Name: 拟南芥的高分辨率、单粒、体内花粉水合生物测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 了解拟南芥花粉水合的高分辨率单粒体内生物测定方法。该技术利用显微成像和图像分析软件精确测量花粉水合动态，为研究花粉-柱头互作和植物繁殖机制提供标准化工具。

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本研究得到了巴斯大学（University of Bath，英国巴斯，BA2 7AY）向 Y.-L.L. 和 L.W. 提供的研究生奖学金资助。图1 使用 BioRender.com（https://biorender.com/）制作。

1. 植物生长与花朵制备
<ol>
	<li>分层 A. thaliana 在0.1%琼脂糖或无菌水中放置种子，4℃处理3天 4 &#176;C，或作为干燥种子在 -20 &#176;C （uNASC，个人交流）</li>
	<li>将分层处理的种子转移至装有堆肥的花盆中，并置于环境可控的生长室中。使用荧光灯管提供16:8 h光暗周期进行植株培养。130 &#181;mol m-2 s-1）。将温度维持在 21 &#177; 2 &#176;C 相对湿度约为40%。</li>
	<li>确保花粉供体植株、受体植株以及任何其他适当的对照植株品系同时播种，以保证开花期同步。植株培养约6周，直至花序充分发育。</li>
	<li>在进行去雄生物测定前1天，选择受体植株上处于第12阶段的花蕾16,17- 这些是未开放的花蕾，将在次日完成开花及花药开裂18. 
	注意：避免使用主花序上最先产生的前三朵花，因为这些花通常表现出异常的生殖行为。如果研究需要且条件允许，可使用雄性不育植株品系，例如 A. thaliana （生态型Col-0）pA9-barnase株系，其中花药无法正常成熟19.</li>
	<li>将接受花粉的植株连同花盆一起侧放，以去雄。用胶带将植株茎部靠近待去雄花朵的区域固定于置于体视解剖显微镜下的玻璃载片上。</li>
	<li>使用一对尖头镊子，小心地将花蕾轻轻拨开，去除所有花瓣和雄蕊。确保雌蕊未受损伤，且柱头上无污染花粉。 
	注意：雄性不育植株品系无需去雄。</li>
	<li>将植株放回生长室，并确保去雄的花朵不与其他植物或外来物体接触。</li>
</ol>
2. 花粉水合实验——原始数据采集
<ol>
	<li>次日早晨，将植物从生长室中取出。将接受花粉的植物侧放，并将其花朵置于倒置显微镜的载物台上（图2），以便清晰成像柱头。</li>
	<li>使用遮蔽胶带将茎固定在载玻片上，以固定待成像花朵的位置。保持温度在 18 °C 至 25 °C 之间，相对湿度低于 60%。 
	注：对于 pA9-barnase 雄性不育植株系，最佳检测时间是在早晨花朵开放时进行，此时花瓣不会遮挡视野。</li>
	<li>随后，从提供花粉的植株上取下一朵健康且刚开放的花朵。将其置于解剖显微镜下，用洁净的细尖镊子轻轻接触花药，收集少量花粉粒（图3A）。将一根睫毛粘在短棒上，也可有效用于花粉的采集与转移（图3C）。</li>
	<li>通过将镊子轻触采集花粉时所用花朵的花瓣，去除多余的花粉，直至镊子尖端形成单层花粉粒。 
	注：在细尖镊子尖端形成单层花粉粒将显著有助于后续步骤中单粒花粉的转移。使用该技术也可实现仅保留单个花粉粒于镊子上（补充视频 S1）。</li>
	<li>返回至接受花粉的植株，使用低倍物镜（例如 10x 物镜；图3B），将倒置显微镜聚焦于待授粉的柱头。</li>
	<li>握住镊子的开口臂之间部分（图4），小心接近未授粉（“处女”）的柱头乳突细胞。 
	注：我们发现这种持镊方式有助于提高操作灵活性，并减少手部抖动的影响。对于经验较少或难以手动精确施加单粒花粉的使用者，可使用显微操作仪。</li>
	<li>在镊子上选择一个位置合适的花粉粒，准备转移至柱头。继续接近未授粉的柱头乳突细胞，直至选定花粉粒轻微接触其表面。缓慢撤回镊子，并确认花粉已附着（图5）。 
	注：补充视频 S1 和 补充视频 S2 演示了镊子上存在单粒或多粒花粉时该步骤的操作过程。</li>
	<li>确保花粉粒的方向使其赤道轴清晰可见且处于清晰对焦状态。立即切换至高倍物镜（例如 20x），拍摄花粉粒图像。此第一张图像记为 T = 0。随后每 1 分钟拍摄一次图像，共持续 10 分钟。</li>
	<li>根据需要调整焦距，以适应花粉粒或柱头的微小移动。每 2 分钟记录一次室温与相对湿度，以便后续对实验重复组之间的数据进行比较。</li>
	<li>完成所有图像采集后，以无损格式保存图像，例如制造商专有格式或 TIFF 格式。 
	注：每粒采样的花粉将获得 11 张图像（补充图 S1）。大多数专有图像采集软件中的自动/手动延时采集设置是组织各时间序列数据的有用功能。</li>
