Name: 组装和操作冷却阶段，以固定 秀丽隐杆线虫 在其培养板上 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习使用冷却阶段固定秀丽隐杆线虫的方法，在6摄氏度下实现高效高分辨率成像。该技术无需化学麻醉剂，可将处理时间缩短98%，适用于遗传学和发育生物学研究。

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我们感谢诺亚·约瑟夫（Noah Joseph，东北大学生物工程系）在铜板加工方面的帮助。

1. 冷却阶段各组件的制造与准备
注意：冷却装置包含多个组件（参见材料表）。大多数组件为现成产品。蓝宝石窗口需定制订购，而铜板、固定支架和隔离板可通过数控铣床或3D打印机在现场加工制造。完成初始制造后，后续组装过程大约需要2-3小时。
<ol>
	<li>使用数控铣床从一块 170 mm × 120 mm × 3 mm、纯度为 99.9% 的铜金属板上加工铜板（图 2A）。该加工的二维图纸见于补充文件 1。使用细粒度砂纸去除任何锋利的边缘和污垢残留物。</li>
	<li>制造固定支架和隔离板时，使用 3D 打印机和直径为 1.75 mm 的聚乳酸（PLA）线材（图 2B、C）。为获得更高质量，3D 打印机的层高应小于 0.2 mm。3D 模型文件见于补充文件 2和补充文件 3。</li>
</ol>
2. 构建水冷组件
<ol>
	<li>准备铂金固化硅胶管、水泵箱、铜制散热块和散热器（图3A），用于构建水冷组件。准备好剃刀刀片、剪刀和六角扳手以备使用。注意在整个装配过程中因使用水而可能存在的电击危险。</li>
	<li>将硅胶管剪成三段，建议长度分别为40 cm、50 cm和80 cm。根据需要调整长度。</li>
	<li>将步骤2.2中得到的硅胶管段插入散热器、水泵箱和铜制散热块的接口中，如图3B所示。确保所有连接处密封不漏水。水冷组件现已组装完成。</li>
	<li>准备好水冷组件、一个12 V电源、三根红色和三根黑色跳线、一块面包板以及500 mL纯化水。</li>
	<li>为确保用电安全，请保持工作台面无液体残留。</li>
	<li>通过面包板将水泵箱和散热器的导线连接至12 V电源（图3C）。使用面包板是为了操作方便。 
	注：如需更持久且安全的连接，研究人员可用焊接导线替代面包板。</li>
	<li>使用平头螺丝刀打开水泵箱盖。借助漏斗加水，直至水泵箱约80%满（图3D）。加水后暂不盖上水泵箱盖。</li>
	<li>通过插入12 V电源或开启电源开关（如配备开关）为水冷组件供电。通电后，水将在组件内部循环流动，散热器上的风扇应开始运转。</li>
	<li>由于水泵箱中的水流启动，箱内液面会下降。&#160;继续向水泵箱中添加水，直至液面稳定在接近2/3满的位置（图3E）。</li>
	<li>轻轻摇动散热器以排出气泡，然后盖紧冷却箱盖。</li>
	<li>在进入下一步之前，请先关闭电源。</li>
</ol>
3. 测试帕尔贴冷热表面
注意：帕尔贴器件是冷却台的关键部件，是一种将热量从一侧主动传递到另一侧的固态热泵21。当通电时，帕尔贴器件的一个表面变热，另一个表面变冷。通常情况下，制造商在出售前会标记冷表面，但在组装前手动测试仍是有帮助的。
<ol>
	<li>如图4A所示，准备可调电源和帕尔贴装置。</li>
	<li>确保可调电源处于关闭状态，以防止可能的电击危险。</li>
	<li>使用电源供应器附带的鳄鱼夹，将帕尔贴装置的红线连接到可调电源的正极输出端，黑线连接到负极输出端（图4B）。</li>
	<li>打开可调电源，通过调节电源顶部一排的电压和电流旋钮，将输出设置为约2 V。随后立即用裸露的手指触摸帕尔贴装置的两个表面。其中一个表面会在几秒钟内变冷。</li>
