Name: 人和小鼠组织中性粒细胞胞外陷阱的免疫荧光成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学习免疫荧光成像技术检测人和小鼠组织中的中性粒细胞胞外陷阱。本研究建立了标准化成像方案，通过抗原修复和自发荧光消除技术，解决了表位掩蔽和背景染色问题，提高了NETs可视化的可靠性和可重复性。

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本研究由德国研究基金会（BO5534）资助。我们感谢Antonia Kiwitt、Moritz Lenz、Johanna Hagens、Annika Heuer博士以及Ingo Königs副教授为我们提供样本。此外，作者还感谢UKE显微成像中心（UKE医学院核心设施）团队在免疫荧光显微镜实验方面的支持。

本研究使用的组织样本来自德国汉堡州动物研究管理局（Behörde für Justiz und Verbraucherschutz，汉堡）批准的实验（批准号：73/17、100/17、94/16、109/2018、63/16）。所用组织包括脓毒症模型小鼠的肺和结肠组织，以及烧伤皮肤组织。实验使用8周龄的雄性和雌性小鼠。所有实验均遵循欧盟关于用于科学目的动物保护的2010/63/EU指令。匿名化的人体样本包括新生儿小肠结肠炎、烧伤皮肤、胆道闭锁、椎间盘炎以及心肌组织。根据汉堡医学研究伦理委员会的意见，这些样本无需知情同意，但本研究已获得该委员会批准（批准号：WF-026/21）。
1. 样品固定
<ol>
	<li>采用源自 Abu Abed 和 Brinkmann 的以下方案进行样本固定、脱水、石蜡包埋、切片和封片3,15。
	<ol>
		<li>通过将 40 g 多聚甲醛（PFA）溶解于 800 mL pH 7.4 的 Tris 缓冲盐水（TBS）中，配制 4% 甲醛溶液。</li>
		<li>在通风橱中于 60 °C 下搅拌混合物，直至 PFA 完全溶解。将溶液冷却至室温（RT），并用 TBS 定容至 1,000 mL。</li>
		<li>调节 pH 至 7.4。4 °C 下可保存 2–3 周，或 −20 °C 下保存长达 1 年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行样本固定时，将新鲜组织置于 TBS 缓冲液中，切成小于 20 mm × 30 mm × 3 mm 的小块。将组织块浸入 4% 多聚甲醛溶液中固定 12–24 小时。 
	&#8203;注意：原始方案使用 2% PFA 溶液，固定时间为 8–20 小时。但采用该方法时，部分组织在 20 小时后仍未完全固定，因此将 PFA 浓度提高至 4%。</li>
	<li>将样本转移至已标记的组织处理盒中。使用耐溶剂的记号笔或铅笔进行标记。</li>
	<li>开始样本脱水：先将组织盒浸入 70% 乙醇中 1 小时，随后依次浸入 80% 乙醇、90% 乙醇、96% 乙醇，并两次浸入 100% 乙醇，每步持续 1 小时。</li>
	<li>依次两次浸入 100% 二甲苯（二甲基苯），再两次浸入 60 °C 石蜡中，每次 1 小时。</li>
	<li>使用包埋模具进行包埋，待石蜡完全凝固后取出模具。</li>
	<li>使用切片机切割厚度为 3 µm 的组织切片。</li>
	<li>用镊子将切下的组织片放入 37 °C 水浴中，使其漂浮于水面以展平组织切片。</li>
	<li>将组织片转移至防脱玻片（材料表）上，并在 40 °C 烘箱中过夜干燥。</li>
</ol>
2. 样品复水
<ol>
	<li>脱蜡时，将切片置于切片架中，先后浸入柠檬烯（一种二甲苯替代介质）（材料表）中两次，每次5分钟，再浸入1:1的柠檬烯/乙醇混合液中5分钟。 
	注意：柠檬烯在50 °C时具有可燃性，并可能引起过敏反应。操作时应在通风橱内进行，并佩戴护目镜和手套。远离明火。</li>
	<li>通过将切片架依次浸入递减浓度的乙醇系列中进行再水化：分别在100%乙醇中浸入两次，以及在96%乙醇、90%乙醇、80%乙醇和70%乙醇中各浸入5分钟。</li>
	<li>将切片架浸入去离子水（DI水）中5分钟，以去除残留的乙醇。</li>
</ol>
3. 自体荧光阻断与抗原修复
<ol>
	<li>配制 pH 6 枸橼酸抗原修复溶液（TRS）（材料表根据说明书操作。该TRS缓冲液为10倍浓缩液，因此需用去离子水1:10稀释。将稀释后的缓冲液置于塑料染色缸中，预热至96 °C。 
	注意：TRS 可断裂样本固定过程中形成的亚甲基桥，从而暴露抗原表位，使一抗能够结合其靶向抗原。浓缩的 TRS 应在 2–8 °C 下保存，可稳定 8 个月。请始终新鲜配制 TRS。</li>
	<li>从载物片架中取出载物片，放入湿盒中。用移液器加入一到两滴自发荧光减少剂（材料表) 加入每个样本中，孵育5分钟。 
	注意：自发荧光淬灭剂可阻断由内源性荧光物质和固定剂引起的组织自发荧光。将自发荧光淬灭剂在室温下保存，最长可达1年。 
	注意：仅处理小块组织样本，以避免样本干燥或超出孵育时间。</li>
	<li>将切片重新放回切片架中，用60%乙醇以向上和向下的动作冲洗1分钟，直至洗去所有未使用的自发荧光减少试剂。</li>
	<li>将载玻片架浸入去离子水中 5 分钟。</li>
	<li>进行抗原修复时，将切片转移至含有预热TRS的染色缸中，在96 °C水浴中孵育10分钟。 
	注意：如果将 TRS 预热至 96 °C，并确保在 96 °C 下孵育 10 分钟，可用微波炉或蒸汽 cooker 替代 96 °C 水浴。</li>
	<li>将染色缸取出，静置并缓慢冷却至室温，约需60-90分钟。 
	注意：此处可暂停实验流程，将载玻片置于TRS中，暂停时间最长可达4小时。</li>
	<li>移除 TRS，但将切片保留在染色缸中。用含 0.05% Tween 的 Tris 缓冲盐水（TBST，pH 7.4）清洗两次，每次 3 分钟，以去除残留的 TRS。</li>