	<li>对其他花粉粒重复步骤 2.4 至 2.9。为对照组（野生型 [WT]）和实验组授粉采集相近数量的数据。</li>
</ol>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig02.jpg" /> 
图 2：花粉水合生物测定所用的设备设置。 本示例中，以 pA9-barnase 雄性不育植株品系作为花粉受体。将带盆的植株侧放，并用胶带将茎秆固定在置于显微镜载物台上的载玻片上。为减少机械应力并辅助植株定位，使用可调节平台支撑植株盆器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig03.jpg" /> 
图3：从花粉供体花朵中采集花粉粒。 图中展示了使用（A）尖头镊子&#160;和（C）一段眼睫毛进行操作。成团的花粉（红箭头）应通过轻轻接触供体花朵的花瓣去除，直至获得单层分布的花粉粒（绿箭头）。（B）未授粉的A. thaliana（Col-0）pA9-barnase雄性不育系柱头的高分辨率图像，该柱头已达到适合进行花粉水合生物测定的发育阶段。比例尺 = 100 µm（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig04.jpg" /> 
图4：将花粉转移至受体柱头时持镊子的方法。（A）&#160;持镊子的错误方向；（B）持镊子的正确方向。以这种方式侧向持镊，即拇指位于镊子两臂之间，可提供更大的稳定性，有助于将花粉粒转移至未授粉的柱头乳突细胞上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig05.jpg" /> 
图5：用镊子尖端将单个花粉粒转移至未授粉（“处女”）柱头乳突上&#160;pA9-barnase 雄性不育植株的细胞。 (A) 谨慎接近乳头细胞。B) 花粉粒（蓝色箭头）在适当位置附着于乳突细胞（橙色箭头）。C) 取出镊子并目视确认花粉附着（紫色箭头）。图示 A-C 使用10倍物镜（工作距离10.5 mm；数值孔径0.25）成像，图像源自以下视频片段的截图 补充视频 S1. (D切换至20倍物镜（工作距离2.1 mm；数值孔径0.5），开始进行时间序列图像采集。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
3. 花粉水合实验——测量
<ol>
	<li>将花粉水合速率定义为短半轴长度的变化（图6)随时间的变化，并以百分比变化的形式呈现（公式[1]): 
	<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/65280/65820eq01.jpg" style="margin: auto;" /> (1)</li>
	<li>使用图像分析软件，记录实验系列中每个花粉粒的短轴数值。 
	注：此测量选项的名称取决于软件，例如“Rotated Ellipse”或“5-point ellipse”。</li>
	<li>重复步骤 3.1–3.2，测量所有其他待测花粉粒。为保持一致性，应使用相同的数字放大倍数，并采用相同的方法定义“花粉边界”。 全部 数据集中的测量值</li>
	<li>完成时间序列的全部测量后，将每个图像堆栈的原始短轴半径值导出至电子表格中，并按图像堆栈分列呈现数据。每株系的分析中须至少包含来自15个水合花粉粒的数据。补充表 S1).</li>
	<li>少数花粉粒未能水合或水合速度明显慢于预期的情况并不罕见。这些“无效”花粉粒可能是由于花粉粒与乳突细胞接触不良，或与花粉活力有关。除非实验设计中特别需要，应识别并从数据集中剔除此类样本。</li>
	<li>计算每种植物品系在每个时间点的平均值。采用非配对检验 t-检验和单因素方差分析用于对每个时间点的野生型和突变系水分数据进行统计分析。采用多重比较 t- 在多个时间点上对野生型（WT）与突变体品系的均值进行同时比较的检验。 
	注意：XY 散点图对于直观展示所比较植物品系间花粉水合整体趋势也非常有用。</li>
</ol>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig06.jpg" /> 
图6：野生型花粉粒在拟南芥（A. thaliana，Col-0；pA9-barnase 雄性不育系）柱头乳突细胞上的水合过程。（A）授粉后0分钟（0 MAP）的时间点，以及（B）授粉后10分钟（10 MAP）。花粉粒周围的红色圆圈是由操作者使用图像分析软件定义并绘制的“花粉边界”。花粉内部的绿色线和深红色线分别代表半长轴和半短轴。半短轴的长度用于计算花粉水合程度。该数据集的完整时间序列见补充图S1。图像使用20倍物镜拍摄（工作距离2.1 mm，数值孔径0.5）。比例尺 = 50 µm。缩写：MAP = 授粉后分钟数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

