Name: 基于连续数字光处理的印刷中液体光敏生物墨水特性的定量表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: 学习连续数字光处理3D生物打印技术，通过温度控制和材料组成优化生物墨水的屈服应力特性，实现软组织工程支架的高效精准打印，为临床应用提供理论支持。

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作者衷心感谢国家自然科学基金（项目编号：12125205、12072316、12132014）和中国博士后科学基金（项目编号：2022M712754）提供的资助。

1. 理论准备
<ol>
	<li>定义三个参数：液体吸光度（Al）、固体吸光度（As）和阈值时间（tT）17。</li>
	<li>根据公式1，使用这三个参数重写传统的雅各布工作曲线17： 
	<img alt="化学动力学中的静态平衡方程；数学图示中的公式。" src="/files/ftp_upload/65277/65277eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式1">     (公式1) 
	其中，tH 表示单层的固化时间，H 表示单层的高度。</li>
</ol>
2. 参数获取
<ol>
	<li>使用配备温度控制元件的流变仪测量生物墨水的阈值时间。
	<ol>
		<li>使用365 nm光源照射流变仪的测试平台，并将光强调节至某一特定值。</li>
		<li>将流变仪设置为获取 时间-模量 在300秒的时间段内采集数据，每隔0.3秒获取一个数据点 时间设置 流变仪软件中的选项。点击 开始测试 启动流变仪的按钮开始测试，同时单击 开始按钮 光源的</li>
		<li>从暴露开始计时，当储能模量数据等于损耗模量数据时，对应的时间即为阈值时间。手动记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前研究所示的方式搭建吸光度测试装置17. 用上下两片玻璃载玻片夹紧环形打印结构（内径 5 mm，外径 10 mm），其厚度为 500µm 使环的内圈形成一个腔室。将腔室置于光强计的测试区域，并调节光源以照射腔室区域。 
	注意： 图1 展示了光流变测试结果及数据处理结果的示意图，以及吸光度测试设备。
	<ol>
		<li>测量入射光强度（Ii当测试室未被吸光度测试设备中的材料填充时，通过读取测试设备的光强计显示来判断。</li>
		<li>向测试室中注满 10 µLof 生物墨水</li>
		<li>将含有生物墨水的测试室暴露于365 nm的紫外光下。获取光强（Ilh通过读取检测设备上光强计的显示值，从吸光度测试仪器中获取数据。</li>
		<li>获取生物墨水固化时的光强（Ish) 从吸光度测试设备中读取光强计显示的数值，当该数值不再变化时记录结果。此数值即为固体吸光度 Ish.</li>
		<li>使用公式 2 和公式 3 计算液体吸光度和固体吸光度： 
		<img alt="光谱分析吸收公式 \(A_l = \frac{1}{h} \cdot \ln(\frac{I_{lh}}{I_i})\)" src="/files/ftp_upload/65277/65277eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2">     公式 2 
		<img alt="吸光度方程示意图，As=1/h·ln(Ish/Ii)，用于说明光吸收原理。" src="/files/ftp_upload/65277/65277eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3">     公式 3</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据获得的参数获取 Jacobs 工作曲线。</li>
</ol>
<img alt="紫外光吸收实验；图表：储能/损耗模量随曝光变化；装置：紫外光、玻璃。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65277/65277fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：测试结果与设备。（A）光流变测试结果及数据处理结果的示意图。（B）吸光度测试设备。本图已获 Li 等人17 许可修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65277/65277fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 连续DLP打印参数设置
<ol>
	<li>使用 DLP 软件实现 DLP 打印，并在软件中设置以下打印参数。</li>
	<li>在软件的参数设置中，将首层单层的曝光时间设为阈值时间（tT）。
	<ol>
		<li>根据公式 1 计算固化 10 µm 厚材料所需的曝光时间，并从该时间中减去阈值时间，得到固化单层的实际曝光时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在软件的参数设置中，将相邻层之间的时间间隔设为 0 s。</li>
	<li>在打印软件中点击 开始 按钮启动打印机。当打印过程结束后，点击打印软件中的 停止 按钮完成打印。</li>
</ol>