	<li>确定冷表面后，立即关闭电源并断开帕尔贴装置的连接。</li>
	<li>使用记号笔标记冷表面，以便后续组装时识别。</li>
</ol>
4. 使用水冷组件构建冷却佩尔捷的装置
<ol>
	<li>如图4A所示，准备好已关闭的水冷组件、帕尔贴装置（已标记冷面）以及导热硅脂（用于提高热传导效率）。</li>
	<li>使用70%乙醇（或其他清洁溶液）清洁水冷组件中铜制冷却块的所有表面。</li>
	<li>在铜制水冷块的一个表面上涂抹约0.4 g导热硅脂，并确保该表面的朝向在向下放置时可避免管路交叉或弯曲。操作时佩戴手套以保护皮肤，并尽量将导热硅脂均匀、薄层地涂抹开（图4C）。</li>
	<li>同样地，清洁帕尔贴装置的热面，然后在其表面涂抹导热硅脂（图4D）。</li>
	<li>将帕尔贴装置的热面与涂有导热硅脂的铜制冷却块表面连接，施加压力以确保连接牢固。注意帕尔贴装置的导线方向与铜制冷却块管路的方向，如图4E所示。清除多余的导热硅脂。</li>
	<li>保持12 V电源和可调电源均处于关闭状态。将帕尔贴装置连接至可调电源，如&#160;第3节所述。</li>
	<li>重新检查所有电路连接和水冷组件连接，然后依次打开12 V电源和可调电源。</li>
	<li>逐渐将可调电源调节至12 V。使用推荐的帕尔贴装置时，电流应约为7.3 A。</li>
	<li>等待2分钟，帕尔贴装置冷面温度应降至-35 °C以下。使用红外测温仪测量该温度（图4F）。切勿触碰冷面，以防手部冻伤。</li>
	<li>若温度无法降至-30 °C以下，请检查所有连接和组件。水冷组件内部存在气泡可能是导致制冷效果不佳的可能原因。</li>
	<li>为确保后续步骤的安全，先关闭可调电源，等待1分钟后，再关闭12 V电源。</li>
</ol>
5. 构建铜板与蓝宝石窗口组件
<ol>
	<li>准备铜板、直径为80 mm的蓝宝石窗口、导热硅脂、4英寸宽的胶带以及用于切割的锋利刀片（图5A）。</li>
	<li>使用70%乙醇仔细清洁铜板和蓝宝石窗口，并用细粒度砂纸打磨粗糙表面，使其平滑。</li>
	<li>在三个内表面涂抹导热硅脂，如图5B所示。确保导热硅脂覆盖全部三个表面区域，但不宜过厚，约0.5 mm即可。</li>
	<li>将铜板放置在实验台面上，台面需预先铺好打印纸。纸张有助于后续清理工作。</li>
	<li>将蓝宝石窗口插入铜板的孔中（图5C）。插入时确保蓝宝石窗口不发生旋转，以防止导热硅脂移位至其他区域。清除多余的导热硅脂。</li>
	<li>将4英寸宽的胶带粘贴到铜板-蓝宝石窗口组件的顶面（即具有方形凹陷区域的表面，如图5D所示）。粘贴时应从一侧缓慢向另一侧推进，避免胶带与铜表面之间产生气泡。</li>
	<li>使用锋利刀片按照图5E所示切割胶带上指定的蓝色虚线区域。切割后应露出两个螺纹孔、方形凹陷区域以及蓝宝石窗口上直径为70 mm的区域。</li>
	<li>将胶带粘贴至铜板-蓝宝石窗口组件的底面，然后在此表面重复切割步骤（仅限蓝宝石区域），如图5F所示。 
	&#8203;注意：此时蓝宝石窗口已牢固固定于铜板上，且铜表面已受到保护，可防止生锈。</li>
</ol>
6. 冷却台最终组装
<ol>
	<li>确保所有必要的子组件和部件均已准备就绪。</li>
	<li>在铜板的方形凹槽内涂抹约 0.4 g 的导热硅脂（图 6A）。</li>
	<li>在帕尔贴元件的冷面涂抹约 0.4 g 的导热硅脂。注意帕尔贴元件已固定在铜制散热块上（图 6B）。</li>
	<li>将帕尔贴冷面与铜板凹槽对齐，并施加向下的压力使其贴合。清除所有多余的导热硅脂（图 6C）。</li>