	<li>为进行透化处理，配制含0.2% Triton的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），倒入染色缸中，将样本透化处理10分钟。 
	注意：透化处理可增强固定样本中一抗与细胞内靶蛋白的结合。</li>
	<li>再次用TBST将载玻片清洗两次，每次3分钟。</li>
	<li>准备湿盒并放置载玻片。用纸巾擦去载玻片上多余的水分。使用疏水屏障笔在每个样本周围画圈，以防止抗体溶液流失。 
	注意：切勿让样品干燥。最好分小区域进行操作。</li>
</ol>
4. 封闭非特异性抗体结合
<ol>
	<li>取即用型含驴血清的封闭液（材料表），每张样本滴加一滴。室温孵育30分钟。 
	注意：该封闭步骤可最大限度减少二抗与样本上非特异性结合位点的结合。在封闭这些非特异性表位并加入一抗后，二抗将仅与一抗结合，而不会与组织表面发生非特异性相互作用。该即用型封闭试剂应于2-8 °C保存，可稳定保存6个月。</li>
	<li>通过轻敲玻片边缘接触硬物表面的方式去除玻片上多余的封闭液。切勿冲洗。</li>
</ol>
5. 一抗
<ol>
	<li>在抗体稀释缓冲液中稀释一抗（材料表）。每个样本使用约 100 µL 的终溶液。针对 NE 和 H3cit（R8）抗体&#160;和同型对照一起，稀释至浓度为5 µg/mL。用于MPO&#160;和&#160;相应的同型对照，使用 10 µg/mL。每种一抗和每种同型对照抗体各准备一个离心管。 
	注意：H3cit (R8)/MPO 或 NE/MPO 及其同型对照可用于 NETs 染色的联合标记。对于 H3cit (R8)/MPO 的联合使用，将 H3cit (R8) 稀释至终浓度为 5 µg/mL，MPO 稀释至终浓度为 10 µg/mL&#160;每个样本最终体积为100 µL。对于NE/MPO，将NE稀释至终浓度为5 µg/mL，MPO稀释至终浓度为10 µg/mL，每个样本最终体积为100 µL。对于&#160;isocontrol，使用与每种相应抗体相同的浓度。每种抗体均须使用新的移液器吸头。一抗&#160;抗体可在 4 °C 下保存 1 至 2 周，或在 −20 °C 或 −80 °C 下保存长达 1 年。</li>
	<li>一张载玻片上放置两个样本，一个用于同型对照抗体，另一个用于MPO/H3cit或MPO/NE抗体稀释液。每个样本使用约100 µL，均匀铺布抗体溶液。 
	注意：切勿让样本干燥。注意避免混淆同型对照抗体和一抗。</li>
	<li>4 °C 湿润环境中避光孵育过夜。</li>
	<li>次日，从载玻片上轻轻倾去多余的初级抗体溶液，并将载玻片叠放于比色皿中。用 TBST 缓冲液冲洗三次，每次 5 分钟，以洗去残留的初级抗体溶液。</li>
</ol>
6. 二抗
<ol>
	<li>配制二抗溶液。使用两种不同的荧光二抗：MPO 染色使用驴抗山羊二抗，H3cit 染色使用驴抗兔二抗。用抗体稀释缓冲液将每种二抗稀释至 7.5 µg/mL 的浓度（材料表）。 
	注意：进行双重染色时，应选用激发波长区域不同且光谱重叠最小的两种荧光二抗。将两种二抗混合后共同稀释，使每种抗体的终浓度均为 7.5 µg/mL，每份样本使用 100 µL。避免光照。二抗溶液可在 2–8 °C 保存 6–8 周，或在 −80 °C 保存长达 1 年。</li>
	<li>将载玻片保留在湿盒中，每份样本上加 100 µL 二抗溶液。室温避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>轻拍去除多余的二抗溶液，将载玻片放入染色架中。将染色架浸入盛有 PBS 的染色缸中，每次 5 分钟，共洗涤 3 次，以去除未结合的抗体。</li>
	<li>配制 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（材料表），用去离子水稀释至 1 µg/mL 的浓度。将染色架浸入含 DAPI 溶液的染色缸中，室温避光孵育 5 分钟。 
	注意：DAPI 是一种用于双链 DNA 的荧光染料。配制好的 DAPI 溶液可多次使用。将配制好的 DAPI 溶液于室温保存。DAPI 原液可在 −20 °C 保存长达 1 年。</li>
	<li>将染色架浸入含 PBS 的染色缸中 5 分钟，以洗去多余的 DAPI 溶液。</li>
</ol>
7. 样品的封片与保存，显微镜分析
<ol>
	<li>使用盖玻片和封片剂（材料表）对样本进行封片。 
	注意：仅使用少量封片剂，并用湿润的纸巾擦去多余的封片剂。佩戴手套，避免意外将封片剂从盖玻片或载玻片上擦除。避免产生气泡，可使用棉签轻轻按压盖玻片以去除载玻片中的气泡。</li>
	<li>成像时，使用宽场显微镜或共聚焦显微镜。 
	注意：首先拍摄同型对照（isocontrol）的图像。降低荧光滤光片的曝光时间（DAPI 的蓝色滤光片除外），直至几乎检测不到信号。然后使用此设置检查相应的样本。在每个单独样本中，使用荧光通道寻找可检测到荧光信号的区域。拍摄该区域图像后，程序将生成所有通道的复合图像，并以不同颜色重叠的方式显示不同的荧光信号。随后可使用 ImageJ 等成像软件对图像进行共定位分析。</li>
	<li>将载玻片在 4 °C 下保存，最长可达 6 个月。</li>
</ol>

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin%2C+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639(2009).</li>
<li>Abu Abed, U., Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+labelling+of+human+and+murine+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e60115(2019).</li>
