12孔板的干燥孔中。</li>
	<li>用15 mL PBS + Ca/Mg反复吹打两次清洗枪头。将带有枪头的移液枪暂放一旁，确保枪头不接触任何物体并保持无菌。 
	注意：在许多实验中，可在多个样本间重复使用同一枪头，例如在使用无活性的阴性对照sgRNA样本后，或在初步评估向导RNA活性时（每基因测试四至五个sgRNA，且唯一读数为编辑效率）。然而，在对编辑后的细胞进行功能分析时，建议每个基因使用新的枪头，因为微量的sgRNA或细胞残留可能影响实验结果。</li>
	<li>立即向细胞中加入1 mL不含抗生素的培养基（已在步骤3.6中分装），并轻轻振荡培养板以混匀。</li>
	<li>对剩余反应重复步骤5.2–5.6。</li>
	<li>将细胞放回培养箱中继续培养。</li>
	<li>电穿孔后1–2小时检查细胞活力。细胞贴壁率应&#62;90%。可选：若不影响后续实验，可在电穿孔后1–2小时向细胞中添加庆大霉素（5 µg/mL），以帮助防止污染。</li>
</ol>
6. 评估编辑效率
注意：大多数编辑在 48 小时后完成。
<ol>
	<li>电穿孔后 48 小时检查细胞单层。如果细胞融合度超过 50%，则继续后续操作。如果细胞融合度&#60;50%，则额外等待 1–2 天。进行基因组 DNA 分析以确定编辑效率需要 1 × 105 个细胞，此外还需保留用于下游实验的细胞。</li>
	<li>制备基因组 DNA（gDNA）。
	<ol>
		<li>用不含 Ca/Mg 的 PBS 洗涤细胞。加入 1 mL PBS + 1 mM EDTA。室温孵育约 5 分钟，直至细胞开始从培养皿脱落。</li>
		<li>通过移液使细胞脱落，转移至低蛋白吸附的微量离心管中。</li>
		<li>计数细胞，并取出含 1 × 105 个细胞的等分试样。剩余细胞可重新接种用于后续实验。通常在电穿孔后第 5 天进行实验，以便目标蛋白充分降解。</li>
		<li>在微量离心管中以最大转速离心 15 秒，收集用于 gDNA 分析的细胞沉淀。</li>
		<li>将沉淀重悬于 50 µL 裂解缓冲液中。涡旋振荡以去除附着在管壁上的细胞，然后在 98 °C 加热 10 分钟，以裂解细胞并灭活内源性 DNase。</li>
		<li>将离心管置于冰上。</li>
		<li>加入 1 µL&#160;蛋白酶 K（20 mg/mL）。在 37 °C 孵育至少 1 小时；为方便起见，也可过夜孵育。</li>
		<li>在 98 °C 加热 10 分钟以灭活蛋白酶 K。</li>
		<li>室温下以最大转速离心 5 分钟。小心移取上清液，其中含有 DNA。该粗提物无需进一步纯化，即可满足大多数 PCR 反应的需求。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 Sanger 测序评估编辑效率。
	<ol>
		<li>设计 PCR 引物，使其位于最靠近 5' 端的向导序列上游 200–300 bp 处，以及最靠近 3' 端的向导序列下游 200–300 bp 处。典型扩增片段大小约为 500 bp。设计嵌套测序引物，使其距离最近的向导序列至少 125 bp（图 2A）。</li>
		<li>使用 2 µL gDNA 进行 PCR 扩增。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于测序的 PCR 产物。本方案采用外切酶 I/虾碱性磷酸酶（ExoI/SAP）处理。商业化的 DNA 纯化试剂盒也可使用，但需要更多手动操作时间。
	<ol>
		<li>准备 15 µL PCR 产物。加入 7.5 µL 水、1 µL 10× ExoI 缓冲液、10 U ExoI 和 1 U SAP，以降解干扰 Sanger 测序的 dNTP 和引物。</li>
		<li>在 37 °C 孵育 30 分钟，随后在 85 °C 孵育 20 分钟以灭活酶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对经 Exo/SAP 处理的 PCR 产物进行 Sanger 测序；使用已知量的 DNA 分子量标记物来估计样品中 PCR 产物的大小。测序反应可能需要优化，因为 TIDE 软件需要高质量的测序色谱图才能准确估算编辑效率。未编辑位点的测序色谱图应显示清晰的峰型且背景信号极低（图 2B、C）。</li>
	<li>使用 TIDE 软件分析编辑后的 gDNA 与未编辑对照 gDNA 的 Sanger 测序色谱图文件，以估算编辑效率（表 1，图 2）。上传 Sanger 测序文件，并使用默认设置运行软件。</li>
</ol>