Quantitative Characterization of Bioink Properties for Continuous DLP Printing

<ol><li>Berthiaume, F., Maguire, T. J., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+regenerative+medicine%3A+history%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Chemical+and+Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and regenerative medicine: history, progress, and challenges.</a> Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 2 (1), 403-430 (2011).</li>
<li>Ng, W. L., Chua, C. K., Shen, Y. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Print+me+an+organ%21+Why+we+are+not+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Print me an organ! Why we are not there yet.</a> Progress in Polymer Science. 97, 101145(2019).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioprinting+roadmap%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">The bioprinting roadmap.</a> Biofabrication. 12 (2), 022002(2020).</li>
<li>Jiang, T., Munguia-Lopez, J. G., Flores-Torres, S., Kort-Mascort, J., Kinsella, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrusion+bioprinting+of+soft+materials%3A+An+emerging+technique+for+biological+model+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Extrusion bioprinting of soft materials: An emerging technique for biological model fabrication.</a> Applied Physics Reviews. 6 (1), 011310(2019).</li>
<li>Ng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.cControlling+droplet+impact+velocity+and+droplet+volume%3A+Key+factors+to+achieving+high+cell+viability+in+sub-nanoliter+droplet-based+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">L.cControlling droplet impact velocity and droplet volume: Key factors to achieving high cell viability in sub-nanoliter droplet-based bioprinting.</a> International Journal of Bioprinting. 8 (1), 424(2021).</li>
<li>Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printability+during+projection-based+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Printability during projection-based 3D bioprinting.</a> Bioactive Materials. 11, 254-267 (2022).</li>
<li>Zhong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+of+dual+ECM+scaffolds+encapsulating+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+active+and+quiescent+statuses%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Bioprinting of dual ECM scaffolds encapsulating limbal stem/progenitor cells in active and quiescent statuses.</a> Biofabrication. 13 (4), (2021).</li>
<li>Huh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinations+of+photoinitiator+and+UV+absorber+for+cell-based+digital+light+processing+%28DLP%29+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Combinations of photoinitiator and UV absorber for cell-based digital light processing (DLP) bioprinting.</a> Biofabrication. 13 (3), (2021).</li>
<li>Saed, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+poly+l-lactic+acid+synthesis+and+optimization+of+process+parameters+for+3D+printing+of+porous+scaffolds+via+digital+light+processing+%28DLP%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Manufacturing+Processes%22%5BJournal%5D)">Functionalized poly l-lactic acid synthesis and optimization of process parameters for 3D printing of porous scaffolds via digital light processing (DLP) method.</a> Journal of Manufacturing Processes. 56, 550-561 (2020).</li>
<li>Ng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vat+polymerization-based+bioprinting-process%2C+materials%2C+applications+and+regulatory+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Vat polymerization-based bioprinting-process, materials, applications and regulatory challenges.</a> Biofabrication. 12 (2), 022001(2020).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+and+high-efficiency+additive+manufacturing+using+tunable+pre-curing+digital+light+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Additive+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">High-fidelity and high-efficiency additive manufacturing using tunable pre-curing digital light processing.</a> Additive Manufacturing. 30, 100889(2019).</li>
<li>Kelly, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+additive+manufacturing+via+tomographic+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Volumetric additive manufacturing via tomographic reconstruction.</a> Science. 363 (6431), 1075-1079 (2019).</li>
<li>Tumbleston, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+liquid+interface+production+of+3D+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Continuous liquid interface production of 3D objects.</a> Science. 347 (6228), 1349-1352 (2015).</li>
<li>Classens, K., Hafkamp, T., Westbeek, S., Remmers, J. J. C., Weiland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphysical+modeling+and+optimal+control+of+material+properties+for+photopolymerization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Additive+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">Multiphysical modeling and optimal control of material properties for photopolymerization processes.</a> Additive Manufacturing. 38, 101520(2021).</li>
<li>Gong, H., Beauchamp, M., Perry, S., Woolley, A. T., Nordin, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+approach+to+resin+formulation+for+3D+printed+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Optical approach to resin formulation for 3D printed microfluidics.</a> RSC Advances. 5 (129), 106621-106632 (2015).</li>
<li>Hofstetter, C., Orman, S., Baudis, S., Stampfl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+cure+depth+and+cure+degree%2C+a+new+way+to+fully+characterize+novel+photopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Additive+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">Combining cure depth and cure degree, a new way to fully characterize novel photopolymers.</a> Additive Manufacturing. 24, 166-172 (2018).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+prediction+and+experimental+validation+of+the+digital+light+processing+%28DLP%29+working+curve+for+photocurable+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Additive+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">Theoretical prediction and experimental validation of the digital light processing (DLP) working curve for photocurable materials.</a> Additive Manufacturing. 37, 101716(2021).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+cleavable+bioinks+facilitate+high-performance+digital+light+processing-based+bioprinting+of+functional+volumetric+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecularly cleavable bioinks facilitate high-performance digital light processing-based bioprinting of functional volumetric soft tissues.</a> Nature Communications. 13 (1), 3317(2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案的关键步骤在第2节中进行了描述。在实际测试中，必须统一光流变测试所用的光强与打印时的光强。吸光度测试设备是最重要的部分。测试腔的形状应与光强计的感光区域相同。由于材料在整个紫外光照射过程中性质持续发生变化，光强也需要持续改变6。根据公式1中对液体吸光度和固体吸光度的定义，固化过程被简化。将曝光初期的数据作为液体吸光度，将光强趋于稳定时的数据作为固体吸光度，是该方法最关键的步骤。
值得注意的是，该方法存在一个不可避免的局限性，即对固化过程进行了简化。由于该方法的理论建模未考虑氧气抑制等因素13，实际工作曲线与理论工作曲线之间存在误差。此外，若外界干扰较大，则无法准确利用理论工作曲线开展研究。
传统上获取Jacobs工作曲线的方法需要多次以不同的曝光时间进行打印15。通过测量与各曝光时间相对应的打印厚度并拟合数据，可获得工作曲线。该方法消耗大量材料，效率极低。材料的可打印性限制了工作...