<li>Kawasaki, H., Iwamuro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+roles+of+histones+in+host+defense+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disorders+-+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents.</a> Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).</li>
<li>Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+anti-Aspergillus+defense+by+neutrophil+extracellular+traps+in+human+chronic+granulomatous+disease+after+gene+therapy+is+calprotectin-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).</li>
<li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+neutrophil+extracellular+trap+degradation+is+associated+with+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).</li>
<li>Papadaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+exacerbate+Th1-mediated+autoimmune+responses+in+rheumatoid+arthritis+by+promoting+DC+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation.</a> European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).</li>
<li>Toussaint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+DNA+released+by+NETosis+promotes+rhinovirus-induced+type-2+allergic+asthma+exacerbation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation.</a> Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA+traps+promote+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA traps promote thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).</li>
<li>Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation.+Neutrophil+extracellular+traps+license+macrophages+for+cytokine+production+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis.</a> Science. 349 (6245), 316-320 (2015).</li>
<li>Schauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+limit+inflammation+by+degrading+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines.</a> Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).</li>
<li>Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantitation+of+neutrophil+extracellular+traps+in+human+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22BioProtocol%22%5BJournal%5D)">Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections.</a> BioProtocol. 11 (18), e4159(2021).</li>
<li>de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713(2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+NETs+in+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs+detection+and+quantification+in+paraffin+embedded+samples+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy.</a> Micron. 114, 1-7 (2018).</li>
<li>Savchenko, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+form+predominantly+during+the+organizing+stage+of+human+venous+thromboembolism+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).</li>