An Improved Method to Measure Pollen Hydration Profiles in Arabidopsis thaliana

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</ol>

作者声明无利益冲突。

对于开花植物而言，有性生殖的最初阶段 arguably 是最为重要的。在花粉与柱头相互作用的层面，分子层面的决策决定了相互作用双方的“亲和性”。如果这些决策正确作出，便可避免资源浪费，从而影响生殖适应性21。因此，仅允许亲和性花粉完成受精，是维持良好适应基因型的重要机制之一，也是物种进化成功的关键因素。利用模式植物 A. thaliana 开展的研究极大地加深了我们对这一过程的理解。过去几十年的多项研究表明，花粉外被中存在一些因子，可在第一个亲和性“检查点”发挥作用，使花粉获得柱头水分，从而实现花粉水合13。尽管已初步揭示调控花粉-柱头亲和性的机制，但对该过程的理解仍存在诸多空白。迄今为止，尚未发现任何影响花粉水合的花粉携带配体或柱头受体突变体能够完全阻断亲和性授粉，提示还存在其他尚未发现的花粉水合决定因子。由于能够方便地观察目标表型，本文所述的花粉水合生物测定法是研究调控授粉潜在突变体的最直接技术之一。
目前用于检测花粉水合的方法通常采用批量授粉，并且报告的时间点较少14,22,23，因此可能遗漏重要的细微水合动态表型。例如，Wang 等人的研究13，以及本实验室对其他花粉包被蛋白突变体的研究（未发表观察结果），揭示了突变体之间在水合动态上存在引人注目的差异。此类细微差异可能为揭示亲和授粉背后的调控机制提供重要线索。
本文所述方法侧重于在突变体与野生型（WT）植物品系之间获取相对较少的测量数据，强调通过方法学上的精确性来降低数据集内的变异。尽管该方法具有高度可重复性（如图7所示），前提是温度和湿度得到充分控制，但仍建议在同一天内收集相近数量的野生型和突变体花粉的水合数据，以进一步减少潜在的变异。如有需要，数据可在不同天之间合并。此外，选择合适的野生型对照植物对于正确解读水合结果至关重要。作为花粉受体，应使用相同的植物品系来接收野生型对照和突变体花粉粒。
例如，在研究T-DNA花粉突变系（如图8中所述的“KD”突变体）时，我们使用pA9-barnase雄性不育植株系作为花粉受体，接受野生型（对照）和突变型（实验组）花粉，该植株系也在视频方案中有所展示。应避免将此类无需去雄的雄性不育系所获得的数据与人工去雄对照系&#160;获得的数据混合，因为这些柱头的行为可能存在差异。同样，在可能的情况下，应将去雄的突变系与去雄的野生型（对照）系配合使用。在考虑研究植株的遗传背景时，也应保持同样的谨慎态度。尽管大多数常用的T-DNA突变体文库是在Col-0背景下构建的，但也有其他文库，例如法国国家农业研究院（Institut national de la Recherche Agronomique, INRA）的FLAG文库，是在Wassilewskija（WS）遗传背景下建立的24,25。在这种情况下，建议使用相应生态型的野生型植株作为对照。
尽管本文重点关注花粉-柱头相互作用最初10分钟内的花粉水合过程，但该方法也可调整以涵盖更长时间段的水合动态。本实验方案的一个关键特征是花朵在整个实验过程中始终保持与母体植株相连；而目前已发表的实验方案通常需要将雌蕊切除，并置于培养基中以维持组织活性14,18,26。尽管尚无直接证据表明这种半体内方法会影响花粉水合过程，或改变该过程的体内调控机制，但切除花朵脱离母体植株可能对授粉产生影响。因此，本方案实现了真正意义上的体内环境，用于研究花粉-柱头相互作用，同时保持了植株的结构完整性。
将单个花粉粒转移到“未授粉”的柱头乳突细胞上，可以说是本实验方案中最具挑战性的操作之一。操作中误将成团的花粉粒转移的情况并不少见。然而，通过确保镊子上仅附着单层花粉粒（图3A），或甚至仅附着单个花粉粒（图5），和/或利用已经定向、从镊子尖端“突出”于其他花粉粒的花粉粒，可显著降低此类错误的发生概率。我们发现，经验丰富的操作者大约可在3分钟内成功完成单个花粉粒向柱头乳突细胞的转移，并在1小时内记录多达五个花粉粒的数据。因此，在2至4天内，即可积累足够的数据，用于对所研究的植物品系进行有意义的统计分析。
人为误差可能是利用本方案所获得数据集分析中变异的最主要来源。例如，在图像分析过程中，“花粉边界”的界定取决于研究人员的主观判断。因此，不同研究人员即使对同一数据集进行测量，也可能产生变异。应尽可能由同一名研究人员完成所有测量，以最大限度地减少取样误差。此外，由同一名操作者同时分析野生型和突变体数据集，可消除“花粉边界”定义的主观性以及操作者之间的差异。
综上所述，本文介绍了一种针对模式生物 A. thaliana 花粉水合过程进行精确测量的复杂而准确的方法。我们已证明，利用该方案可轻松获得高度一致的 A. thaliana 花粉水合数据。在不同日期获取的三批独立的野生型授粉实验数据，在所有时间点均表现出一致的小幅偏差，均小于&#60;3%（图7 和 补充表S1）。尽管本文所展示的生物测定方法相较于大多数现有方案略为复杂，但其生成数据的分辨率更高，适用于鉴定和表征影响亲和授粉调控通路的新突变体。