	<li>将3D打印的支架安装在铜制散热块顶部，然后使用六角扳手拧紧两颗 8-32、0.5 英寸长的螺丝，将支架固定在铜板上（图 6D）。请使用低扭矩拧紧，以免打印支架破裂或变形，从而确保帕尔贴元件至铜板之间的良好导热性能。</li>
	<li>将铜板放入3D打印的隔热底座中，以便在运行期间实现与实验台或显微镜基座的热隔离（图 6D）。</li>
	<li>冷却台已组装完成，可随时使用（图 6E）。</li>
	<li>进行显微观察时，将组装好的冷却台放置在直立式显微镜载物台上（图 7A）。</li>
	<li>冷却台的组装已完成。更多详细信息请参见Chung实验室的配套出版物，其中全面表征了相关详细策略及动物运动行为20。</li>
</ol>
&#8203;注意：以下部分讨论了缓慢、快速和骤冷三种降温方案。实验所用N2雌雄同体线虫为L4期或年轻成虫期。缓慢降温法适用于将20 °C培养的N2线虫在6 °C下实现不动化；而在15 °C培养的N2线虫在1 °C时不动化效果最显著20。这三种降温方案的简要比较见表1。
7. 缓慢冷却固定化方案
<ol>
	<li>将带盖的培养皿移至4 °C冰箱中。</li>
	<li>将培养皿移入冰箱后，打开冷却台的12 V电源，并将可调电源电压设为5.5 V。</li>
	<li>带盖培养皿在4 °C冰箱中放置1小时后，立即将其转移至冷却台上并取下盖子（图7A）。此类培养皿的温度通常约为6 °C。预冷的冷却台稳定且足够低温，可使琼脂表面维持在6 °C。</li>
	<li>若琼脂表面温度发生变化（通过测量或观察动物活动判断），可微调电压直至温度稳定在6 °C。</li>
	<li>动物在转移时应已得到适当固定。</li>
</ol>
8. 快速冷却固定方案
注意：快速冷却策略是最基本的固定方法（见视频1）；然而，琼脂平板在达到设定温度Tset的过程中会长时间空置在载物台上。此外，当需要较强固定效果且设定温度Tset为6 °C时，空置时间会延长至约1 h20。
<ol>
	<li>打开冷却台的12 V电源，将可调电源电压设置为约12 V，等待10分钟。</li>
	<li>将培养皿从培养箱直接转移至冷却台，并取下皿盖。</li>
	<li>一旦琼脂表面温度降至（T设置 + ΔT) °C 时，调节可调电源至 V设置 并等待琼脂达到 T设置.&#160;这&#160;V设置 是稳定 T 处琼脂的合适电压设置ΔT 是一个防止过度冷却的变量。参见 表 2 T的组合设置，ΔT，和 V设置. 
	注意：本文所展示的数据 表 2 特指钟氏实验室，因此需要指出的是，实验参数可能因各次实验独特的环境和使用条件而有所差异。</li>
	<li>当琼脂达到 T 时，动物即被固定设置固定效果随着时间延长而改善，直至冷却开始后约50分钟。</li>
</ol>
9. 快速冷却固定方案
注意：骤冷策略消耗的用户时间最长，但能最快将动物从培养温度下固定。
<ol>
	<li>打开冷却台的 12 V 电源，并将可调电源电压调至约 12 V，保持 10 分钟。</li>
	<li>将一个未使用的琼脂平板移至冷却台上。按照快速冷却固定方案中的步骤 8.3，将琼脂表面温度稳定在 Tset。</li>
	<li>将生物样本从其原始培养平板转移至放置在冷却台上的冷却平板中。</li>
	<li>由于生物样本体积较小，预计在数秒内即可冷却至 Tset 并实现固定。固定效果随冷却时间延长而改善，直至冷却开始后约 50 分钟达到最佳。</li>
</ol>
10. 冷却固定后动物的复苏
<ol>
	<li>将冷却后的培养皿移回原来的培养箱或室温环境中。</li>
	<li>等待 20 分钟至 1 小时，直至平板上所有线虫恢复正常的爬行和摄食行为。</li>
</ol>