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<li>Thålin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histones%3A+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li>
<li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+Mechanisms+and+application+to+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Smyth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-vascular+interactions+drive+myeloperoxidase+accumulation+in+the+brain+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38(2022).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).</li>
<li>Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+autofluorescence+quenching+techniques+on+formalin-fixed+chicken+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues.</a> Journal of Immunological Methods. 496, 113097(2021).</li>
<li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVIG+regulates+the+survival+of+human+but+not+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1296(2017).</li>
<li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+antimicrobial+peptides%3A+Multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们旨在将现有的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）成像方案优化并适配于更多类型的组织，首先从实际染色步骤开始。该方法的第一个关键步骤是选择最合适的抗体。针对中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），我们尝试使用来自小鼠宿主的抗人组织NE抗体，但其染色效果与兔源抗体相比缺乏可靠性。此外，Thålin 等人提出H3cit (R8) 抗体在细胞外染色方面具有更高的特异性。我们将该抗体与广泛使用的三重瓜氨酸化组蛋白H3抗体（triH3cit, R2、R8、R17）进行了比较。我们的研究结果显示，在所用浓度下，H3cit (R8) 抗体仅产生细胞外信号，从而更易于在切片上识别NETs。该结果支持了Thålin 等人的观点，即H3cit (R8) 克隆抗体可在降低非瓜氨酸化组蛋白脱靶交叉反应的同时，提供良好的NET信号28。我们还比较了用于人和小鼠组织MPO染色的MPO抗体。结果表明，该小鼠/人共用MPO抗体染色更可靠，且可同时用于人和小鼠样本，简化了实验室中的使用流程。因此，我们推荐在今后的研究中采用H3cit (R8) 与小鼠/人MPO抗体的组合，并已将其纳入我们的实验方案中。
<p cla...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated from:
Lavinia Sch&#246;enfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）最早由 Brinkmann 等人在 2004 年被观察到，是一种不同于凋亡和坏死的细胞死亡途径1。在此过程中，中性粒细胞将其去浓缩的染色质释放到细胞外空间，形成覆盖有抗菌蛋白的大型网状结构，这些抗菌蛋白此前储存在颗粒或细胞质中。这些抗菌蛋白包括中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、髓过氧化物酶（MPO）和瓜氨酸化组蛋白 H3（H3cit），它们通常用于 NETs 的间接免疫荧光检测2。该方法不仅能识别这些蛋白的定量存在，其优势还在于可特异性地检测 NET 样结构。在 NETs 中，上述蛋白与细胞外 DNA 共定位，可通过每种染色蛋白与细胞外 DNA 的荧光信号重叠来检测。与 NETs 中因细胞外 DNA 与蛋白共定位而产生的信号重叠不同，完整的中性粒细胞不显示共定位现象；在此类细胞中，NET 组分通常分别储存在颗粒、细胞核和细胞质中3。
自从首次发现以来，研究已表明中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在多种疾病中发挥核心作用，尤其是涉及炎症的疾病。在感染过程中，NETs通过在血液和组织中捕获并杀灭细胞外病原体而表现出抗菌功能4,5。然而，NETs也与自身免疫性疾病和过度炎症反应相关，例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和过敏性哮喘6,7,8。NETs可促进动脉粥样硬化中的血管阻塞和炎症、血小板黏附，并被认为在转移性癌症中发挥作用9,10,11。尽管如此，有研究认为NETs具有抗炎特性，可通过降低促炎细胞因子水平实现这一作用12。随着NETs在更广泛研究领域中受到越来越多关注，建立可靠的NET检测方法对今后的研究至关重要。