A Guide to Precise Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用电穿孔法递送Cas9-sgRNA复合物进行基因组编辑，可有效破坏BMDM中的基因功能。编辑效率因靶序列和基因的不同而有所差异。通常需要筛选四到五个sgRNA，以确定一个高效活性的sgRNA。某些基因位点的编辑效率较低，最可能的原因是染色质结构的影响。在这些情况下，可通过多种优化手段提高编辑效率。对同一外显子共递送两个高效sgRNA，可提升部分基因的编辑效果。然而，当两个向导RNA共转染时，我们发现TIDE分析可能会失去准确性。因此，可能需要采用其他方法（如蛋白质印迹法）来评估编辑效果。此外，加入 commercially available 的NHEJ增强剂通常可使编辑效率提高约20%（图3）。
这种方法具有多个优势。将sgRNA-Cas9直接递送至细胞，无需耗时的质粒构建或慢病毒载体生产步骤即可转导BMDM。合成sgRNA、电穿孔及生成突变细胞的过程可在1周内完成。该技术还可与来自基因修饰小鼠的BMDM联合使用，以生成双突变细胞。尽管已有化学方法可用于将siRNA或mRNA转染入原代免疫细胞<sup class="x...

巨噬细胞是天然免疫细胞，在组织修复和免疫中发挥关键作用1,2永生化巨噬细胞系，例如小鼠 RAW 264.7 细胞或人 THP-1 细胞，具有多种优势特性，包括生长 robust、易于通过递送 RNA 干扰或 CRISPR/Cas9 的载体实现基因敲除3,4然而，癌基因转化会显著改变细胞的生理状态，导致某些信号通路异常激活，而其他通路的响应则受到抑制5,6原代骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）更真实地模拟 体内 巨噬细胞生理学, 但由于质粒转染和病毒转导在这类原代免疫细胞中的效率均较低，对其进行遗传操作仍然具有挑战性7,8因此，需要更高效的方法来破坏基因功能。
CRISPR/Cas9基因组编辑是在包括哺乳动物细胞在内的多种生物系统中进行遗传操作的强大工具9,10,11,12。该 Streptococcus pyogenes Cas9蛋白在与序列特异性的引导RNA形成复合物时，能够高效且特异性地切割双链DNA。通过非同源末端连接（NHEJ）修复被切割的DNA，会产生小片段的插入或缺失（indels），从而导致移码突变。在早期研究中，Cas9和sgRNA通过质粒或慢病毒载体递送，这些方法对多种细胞系均具有良好的转染效率。9,10然而，原代细胞尤其是原代免疫细胞通常对这些方法不敏感，原因是转染或转导介导的载体递送效率较低。因此，研究人员已开发出生成sgRNA-Cas9复合物的方法 体外 并递送它们 通过 电穿孔，这些方法在多种细胞类型中已实现高效率13,14结果表明，该方法有望用于原代巨噬细胞的基因组编辑。
本文提供了一种利用sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）在原代骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中进行基因组编辑的实验方案。该方案包含一系列步骤，可有效抑制原代免疫细胞中免疫感受器的激活，实现高达95%的靶向位点编辑效率，同时细胞毒性极低。本方案还包括利用常规聚合酶链式反应（PCR）和Sanger测序评估编辑效率的工作流程，随后通过经过充分验证的在线分析工具——基于分解法追踪插入缺失（TIDE）15进行in silico分析。