Constructing and Operating a Cooling Stage to Immobilize C. elegans En Masse

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

本文展示了冷却台的制造、组装和使用方法。大多数组件均为现成商品，可在线购买。部分组件（如铜板和蓝宝石窗口）需要定制，制造时间可能长达1个月。其他可3D打印的组件在大多数研究机构中均可轻松制备（补充表1）。组装过程仅需少量工具，非专业人员也可在数小时内快速完成。因此，大多数生物实验室均可轻松实现该装置的搭建。
冷却载台与冷却固定方法相较于现有的固定技术具有多项显著改进，具体细节已在原始出版物中详尽阐述20简而言之，冷却阶段能够实现对大量群体的牢固固定。 秀丽隐杆线虫 适用于所有发育阶段的生物体（包括胚胎和滞育幼虫）在标准显微工作流程下的常规培养平板中进行观察。该方法无需复杂的硬件装置（如微流控系统），同时可实现更强的固定效果。此外，由于不使用任何化学试剂，能够最大限度减少动物和研究人员接触潜在有毒化学物质的风险，且仍可达到与化学方法相当的固定效果。这些技术优势使得该装置和方法可广泛应用于需要高分辨率成像的多种实验。 体内 对大量动物进行显微镜观察。
在设备组装过程中，有一些关键步骤，包括所有导热硅脂的涂抹以及使用宽胶带将蓝宝石窗口固定到铜板上。导热硅脂通过低热阻材料填充间隙，从而确保良好的热导性能。为了实现所需的冷却效果，必须在所有相邻或接触的表面之间正确涂抹导热硅脂，包括半导体制冷片的冷面与铜板之间、热面与铜制散热块之间，以及铜板与蓝宝石窗口之间。在载物台上使用的宽胶带可将铜板与外界隔离，防止空气加热和冷凝水形成，从而避免生锈；同时也能增强蓝宝石窗口与铜板之间的连接。因此，涂抹导热硅脂和使用宽胶带都需要格外小心。
在实际的冷却固定实验中，本文提供的参数（如电压和时间）取决于培养皿和载台的具体特性，例如培养皿中琼脂的含量、载台的效率以及环境温度和湿度。在未来改进中，可以安装反馈控制器，例如比例-积分-微分（PID）控制器，以主动调节输入冷却载台的电压，从而达到目标温度并使其稳定。
这种冷却台固定方法存在若干局限性，原始文献中已详细说明20。简而言之，在不同温度下培养的动物被固定的程度有所不同，可能需要额外的精细调整。此外，当前的冷却台并未设计用于倒置显微镜。进一步地，直接在培养板上进行成像或筛选可能会引入污染。
我们正在设计适用于不同成像平台的新款冷却载台，包括正置复合显微镜和倒置显微镜。这些新设计将允许在这些平台上对培养皿中的活体动物进行直接冷却固定。在这些冷却载台上成像时，将使用长工作距离的空气镜片物镜，类似于正置显微镜的配置。目前，空气镜片物镜的数值孔径最高可达0.9，对于绿色荧光蛋白成像可提供约300 nm的分辨率。因此，新款冷却载台与显微镜的结合可实现常规的亚微米分辨率荧光成像。
根据我们的经验，我们还提供了一些使用冷却台的实用建议。例如，操作人员应检查水冷组件内部是否存在气泡。气泡会降低水冷系统对帕尔贴热面的散热效果，从而削弱冷却台的制冷效率。如果发现有气泡，应接通12 V电源使水流动，并轻轻摇晃水路中的各个部件。气泡可通过泵箱排出并从滞留区域清除。研究人员在组装水冷系统时，应确保水冷管路没有弯折或交叉。管路弯折或交叉可能阻碍水流的正常循环，降低冷却效果。管路连接处应安装到位并保持紧密。如有必要，可更换为不同直径的软管以确保密封性。即使连接处不够紧密，也不应使用胶类物质进行密封，因为胶类物质可能在后续使用中造成堵塞。环境湿度会影响冷却性能，并在冷却台上产生冷凝水或结冰。在将培养皿放置于冷却台之前，建议使用纸巾擦除冷凝水，或使用散热片快速清除蓝宝石窗口上的冰层。泵箱和散热风扇若与显微镜置于同一台面，可能引起微小振动。显微镜振动会导致成像模糊，因此应尽量避免。可使用减震垫对泵箱和散热器进行机械隔离，或将它们放置在附近独立的台面上。通过反转帕尔贴元件的电极连接，冷却台也可转变为加热台。

高分辨率光学显微镜为在亚细胞水平研究体内生物结构提供了不可或缺的工具。许多生物学研究需要亚微米级分辨率成像，以分辨细微的解剖结构，包括神经元形态1,2、膜结构3,4以及蛋白质定位5,6。高分辨率图像的获取需要几毫秒到数秒的曝光时间，具体时长取决于成像方式和探针7,8。为了获得最佳结果，必须精心规划并实施基于显微镜的实验。其中关键的一环是采用高效的动物制备方法，以促进高分辨率成像的实现。
线虫 C. elegans 是研究多种生物学过程的常用模式生物9。这种小型动物通常在线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上培养，可通过自体受精快速繁殖，因此非常适合大规模研究。其身体透明且拥有多种标记技术，可直接观察其内部解剖结构10,11。C. elegans 的精细结构非常适合在亚细胞水平研究生物学过程，例如神经元再生12、神经元退化13 和细胞分裂14。此类研究需要亚微米分辨率的成像，以及足够牢固的动物固定，以防止图像模糊。对于涉及空间或多时间点的成像技术（如三维图像堆栈（即 z-stacks）和延时成像），牢固的固定尤为重要。曝光期间任何动物移动都可能影响成像结果。对于 C. elegans，常规的牢固固定通常需要手动操作单个个体，并使用麻醉剂将其装载到载玻片上15,16。这些耗时且劳动密集的步骤使得大规模实验极为困难。若能建立一种使动物在其原始培养平板上直接且可逆固定的策略，则有望实现高通量、高分辨率的成像。
已有少数研究表明，通过冷却固定 C. elegans 是可行的，但该方法尚未被广泛应用。通常需结合微流控装置以进一步限制线虫活动17,18,19。然而，微流控装置结构复杂，需要大量操作培训，且难以与 C. elegans 实验中常见的固体培养流程相整合。因此，微流控技术并未被广泛用于 C. elegans 的固定。本文结合Chung实验室近期发表的研究20，介绍一种新型冷却固定方法，该方法采用热电冷却台（图1），可有效克服上述局限。利用该冷却台，标准的60 mm聚苯乙烯培养皿可被冷却至-8 °C至室温之间的任意目标温度（Tset）。该冷却台方法能够简便、可逆地固定整个线虫群体，操作简便，可减少98%的样本处理时间20。
以下介绍了从零开始构建冷却载台的步骤。除了零件加工和3D打印外，整个过程预计耗时4小时，且无需特殊工具或专业知识。随后，进一步描述了三种不同的冷却策略，这些策略在冷却速率以及固定线虫（C. elegans）于典型直立式显微镜下的操作难度方面各不相同。用户可根据具体应用选择最合适的策略。文中对这三种冷却固定方法的实验方案进行了详细说明。