尽管使用免疫荧光成像技术在不同组织中观察中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）较为复杂且需要定制化操作，但除电子显微镜外，该方法目前仍是可视化NETs与细胞相互作用的最著名方法之一，主要应用于福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）13,14。然而，由于不同实验室采用各自定制的实验方案，NETs成像结果的比较十分困难。这些方案在抗体选择、抗原修复或通透化方法上存在差异，且通常针对特定类型的组织进行优化3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27。
在 Brinkmann 等人发表首项利用免疫荧光法在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中可视化中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法学研究后，我们希望优化该方案，以适用于更多种类的组织和物种15此外，为了建立一种广泛适用的免疫荧光实验方案，我们测试了多项来自使用免疫荧光方法在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中检测中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的研究中的改良方案。3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27此外，我们尝试使用了一种新的H3cit抗体，以实现更特异的细胞外染色28我们假设，通过系统地将现有染色方案针对不同物种和组织进行优化调整， 体外 成像效果可得到改善，从而更准确地呈现中性粒细胞与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在局部和全身范围内的相互作用。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&lt;strong&gt;稀释比例&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>抗中性粒细胞弹性蛋白酶抗体 100&amp;micro;g</td><td>abcam</td><td>Ab 68672&amp;nbsp;</td><td>1:100</td></tr><tr><td>抗组蛋白 H3（瓜氨酸化 R2 + R8 + R17）抗体&amp;nbsp; 100&amp;micro;g</td><td>abcam</td><td>Ab 5103</td><td>1:50</td></tr><tr><td>抗髓过氧化物酶抗体 [2C7] 抗人 100 &amp;micro;g</td><td>abcam</td><td>Ab 25989</td><td>1:50</td></tr><tr><td>抗髓过氧化物酶抗体 [2D4] 抗小鼠 50 &amp;micro;g</td><td>abcam</td><td>Ab 90810</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Axiovision 显微镜软件&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>含驴血清的封闭液（即用型）50ml</td><td>GeneTex</td><td>&amp;nbsp;GTX30972</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Marienfeld</td><td>0101202</td><td></td></tr><tr><td>Dako Citrate pH6 抗原修复液（10倍浓缩）</td><td>Dako</td><td>S2369</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 25 mg</td><td>Roth</td><td>6335.1</td><td>1:25000</td></tr><tr><td>DCS 抗体稀释液 500 mL</td><td>DCS diagnostics</td><td>DCS AL120R500</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊 Cy3</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>705-165-147</td><td>1:200</td></tr><tr><td>驴抗兔 AF647</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>1:200</td></tr><tr><td>驴抗兔 Cy3</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片介质</td><td>Invitrogen</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>玻璃载片架</td><td>Roth</td><td>H552.1</td><td></td></tr><tr><td>人/小鼠 MPO 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF 3667&amp;nbsp;</td><td>1:20</td></tr><tr><td>疏水笔</td><td>KISKER</td><td>MKP-1</td><td></td></tr><tr><td>兔 IgG 多克隆同型对照 5mg</td><td>abcam</td><td>Ab 37415</td><td>1:2000 和 1:250</td></tr><tr><td>MaxBlock 