组织工程1在器官修复领域具有重要意义。由于器官捐献的缺乏，一些疾病（如肝衰竭和肾衰竭）难以得到有效治疗，许多患者无法及时获得救治2。具备目标器官功能的类器官有望解决器官捐献短缺所带来的问题。类器官的构建依赖于生物打印技术的进步与发展3。
与挤出式生物打印4和喷墨式生物打印5相比，数字光处理（DLP）生物打印方法的打印速度和打印精度更高6,7。挤出式方法的打印模块为逐行打印，而喷墨式方法为逐点打印，均不如DLP生物打印的逐层打印模块高效。在DLP生物打印中，通过调制紫外（UV）光对整层材料进行曝光以实现层固化，图像的特征尺寸决定了DLP打印的精度。这使得DLP技术具有很高的效率8,9,10。由于紫外光的过度固化，固化时间与打印尺寸之间的精确关系对于高精度DLP生物打印至关重要。此外，连续DLP打印是DLP打印方法的一种改进，可显著提高打印效率11,12,13。对于连续DLP打印而言，精确的打印条件是最关键的因素。
固化时间与打印尺寸之间的关系被称为Jacobs工作曲线，在DLP打印中被广泛应用14,15,16。传统获取该关系的方法是将材料曝光一定时间，然后测量固化厚度，从而获得一个关于曝光时间与固化厚度的数据点。重复此操作至少五次，并对所得数据点进行拟合，即可得到Jacobs工作曲线。然而，该方法存在明显缺点：需要消耗大量材料以实现固化，结果高度依赖于打印条件，DLP生物打印中所用的生物墨水通常价格昂贵且稀缺，且其成形性通常较差，可能导致固化厚度测量不准确。
本文提供了一种根据生物墨水物理特性获取固化关系的新方法。利用该理论可优化连续DLP打印，能够更快速、准确地获得固化关系，从而更精确地确定连续DLP固化参数。

<table><tbody><tr><td>亮蓝</td><td>阿拉丁（中国上海）</td><td>6104-59-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DLP 软件</td><td>Creation Workshop</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂</td><td></td><td>不适用</td><td>LAP；自行合成</td></tr><tr><td>光源</td><td>OmniCure</td><td>https://www.excelitas.com/product-category/omnicure-s-series-lamp-spot-uv-curing-systems</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>聚乙二醇二丙烯酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455008</td><td>PEGDA 分子量 ~700</td></tr><tr><td>流变仪&amp;nbsp;</td><td>Anton Paar，奥地利</td><td>MCR302</td><td></td></tr></tbody></table>