<table><tbody><tr><td>12 V 电源</td><td>ANYTITI</td><td>ledpower00</td><td>输出直流 12 V ±0.5 V，5 A&lt;br/&gt; 功率 60 W</td></tr><tr><td>8-32 螺丝</td><td>arbitrary</td><td></td><td>用于支架固定</td></tr><tr><td>支架</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>使用 1.75 mm PLA 丝材 3D 打印制成。3D 模型见补充材料。</td></tr><tr><td>面包板</td><td>DEYUE</td><td>7545924028</td><td>400 针无焊电路板套件，用于 DIY 电路连接</td></tr><tr><td>铜制散热块</td><td>Kalolary</td><td>Kalolary-Heatsink001</td><td>40×40 mm&lt;br/&gt; 散热鳍片厚度 0.5 mm</td></tr><tr><td>铜板</td><td>arbitrary</td><td>N/A</td><td>由一块 170×120×3 mm、纯度 99.9% 的铜板加工制成。&amp;nbsp;制造用 2D 图纸见补充材料。</td></tr><tr><td>数字热电偶温度计</td><td>Proster</td><td>4333090752</td><td>双通道温度计，配备两个 K 型热电偶探头&lt;br/&gt; 测量范围 -50–300&amp;deg;C&lt;br/&gt; 精度 &amp;plusmn;1.5%&lt;br/&gt; 分辨率 0.1&amp;deg;C /&amp;deg;F &amp;lt; 1000&amp;deg;</td></tr><tr><td>隔热底座</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>使用 1.75 mm PLA 丝材 3D 打印制成。3D 模型见补充材料。</td></tr><tr><td>跳线</td><td>arbitrary</td><td></td><td>用于电路连接</td></tr><tr><td>多级帕尔帖器件</td><td>DigiKey</td><td>TEC1-12706</td><td>热电制冷装置&lt;br/&gt; 尺寸 40×40×7.05 mm&lt;br/&gt; 最大电压 16.1 V&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 最大电流 8.5 A&lt;br/&gt; &amp;Delta;Tmax @ Th 85&amp;deg;C @ 27&amp;deg;C&lt;br/&gt; Qmax @ Th 51.6 W @ 27&amp;deg;C&lt;br/&gt; 电阻 1.65 &amp;Omega;</td></tr><tr><td>Nalgene 50 铂金硫化硅胶管</td><td>ThermoScientific</td><td>14-176-332E</td><td>超软管&lt;br/&gt; 硬度（邵氏 A）50&lt;br/&gt; 内径 1/4 英寸&lt;br/&gt; 外径 9.5 mm</td></tr><tr><td>包装胶带</td><td>arbitrary</td><td></td><td>4 英寸宽，用于覆盖铜板</td></tr><tr><td>水泵水箱</td><td>Yosoo</td><td>SC-300T</td><td>输入功率 直流 12 V&lt;br/&gt; 最大流量 300 L/h</td></tr><tr><td>散热器</td><td>DIYhzWater</td><td>10463</td><td>12 管铝制热交换器，带两个 120 mm 风扇的冷却水排</td></tr><tr><td>蓝宝石窗口片</td><td>Altos Photonics, Inc.</td><td>N/A</td><td>联系 Altos 定制&lt;br/&gt; 尺寸 &amp;Oslash; 80 mm，厚度 3 mm&lt;br/&gt; 表面质量 60-40 s/d&lt;br/&gt; 未镀膜</td></tr><tr><td>导热硅脂</td><td>Corsair</td><td>XTM50</td><td>降低界面间的热阻&lt;br/&gt; 导热系数 5.0 W/mK</td></tr><tr><td>可调电源</td><td>Kungber</td><td>DY-SPS3010B</td><td>电压范围 0 &amp;ndash; 30 V&lt;br/&gt; 电流范围 0 &amp;ndash; 10 A&lt;br/&gt; 四位数显示线性电源&lt;br/&gt; 带粗调和微调及鳄鱼夹引线</td></tr></tbody></table>