自发荧光抑制试剂盒（RUO）100 ml</td><td>Maxvision</td><td>MB-L</td><td></td></tr><tr><td>显微成像相机</td><td>Zeiss</td><td>AxioCamHR3</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Bosch</td><td>HMT84M421</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 阴性对照</td><td>Dako</td><td>X0931 Aglient</td><td>1:50 和 1:5</td></tr><tr><td>正常山羊 IgG 对照</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AB-108-C&amp;nbsp;</td><td>1:100</td></tr><tr><td>PBS 磷酸盐缓冲液（10倍浓缩）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3813</td><td></td></tr><tr><td>PMP 染色缸</td><td>Roth</td><td>2292.2</td><td></td></tr><tr><td>重组抗组蛋白 H3（瓜氨酸化 R8）抗体 100&amp;micro;g</td><td>abcam</td><td>Ab 219406</td><td>1:100</td></tr><tr><td>重组兔 IgG 单克隆抗体 [EPR25A] - 同型对照 200&amp;micro;g</td><td>abcam</td><td>Ab 172730</td><td>1:300</td></tr><tr><td>ROTI Histol</td><td>Roth</td><td>&amp;nbsp;6640</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 载玻片</td><td>R. Langenbrinck</td><td>03-0060</td><td></td></tr><tr><td>TBS Tris 缓冲盐水（10倍浓缩）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Memmert</td><td>830476</td><td></td></tr><tr><td>水浴电饭锅</td><td>reishunger</td><td>RCP-30</td><td></td></tr><tr><td>湿盒</td><td>Weckert Labortechnik</td><td>600016</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 宽场显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr></tbody></table>

人和小鼠组织中中性粒细胞胞外诱捕网的免疫荧光成像

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）由中性粒细胞在应对细菌感染或创伤性组织损伤时释放，不仅在抗微生物防御中发挥作用，也参与自身免疫性疾病和无菌性炎症过程。NETs 是由双链 DNA 纤维、组蛋白和抗菌蛋白构成的网状结构。释放后，NETs 可在血液和组织中捕获并杀灭胞外病原体。此外，NETs 还可通过促进血小板黏附和凝血参与机体稳态调节。然而，NETs 的异常生成也与多种疾病相关，包括脓毒症和自身免疫性疾病，使其成为潜在的治疗干预靶点。除电子显微镜外，免疫荧光成像目前是唯一已知可用于展示组织中 NETs 相互作用的可视化方法。因此，已有多种染色方法被用于 NETs 的可视化研究。文献中报道了不同的染色方案，我们归纳出四种在不同方案间存在显著差异的关键组分：（1）所用抗体的类型，（2）自发荧光抑制剂的使用，（3）抗原修复方法，（4）通透处理。 体外 免疫荧光染色方案在本研究中被系统性地调整和优化，以适用于不同物种（小鼠、人）及多种组织（皮肤、肠道、肺、肝、心脏、椎间盘）。固定并经石蜡包埋后，将厚度为3 µm的切片置于载玻片上。根据改良的染色方案，使用针对髓过氧化物酶（MPO）、瓜氨酸化组蛋白H3（H3cit）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的一抗对样本进行染色。载玻片经二抗染色后，采用宽场荧光显微镜观察。结果依据评估表进行分析，并以半定量方式记录差异。
本文介绍了一种适用于多种组织的优化中性粒细胞胞外诱捕网（NET）染色方案。我们采用了一种新型的一抗对瓜氨酸化组蛋白H3（H3cit）进行染色，并使用减少自发荧光的试剂降低了非特异性染色。此外，我们证明了NET染色需要持续的高温条件，并且必须对样本进行谨慎处理。

在开始优化实验方案之前，我们通过在PubMed中检索使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）免疫染色的研究，比较其方案，从而确定成功染色的关键步骤。其中差异最显著且具有潜力的方案步骤被确定为优化的重点，而各研究间基本一致的步骤则未作改动（表1）。
表1：关于NETs的FFPE免疫染色的PubMed研究。 本表展示了所分析研究中免疫染色方案的各项变量。所使用的方案被分解为基本步骤，然后相互比较。其中差异最显著且具有优化潜力的步骤被确定为关键优化步骤，并据此调整至我们的实验方案中。对于各研究间基本一致的步骤则未作改动，例如一抗孵育时间（4 °C过夜）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65272/Table%201%20PubMed%20Research.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
根据我们的研究结果，我们得出结论：选择针...