被子植物成功的有性繁殖通常依赖于花粉粒从花药转移到柱头，这一过程可在同一个体或不同个体之间发生（即授粉）。这种花粉粒向可授粉花朵的转移通常由传粉者或非生物因素介导；因此，在自然条件下也常常导致异种花粉的沉积。除少数例外情况外，异种花粉参与授粉在进化上是不利的，会因错失同种交配机会而降低繁殖适合度，且大多数由此产生的杂交后代要么无法正常发育，要么不育1。因此，植物已进化出多种机制以阻止“不相容”的异种花粉完成授粉过程2。因此，在许多开花植物有性繁殖的早期阶段，对相容花粉的快速识别可以说是最重要的过程。
在十字花科植物中，柱头属于“干性”类型，一系列分子检查点在生殖过程的多个阶段发挥作用，调控授粉过程，从而确保只有相容的花粉才能成功完成授粉。花粉水合是其中最重要的检查点之一（图1），因为无法完成水合的花粉不能进一步发育形成花粉管，因而无法将精子递送至雌配子体。通常情况下，不相容的花粉粒无法通过这一最初的授粉检查点，因此无法获取柱头的水分3。在十字花科植物中，花粉识别发生得非常迅速，花粉粒一旦附着于雌蕊，数分钟内即可确定其相容性4,5。近年来，该领域已取得诸多进展，目前我们正逐步揭示调控关键授粉检查点的分子机制。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig01.jpg" /> 
图1：亲和授粉过程中关键事件的概述。 这些阶段，如花粉水合和花粉管萌发，也是必须成功通过的授粉“检查点”，以实现亲和授粉。该图示表示一种典型的十字花科植物所具有的“干型”柱头2,20。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
关于 Brassica 自交不亲和性（SI）系统的研究具有开创性意义，该系统能够识别并拒绝“自体”花粉，从而确立了十字花科植物中花粉-柱头识别的经典范式6,7,8,9,10。Brassica 及其近缘种的自交不亲和性由存在于花粉表面和柱头质膜上的“识别”蛋白介导，当这些蛋白相互作用时，将导致花粉被拒绝。自交不亲和性花粉的拒绝机制是通过破坏基础的花粉-柱头亲和系统实现的；当识别到亲和花粉时，该亲和系统被完全激活，引发柱头的靶向分泌，从而促进花粉水合（有关花粉亲和机制的综述见11,12）。在自交不亲和性的实例中，花粉携带的配体是一种富含半胱氨酸的小分子蛋白，即 S 位点富含半胱氨酸蛋白（SCR/SP11），而柱头上的受体则是 S 位点受体激酶（SRK）。
最近，在Arabidopsis thaliana中发现另一类富含半胱氨酸的小型花粉携带蛋白——花粉外被蛋白B类（AtPCP-Bs）可通过激活花粉水合作用，作为花粉接受过程的重要调控因子13。关于AtPCP-Bs的柱头受体及其下游调控通路的部分机制也已得到初步阐明14,15。有趣的是，对编码潜在花粉来源及柱头信号转导因子（包括AtPCP-Bs）的基因进行突变研究时，尚未获得在花粉水合检查点完全阻断的植株。这强烈表明，还存在多个尚未发现的其他因素参与调控花粉水合作用。在Wang等人首次描述的方法基础上13，本文介绍一种改进的高分辨率体内生物测定法，适用于鉴定候选突变型A. thaliana品系中细微的花粉水合缺陷。