组装和操作冷却装置以在培养板上固定秀丽隐杆线虫（c. elegans）

Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates

高分辨率 体内 显微成像技术可以揭示模式动物内部的细微信息和精细结构 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫），但需要对动物进行牢固固定，以防止图像中出现运动模糊。然而，目前大多数固定技术都需要大量人工操作，导致高分辨率成像通量较低。动物固定 秀丽隐杆线虫 通过采用一种冷却方法，可直接在培养板上轻松固定整个种群，从而极大地简化了操作流程。该冷却装置能够在培养板上建立并维持温度均匀分布的广泛温区。本文详细记录了构建冷却装置的完整过程，旨在使普通研究人员能够根据本方案在其实验室内轻松搭建可运行的冷却装置。文中展示了三种使用该冷却装置的操作方案，每种方案在不同实验中各有优势。同时提供了一个冷却装置趋近最终温度时的典型降温曲线示例，以及使用冷却固定技术时的一些实用技巧。

冷却温度测量 
在进行初始的冷却固定实验时，监测琼脂表面温度至关重要，以确保线虫能够被有效固定。后续重复初始实验的实验可采用相同的参数，通常无需频繁监测温度。进行温度测量时，先用70%乙醇溶液对温度计的热电偶探针进行消毒，并等待乙醇完全挥发后再使用。随后，将热电偶探针插入NGM琼脂中1 mm深度，以确保获得准确的温度读数。热电偶探针可用夹具或其他固定装置固定（图7B）。
使用红外相机进行温度测量 
冷却台的设计旨在确保培养皿中央直径40 mm区域内的温度分布均匀。采用前视红外（FLIR）相机对琼脂表面的温度分布进行成像。当设定温度（Tset）为1、3或6 °C时，最大温差约为1 °C（图8A）。
使用快速冷却策略评估冷却速率 
快速冷却策略用于表征在12 V条件下载物台的冷却速率。将一块20 °C的样品板放置于冷却台上，使用热电偶温度计监测其表面温度。该载物台可在6分钟内将20 °C的样品板冷却至6 °C，10分钟内冷却至1 °C，最终在约40分钟内稳定在-7 °C以下（图8B）。
在直立显微镜平台上使用冷却载台 
直立显微镜通常包含用于成像的物镜、用于承载样品的载物台以及照明装置。该冷却载台专为标准直立显微镜载物台设计，可轻松插入和取出（图8C）。当成像或筛选需要通过冷却实现固定时，只需将冷却载台放置在显微镜载物台上即可完成安装；反之，亦可轻松取下。
线虫在冷却板上的固定过程如影片1所示。
<img alt="冷却系统示意图，显示散热分析中 radiator-泵装置的液体流动。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：冷却台装置的 3D 模型。为清晰起见，未显示电子连接。储液罐将水抽送通过冷却块，以带走由嵌入台内的 Peltier 元件传导的热量。典型的 60 mm 聚苯乙烯培养皿可放置在透明的蓝宝石窗口上，并由台面进行冷却。模型使用 Solidworks 生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光学激发装置示意图的组件；A、B、C部分详细说明了组装方式和功能。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：待制造组件的3D模型。（A）铜板。（B）3D打印的固定支架。（C）3D打印的隔离板。模型使用Solidworks生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="散热系统示意图；散热器、水泵箱、管道、铜块、电源装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：水冷装置。（A）各个组件。管道已截成指定长度。（B）水冷组件连接完成。（C）将水泵箱和散热器连接至12 V电源的导线。通常，红色导线连接正极，黑色导线连接负极。（D）将纯水倒入水泵中。（E）水箱注水至超过三分之二，以确保水泵的最佳效率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用 Peltier 模块、导热硅脂和水冷组件搭建的可调电源装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：连接 Peltier 模块与水冷组件。（A）用于驱动 Peltier 模块的组件。（B）利用可调电源确定 Peltier 模块的热端与冷端。出于安全考虑，所用电压不超过 2 V。（C）在铜块表面均匀涂抹导热硅脂。（D）在 Peltier 模块的热端表面均匀涂抹导热硅脂。（E）将 Peltier 模块的热端通过导热硅脂压接在铜块上。（F）使用红外测温仪测量 Peltier 模块冷端表面的温度。理想情况下，冷端温度可接近 -35 °C。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示铜、蓝宝石和导热脂的热传导装置示意图；热传递的组装和挖切步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：铜板与蓝宝石窗口的组装。（A）所需组件。（B）在铜板内侧三个与蓝宝石窗口接触的表面涂抹导热脂。两张俯视铜板的示意图，显示三个涂抹表面的位置。（C）蓝宝石窗口嵌入铜板的孔中。（D）在组件的顶面贴上胶带。（E）顶面视图：蓝色虚线表示需切割并移除胶带的位置：方形凹槽、两个孔以及直径为 70 mm 的蓝宝石区域。（F）底面视图：按图示方式切割并移除胶带。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="带有冷却台、泵箱、散热器和电源的热管理系统装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 6"> 