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）与多种疾病相关，通常使用免疫荧光法对其进行可视化观察。然而，目前存在多种染色方案，且多数情况下仅针对单一类型的组织进行检测。本文中，我们建立了一种适用于小鼠和人类组织中NETs染色的通用方案。

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）由中性粒细胞释放，作为对细菌感染或创伤性组织损伤的反应，但也参与……

在组织成像的抗体选择中，固定过程会因表位遮蔽而带来挑战。因此，需要定制的抗原修复步骤以暴露这些抗原，便于抗体结合。此外，组织固有的自发荧光可能导致背景染色过高，从而造成检测困难。然而，文献中不同实验方案采用的方法各异，这阻碍了图像之间的标准化比较。本研究旨在满足对标准化操作流程的需求，并帮助研究人员克服成像过程中的各种挑战。通过比较多种不同的实验方案，我们建立了一种适用于不同组织的通用成像流程。因此，我们的工作从抗体使用到样本封片提供了指导和故障排除建议，并指出了潜在的陷阱。我们的研究通过引入一种针对瓜氨酸化组蛋白三的新的一抗以及一种自体荧光还原剂以减少背景染色，推动了相关领域的进展。此外，为了实现成功的成像，我们强调了对样本的谨慎操作以及在抗原修复过程中维持恒定高温的重要性。首先，根据制造商说明书配制 pH 为 6 的 10 倍浓缩柠檬酸盐抗原修复溶液（citrate target retrieval solution，TRS）。用去离子水按 1:10 的比例稀释该溶液。然后将溶液置于塑料染色缸中，加热至 96 °C。将载玻片从载玻片架中取出，放入湿盒中。随后用移液器向每个组织样本上滴加一至两滴自发荧光抑制剂，并将样本孵育5分钟。将载玻片重新叠放回载玻片架中，用上下移动的方式在60%乙醇中冲洗1分钟，以去除未反应的自发荧光抑制剂，然后将载玻片架浸入去离子水中5分钟。将切片放入盛有预热TRIS缓冲液的染色缸中进行抗原修复。在96摄氏度的水浴中孵育切片10分钟。取出染色缸，室温冷却约60至90分钟。接下来，在保留切片于染色缸中的同时移除 TRS。用含 0.05% Tween 的 pH 7.4 Tris 缓冲盐水冲洗切片两次，每次三分钟，以去除残留的 TRS。将切片置于湿盒中，用纸巾轻轻擦去切片上多余的水分。然后使用疏水屏障笔在每个样本周围画圈，防止抗体溶液溢出。首先，用移液器吸取一滴即用型含驴血清的封闭液，滴加到组织样本上。然后在室温下孵育30分钟，通过轻触载玻片边缘接触硬物表面的方式去除多余的封闭液。将一抗用抗体稀释缓冲液稀释，为每个样本配制100微升的终末溶液。为每种一抗以及每种同型对照抗体分别准备抗体管。将100 µL同型对照抗体均匀滴加至一个样本，将100 µL髓过氧化物酶与瓜氨酸化组蛋白H3抗体稀释液或髓过氧化物酶与中性粒细胞弹性蛋白酶抗体稀释液滴加至另一样本。将玻片置于湿盒中，并在4°C下孵育过夜。次日，从载玻片上轻轻去除多余的初级抗体溶液，并将载玻片叠放在比色皿中。使用含吐温的三羟甲基氨基甲烷盐水缓冲液（trisespa saline with tween）冲洗载玻片三次，每次五分钟，以去除残留的初级抗体溶液。制备两种具有不同荧光标记的二抗。用于髓过氧化物酶的驴抗小鼠二抗，以及用于瓜氨酸化组蛋白H3染色的驴抗兔二抗。用抗体稀释缓冲液将每种抗体稀释至7.5 微克/毫升的浓度。将切片置于湿盒中，并在每个样本上加入100 微升二抗溶液。避光、室温孵育30分钟。轻拍玻片以去除多余的二抗溶液。将玻片放入玻片架中，置于盛有PBS的染色缸内，浸泡洗涤三次，每次5分钟，以洗去未结合的抗体。配制 DAPI 溶液，并用去离子水将其稀释至浓度为 1 微克/毫升。将载玻片拖片浸入含有 DAPI 溶液的染色缸中，在室温避光条件下孵育 5 分钟。随后，将载玻片拖片浸入 PBS 溶液的染色缸中，洗涤 5 分钟，以去除多余的 DAPI 溶液。最后，使用盖玻片和封片介质封固样本。瓜氨酸化组蛋白 H3 抗体仅与细胞外组蛋白结合，未显示细胞内组蛋白的染色。人或小鼠特异性髓过氧化物酶抗体未显示特异性染色。尽管通用的人源和鼠源抗体对髓过氧化物酶均显示出稳定且良好的染色效果，但在未使用封闭剂时，部分小鼠样本出现了更多的非特异性及部分阳性染色。经封闭处理后，与10分钟封闭时间相比，5分钟封闭时间显示出较好的结果。微波和水浴中的较高温度显示出稳定且中等至良好的抗原修复效果。而在60摄氏度的水浴中，仅出现部分阳性至无染色的结果。对于双重染色，96摄氏度水浴孵育的样本获得了更理想的结果，然而，在96摄氏度下孵育时间超过40分钟会导致抗体染色强度降低。

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