基于连续数字光处理打印的液态光敏生物墨水性能定量表征

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing

生物墨水的精确打印制备是组织工程的前提条件；Jacobs工作曲线是确定数字光处理（DLP）精确打印参数的工具。然而，获取工作曲线会浪费材料，并要求材料具有较高的成形能力，这并不适用于生物材料。此外，在传统DLP生物打印中，细胞活性因多次曝光而降低，以及因重复定位导致结构无法形成，都是不可避免的问题。本研究提出了一种获取工作曲线的新方法，并基于该工作曲线改进了连续DLP打印技术。该工作曲线的获取方法基于生物材料的吸光度和光流变特性，不依赖于生物材料的成形能力。通过分析工作曲线优化打印工艺所获得的连续DLP打印过程，使打印效率提高十倍以上，显著提升了细胞的活性与功能，有利于组织工程的发展。

本文介绍了一种获取固化参数的新方法，并提出了一种实现连续DLP打印的新途径，展示了该方法在确定工作曲线方面的高效性。
我们采用三种不同的材料进行DLP打印，以验证通过本文介绍的方法获得的理论工作曲线的准确性。这些材料为20% (v/v) 聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），0.5% (w/v) 氩基苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂（LAP），并添加不同浓度的紫外吸收剂——0.1% (w/v)、0.15% (w/v) 和 0.2% (w/v) 亮蓝。实际固化厚度数据与理论工作曲线如图2所示。
<img alt="显示厚度与曝光时间的关系图；理论曲线与实际数据点；实验 A、B、C。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65277/65277fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-...

本研究利用温度和材料组成来调控具有屈服应力流体的屈服应力特性。墨水的类固态可保护打印结构，而类液态则能持续填充打印位置，从而实现极软生物墨水的数字光处理三维打印。

精确打印生物墨水是组织工程的先决条件；雅各布工作曲线是确定精确打印参数的工具……

我的研究主要涉及DLP 3D生物打印和组织工程。我们尝试优化和改进DLP打印工艺及配方理论，使打印出的组织工程支架能更好地满足实际临床应用需求。现有光固化材料的打印条件依赖于人工实验，需通过多次实验的数据积累来确定。此类实验浪费材料并降低打印效率。我基于材料的物理特性，构建了理论工作曲线，并据此确定了材料的DLP打印金字塔。提出将动态流体浴概念应用于DLP打印，以实现极软材料复杂三维结构的DLP打印成型。该方法可提高确定光固化材料打印条件的效率。该技术可为光固化材料的研发及其精确打印提供技术支持。首先使用配备温度控制元件的流变仪测量生物墨水的阈值时间。使用365纳米光源照射流变仪的测试平台，并将光强设定为特定值。在流变仪软件中，进入时间设置选项，将流变仪设置为采集300个数据点的时间模量数据，每个数据点间隔0.3秒。点击流变仪软件上的“开始测试”按钮以启动测试。同时，点击光源的启动按钮。为计算阈值时间，记录从曝光开始到储能模量数据等于损耗模量数据时对应的时间。然后，使用上下玻璃片和环形打印结构搭建吸光度测试装置。将环夹在玻璃片之间，使环的内圈形成测试腔室。将腔室置于光强计的测试区域，并调节光源以照射腔室区域。当测试腔室中未加入吸光度测试设备的材料时，通过读取光强计的显示值来测量入射光强度 II。接下来，用10微升生物墨水填充测试室。将含有生物墨水的测试室暴露于365纳米的紫外光下。通过读取显示屏获得光强IIH。当光照强度计上的数值不再变化时，读取显示屏以获得生物墨水固化时的光照强度。该数值即为固体吸光度 ISH。要实现数字光处理（DLP）打印，首先使用 DLP 软件开始操作。在参数设置中，将第一层单层的曝光时间设为阈值时间。根据此公式计算固化厚度为10微米材料的曝光时间，并减去阈值时间，以获得固化单层的实际曝光时间。在软件的参数设置中，将相邻层之间的时间间隔设为0秒。通过单击打印软件中的“开始”按钮启动打印机。当打印过程结束后，单击“停止”按钮完成打印。本方案表明，连续DLP打印方法能够准确计算不同材料的理论工作曲线。在三种不同材料上观察到理论预测与实际打印结果之间具有高度一致性。与传统的DLP打印方法相比，该方法在降低打印层厚的同时，表现出打印效率的提升。此外，与传统DLP打印相比，固化效率提高了十倍，表明连续DLP打印方法能够同时实现高效率和高保真度。

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