图 6：冷却台最终组装示意图。 （A）在铜板凹槽处涂抹导热硅脂。 （B）在半导体制冷片（Peltier）的冷面涂抹导热硅脂。 （C）将半导体制冷片的冷面与凹槽连接。 （D）使用螺丝将铜制冷却块固定在铜板上。冷却台安装于隔热底座中。 （E）组装完成的冷却台。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜装置，包含物镜、底座、用于热分析和观察的温度计与热电偶。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：显微镜上的冷却台与热电偶测量。 （A）放置在显微镜底座上用于成像的冷却台。蓝宝石窗口透明，可实现透射照明。（B）用于测量 NGM 琼脂表面温度的热电偶温度计。探头插入 NGM 琼脂中约 1 mm 深度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="冷却琼脂平板的热成像、温度图、带冷却台的显微镜实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 8"> 
图 8：冷却台的表征与使用。（A）热成像图显示琼脂表面被冷却至 1、3 和 6 °C。中心 40 mm 区域内温度分布均匀（白色虚线圆圈）。（B）在 12 V 条件下，冷却台上 NGM 琼脂表面随时间变化的温度。NGM 琼脂表面可被冷却至 -7 °C 以下。温度测定方法见图 7B。（C）在典型直立式显微镜上使用的冷却台。冷却台可轻松安装或拆卸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>缓慢降温</td>
			<td>快速降温</td>
			<td>骤降温</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>阶段占用情况</td>
			<td>最小</td>
			<td>长</td>
			<td>中等</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>动物达到固定状态所需时间</td>
			<td>长</td>
			<td>中等</td>
			<td>极短</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>固定效果强度</td>
			<td>强</td>
			<td>中等</td>
			<td>中等</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>操作者所需 effort（操作难度）</td>
			<td>最小</td>
			<td>略高于最小</td>
			<td>最大</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：降温策略比较。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tset (°C)</td>
			<td>ΔT (°C)</td>
			<td>Vset (V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>4.5</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>5.5</td>
			<td>6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>5.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：快速冷却策略中实现目标温度的参数。
补充文件 1：公制铜板。用于加工铜板的 A2D 工程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/Copper%20plate%20in%20Metric.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：固定支架。 一个固定支架的 3D 图纸，可用 Solidworks 打开或修改，并导出至 3D 打印软件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/holding%20bracket.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件3：分离板。 一个可使用Solidworks打开或修改并导出至3D打印软件的分离板的三维示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/isolation%20plate.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
视频 1：冷却过程视频。 将线虫固定在NGM琼脂平板上 2 °C. 将培养板从室温冷却至 2 °C，并保持在 2 °C 数分钟后，关闭冷却阶段，培养板自然升温至室温。视频已加速10倍，将1小时的视频内容压缩至6分钟。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/Cooling%20video.mp4" target="_blank">请点击此处下载此视频。</a>
补充表1：价格估算 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文描述了构建和操作冷却台以固定样品的实验方案 秀丽隐杆线虫 在原始培养板上 大规模.