<table><tbody><tr><td>3T3-MCSF 细胞系</td><td>Russell Vance 惠赠</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R Cas9 电穿孔增强剂</td><td>IDT</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP 纯化磁珠</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>小牛肠道碱性磷酸酶</td><td>NEB</td><td>M0525S</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DPBS +Ca/Mg（0.9 mM CaCl₂ 和 0.5 mM MgCl₂）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS -Ca/Mg</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>ExoI</td><td>NEB</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>康宁</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Herculase DNA聚合酶 &amp;缓冲液</td><td>安捷伦</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒</td><td>NEB</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>LoBind 锥形管 15 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122216</td><td></td></tr><tr><td>LoBind Eppendorf 离心管 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer r2.1</td><td>NEB</td><td>B6002S</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MPK5000、MPP100、MPS100</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统 10 µL 吸头</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MPK1025 或 MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 1 mM EDTA</td><td>Lonza</td><td>BE02017F</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart 缓冲液（用于 ExoI）</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EO0384</td><td></td></tr><tr><td>RNA上样染料</td><td>NEB</td><td>B0363S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9-NLS</td><td>加州大学宏实验室</td><td>不适用</td><td>非加州大学研究人员可通过以下途径获取&amp;nbsp; https://qb3.berkeley.edu</td></tr><tr><td>化脓性链球菌Cas9-NLS，经修饰的第三代</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>SAP</td><td>NEB</td><td>M0371S</td><td></td></tr></tbody></table>

利用电穿孔递送cas9-sgrna复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）是研究组织巨噬细胞复杂生物学特性的重要工具。作为原代细胞，它们可模拟巨噬细胞的生理状态 体内 相较于永生化巨噬细胞系，原代骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）更接近天然状态，且可来源于已携带特定遗传修饰的小鼠。然而，在BMDMs中实现基因功能敲除在技术上仍具挑战性。本文提供了一种高效的CRISPR/Cas9基因组编辑方案，适用于BMDMs，可引入小片段插入或缺失（indels），导致移码突变，从而破坏目标基因功能。该方案详细描述了单导向RNA（sgRNA-Cas9）的合成方法，以及纯化sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）的制备流程，并通过电穿孔实现RNP递送。同时，方案中包含一种高效检测编辑效率的方法，结合常规Sanger测序及一款免费在线分析工具进行结果评估。本方案可在1周内完成，无需质粒构建，通常可达到85%至95%的编辑效率。

体外转录（IVT）模板是一个127 bp的PCR产物（图1B）。全长IVT产物为98 nt的RNA，其迁移速度与70 bp的双链DNA片段相似（图1C）。
电穿孔后，细胞应 &gt;90% 存活率，总细胞数为 &gt;起始细胞数量的70%。所获得的突变细胞群体应包含多种多样的插入缺失（indel），且这些突变起始于Cas9切割位点附近。通过PCR和Sanger测序对靶基因进行分析时，应在Cas9切割位点下游的每个位置均观察到多个不同的核苷酸图2).
<img alt="CRISPR sgRNA合成与递送流程图及凝胶电泳结果；DNA编辑过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65264/65264fig01.jpg" d...

本方案描述了利用组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物对小鼠骨髓来源巨噬细胞进行基因组编辑的操作步骤 体外 并通过电穿孔递送。

利用电穿孔递送Cas9-sgRNA复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）是研究组织巨噬细胞复杂生物学特性的重要工具。作为原代细胞，它们可模拟……