组装和操作冷却装置以在培养板上固定秀丽隐杆线虫（C. elegans）

高分辨率的活体显微成像技术可揭示模式动物秀丽隐杆线虫（C. elegans）体内的细微信息与精细结构，……

我们正在开发一种简单的方法，可将整个秀丽隐杆线虫种群直接固定在培养板上。该策略显著加快了与成像相关的实验进程。通常用于秀丽隐杆线虫种群高分辨率成像的叠氮化钠固定方法极为耗时，需要对每只动物进行 individually mounting 和操作。该方法也可能缩短动物寿命并降低其存活率，从而干扰实验数据。传统的冷却方法采用相对较低的温度，即2至4摄氏度的微流体，这需要操作者经过 extensive 用户培训。我们发现，在冷却过程中，使用较温暖的温度（如6摄氏度）对动物的固定效果最强，最适合进行高分辨率成像。冷却固定秀丽隐杆线虫（C.elegans）的方法尚未被广泛使用，但当使用时，通常需结合复杂的微流控装置，且需要用户接受大量培训。由于传统固定方法存在不足，我们对冷却固定的改进提高了其可及性，使研究人员能够实现高通量、高分辨率的成像。与耗时耗力的单个动物制片和麻醉方法相比，我们的冷却方法可逆地固定大量秀丽隐杆线虫群体，减少98%的处理时间。缺乏化学麻醉剂还可最大限度地减少对动物和研究人员的有害暴露。冷却载台可直接在培养板上实现高通量和高分辨率成像。该设计的简便性使得其他研究人员能够轻松构建自己的设备，并将其整合到现有实验系统中，从而彻底改变其生物学研究的广度与速度。本实验室将针对不同显微镜配置调整冷却台装置。多种设计可适配倒置显微镜、正置复合显微镜以及不同的成像平台。首先，使用数控机床加工一块尺寸为170 × 120 × 3 毫米、纯度为99.9%的铜金属板。使用细砂纸去除尖锐边缘和污垢残留物。为构建水冷装置，将硅胶管切成40、50和80厘米长的三段。将切割好的硅胶管段分别插入散热器接口、水泵水箱和铜制散热块，确保连接处密封不漏水，以完成水冷装置的组装。接下来，通过面包板将泵水箱和散热器的导线连接到12伏电源。使用一字螺丝刀打开泵水箱盖，加水直至泵水箱约80%满。不要盖上泵水箱盖。 使用12伏电源启动水冷组件，以促进组件内部的水流以及散热器上风扇的运转。当水从水泵箱流出时，箱内液位会下降。向水泵箱中加水，直至液位稳定在接近三分之二满的位置。在将盖子安装到冷却罐之前，摇晃散热器以去除气泡。首先，使用70%乙醇清洁水冷组件中铜制散热块的所有表面。佩戴手套，并在铜制水冷块的一个表面均匀涂抹一层约0.4克的导热硅脂。确保表面方向能够防止管子交叉或弯曲。同样，使用70%乙醇清洁帕尔贴装置的热面，并在表面涂抹导热硅脂。按照导线的方向，将帕尔贴装置的热面通过导热硅脂与铜制散热块表面连接。施加压力以固定，并清理多余的导热硅脂。然后确保12伏电源和可调电源处于关闭状态。使用鳄鱼夹将帕尔贴片的红线连接到可调电源的正极输出端，黑线连接到负极输出端。重新检查电气和水冷组件的连接后，依次打开12伏电源和可调电源。逐渐将可调电源调节至12伏，此时使用建议的半导体制冷片（Peltier）电流应约为6安培。两分钟后，使用红外测温仪测量温度，切勿触碰冷表面，其温度应低于零下35摄氏度。首先用70%乙醇仔细清洁铜板和蓝宝石窗口。使用细粒砂纸将粗糙的铜板表面打磨光滑。在铜板内侧三个将与蓝宝石窗口接触的表面上涂抹约0.5毫米厚且均匀的导热硅脂，并均匀铺开。然后将铜板平放在实验台上，同时用纸保护台面。将蓝宝石窗口插入铜板的孔中，确保插入过程中蓝宝石不发生旋转。清除多余的导热硅脂。将四英寸宽的胶带粘贴到带有方形凹陷区域的铜板-蓝宝石窗口组件的上表面。从一侧向另一侧缓慢引导粘贴过程，以避免粘贴过程中产生气泡。使用锋利的刀片沿组件上以蓝色虚线标示的区域进行裁切，露出两个螺纹孔、方形凹陷区域以及直径为70毫米的蓝宝石窗口区域。切下粘附在铜板-蓝宝石窗口组件上的区域。完成后，用胶带贴住铜板-蓝宝石窗口组件的底面，并重复切割操作，露出两个螺纹孔和直径为70毫米的蓝宝石窗口。将约0.4克导热硅脂涂抹在铜板的方形凹槽内，以及已固定在铜制冷块上的帕尔帖元件的冷表面。将帕尔帖制冷面通过向下的压力连接到铜板的凹槽处，然后清理多余的导热硅脂。将3D打印的支架安装在铜制冷块的顶部，然后使用六角扳手拧紧两颗8-32规格、长度为0.5英寸的螺丝，将支架固定在铜板上。将铜板放入3D打印的隔热底座中，以便在操作过程中实现与实验台或显微镜底座的热隔离。冷却台已组装完毕，可直接使用。该冷却台专为典型的直立式显微镜载物台设计，便于快速插入和取出。当成像或筛选需要冷却固定时，将冷却台放置在显微镜载物台上完成安装；反之亦然。使用热电偶温度计监测放置在冷却台上的样品板表面温度，结果显示，该冷却台可在6分钟内将样品板从20摄氏度冷却至6摄氏度，10分钟内冷却至1摄氏度，约40分钟后最终稳定在零下7摄氏度以下。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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C. elegans 性腺解剖与冰冻裂解用于免疫荧光及 DAPI 染色

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学习使用冷却阶段固定秀丽隐杆线虫的方法，在6摄氏度下实现高效高分辨率成像。该技术无需化学麻醉剂，可将处理时间缩短98%，适用于遗传学和发育生物学研究。

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