本实验室研究结核分枝杆菌与宿主免疫系统之间的相互作用，重点关注细菌与巨噬细胞之间的初始相互作用。在巨噬细胞中已采用多种基因敲除技术，包括RNA干扰技术与CRISPR技术。其中主要挑战之一在于巨噬细胞中基因敲除效率较低。本方案能够实现对原代巨噬细胞进行快速且高效的遗传操作，无需进行克隆和质粒构建。这些方法在免疫学研究中具有广泛适用性，可使研究人员在原代巨噬细胞中敲除基因，用于多种多样的研究。首先，将放置在超净工作台中的移液工作站参数设置为1,900伏、20毫秒，单次电脉冲。小心地从包装中取出一支转染管，以保持其无菌状态，并加入 3 毫升 E 缓冲液。为准备电穿孔，从细胞中移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞，以去除促进贴壁的血清和二价阳离子。随后，向细胞中加入 PBS 与 1 毫摩尔 EDTA 的混合液，在室温下孵育约 5 分钟，直至细胞开始脱落。轻轻吹打混匀以悬浮细胞，并将细胞转移至一个低蛋白结合力的15毫升离心管中。在500 ×g下离心5分钟，使细胞沉淀。离心后迅速移除大部分上清液，保留约1毫升上清液在管中。将细胞重悬于剩余的上清液中，并转移至低蛋白吸附的1.5毫升微量离心管中。取少量细胞样品用于计数，其余细胞在室温下以500×g离心5分钟，收集细胞沉淀。在离心过程中进行细胞计数。取1× sgRNA和20毫摩尔的Cas9溶液，将管子 warming 至室温。离心后，移除细胞沉淀中的全部上清液，并用含有氯化钙和氯化镁的PBS重悬细胞，细胞浓度为每毫升4000万个。对于sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物的组装，将2.5微升sgRNA加入含1微升稀释Cas9的无菌PCR管中，边缓慢加入sgRNA边混匀约15秒，以防止沉淀产生。室温孵育5分钟，以促进核糖核蛋白复合物的形成。通过电穿孔递送核糖核蛋白复合物时，先按下电穿孔枪头的推杆以伸出杆部，然后将杆部插入枪头中。通过上下吹打重悬细胞。用细胞悬液充满电穿孔尖端，并吸取尖端全部10微升体积容量。从阴性对照sgRNA开始，将电穿孔尖端中的10微升细胞转移至含有3.5微升核糖核蛋白的样品管中。上下吹打三次以充分混匀，并将10微升混合液重新吸入枪头中。将枪头放入电穿孔仪的电转站，插入缓冲液中，然后按下触摸屏显示器上的“开始”按钮。电转完成后，显示器将提示电击脉冲成功。从仪器上取下移液器，将细胞放入未包被的12孔板的干燥孔中。用含有氯化钙和氯化镁的15毫升PBS溶液，上下吹打两次以冲洗枪头。将仍连接着枪头的移液器放置一旁备用。立即将之前分装好的1毫升不含抗生素的培养基加入细胞中，并轻轻摇动培养板以混匀。此处展示的是用对照性非靶向sgRNA、Cas9核糖核蛋白复合物、靶向Rosa 26位点的sgRNA以及Src和Cblb基因进行电穿孔修饰后，从小鼠骨髓来源巨噬细胞中获得的Rosa 26位点的代表性Sanger测序色谱图。通过PCR和Sanger测序对靶基因进行分析，结果显示在Cas9切割位点下游的每个位置均出现多个核苷酸。这些结果验证了多个靶向基因均达到了高编辑效率。

high-efficiency-gene-disruption-primary-bone-marrow-derived

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用电穿孔Cas9-sgRNA复合物对原代骨髓来源的巨噬细胞进行高效基因破坏

利用CRISPR/Cas9进行靶向基因编辑极大地促进了对基因生物学功能的理解。在此，我们采用CRISPR/Cas9技术在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

在此，我们介绍一种利用基因修饰技术改造原代或扩增的人自然杀伤（NK）细胞的实验方案 Cas9 核糖核蛋白复合物 (Cas9/RNPs)。通过使用本方案，我们获得了人类自然杀伤细胞中特定基因缺陷的 转化生长因子-β受体2 （TGFBR2）和 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1...

利用Cas9核糖核蛋白生成敲除型原代及扩增人自然杀伤细胞

本文介绍了一种在墨西哥钝口螈脊髓中进行时空限制性基因敲除的实验方案，即通过将CAS9-gRNA复合物注射到脊髓中央管后，进行电穿孔处理。...

通过电穿孔递送Cas9蛋白-gRNA复合物直接敲除蝾螈脊髓神经干细胞中的基因

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本方案利用荧光报告基因和细胞分选技术，简化巨噬细胞和T细胞系中的基因敲入实验。这些简化的基因敲入实验使用两种质粒：一种是表达CRISPR/Cas9和DsRed2的质粒，另一种是表达EBFP2的同源重组供体质粒，后者可永久整合到免疫细胞的Rosa26位点。...

通过CRISPR/Cas9基因敲入及细胞分选在巨噬细胞和T细胞系中实现基因编辑

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

在此，我们描述了用于并行监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及分泌活性的实验设置。为此，我们采用慢病毒载体递送荧光素酶核心钟基因报告系统，随后 体外...

平行测量人原代细胞培养物中的昼夜节律钟基因表达与激素分泌

我们介绍了一种多重高通量基因表达检测平台的使用方法，该平台通过在生物样本中对分子进行条形码标记和计数来定量基因表达，无需扩增步骤。我们利用该平台对肠易激综合征患者和健康对照者全血中的微小RNA（miRNA）表达水平进行了定量分析。...

利用多重高通量基因表达平台检测肠易激综合征患者循环miRNA的异常变化

了解利用电穿孔技术将Cas9-sgRNA复合物递送至原代骨髓来源巨噬细胞的高效基因编辑方法。该技术无需克隆即可实现快速遗传操作，适用于免疫学研究。

利用电穿孔递送Cas9-sgRNA复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

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