<table><tbody><tr><td>pA9-barnase 品系</td><td>巴斯大学</td><td>由 Rod Scott 教授提供</td><td>雄性不育 &lt;em&gt;拟南芥 &lt;/em&gt;生态型Columbia-0的野生型对应品系</td></tr><tr><td>杜蒙特镊子，杜蒙特#5 不锈钢 11厘米</td><td>Fisher</td><td>Dumont 500342</td><td>镊子用于花粉粒的转移</td></tr><tr><td>GraphPad Prism（版本 8.0.2）</td><td>Dotmatics</td><td>Prism</td><td>全面的数据分析、绘图与统计软件</td></tr><tr><td>JMP（版本 17）</td><td>JMP Statistical Discovery LLC</td><td>JMP 17</td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>Levington F2S 种子 &amp;以及含沙的模块化堆肥</td><td>Levington</td><td>LEV75F2SMS</td><td>用于植物生长的通用型培养土</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Singer Instrument Co. LTD.</td><td>Singer显微操作仪</td><td>辅助花粉粒转移的显微操作仪</td></tr><tr><td>Nikon Digit sight DS-U1</td><td>尼康</td><td>DS-U1</td><td>显微镜相机（与 SMZ1500 耦合）</td></tr><tr><td>尼康Eclipse TE2000-S倒置显微镜</td><td>尼康</td><td>TE2000-S</td><td>倒置显微镜</td></tr><tr><td>尼康 SMZ1500 体视显微镜</td><td>尼康</td><td>SMZ1500</td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>尼康 DS-Fi3 显微镜相机</td><td>尼康</td><td>DS-Fi3</td><td>显微镜相机（与 TE2000-S 耦合）</td></tr><tr><td>尼康 NIS-元素基础研究</td><td>尼康</td><td>NIS-Elements BR</td><td>图像采集与分析软件（适用于 DS-Fi3）</td></tr><tr><td>尼康 NIS-Elements F</td><td>尼康</td><td>NIS-Elements F</td><td>图像采集与分析软件（适用于 DS-U1）</td></tr><tr><td>野生型Col-0植物品系</td><td>uNASC</td><td>N70000</td><td>野生型 &lt;em&gt;拟南芥&lt;/em&gt;生态型 Columbia-0</td></tr></tbody></table>

高分辨率单颗粒 体内 花粉水合生物测定法 拟南芥

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

开花植物的有性繁殖需要花粉粒与柱头表面之间的初始相互作用，在此过程中，相互作用的双方建立起分子对话。对多种物种的研究表明，一系列分子检查点调控着花粉与柱头的相互作用，以确保只有相容的、通常为种内花粉才能成功完成受精。在具有“干柱头”的物种中，例如模式植物 Arabidopsis thaliana，授粉后、合子前的第一个相容性检查点是花粉水合作用的建立。
这一授粉阶段受到严格调控，花粉粒发出的信号会诱导柱头释放水分，从而允许花粉吸收水分完成水合。能够精确测量并随时间追踪花粉水合过程，是设计旨在理解生殖关键步骤调控机制实验的关键。已发表的实验方案通常采用从母本植株上切除的花朵，将其维持在液体或固体培养基上，并进行批量授粉。
本文描述了一种非侵入性、 体内 允许对单个花粉粒进行分钟级水合过程追踪的授粉生物测定法 A. thaliana 高分辨率下的花粉粒。该检测方法具有高度可重复性，能够检测花粉水合过程中的细微变化，因此适用于分析影响授粉调控通路的突变体。尽管该方案相较于批量授粉所述方法更为耗时，但其提供的精确性和可重复性，以及其 体内 其特性使其成为精细解剖传粉表型的理想选择。

A. thaliana 的花粉水合示例数据集如上所述采集，本节展示了两组此类数据。第一组数据包含野生型（WT）植株花粉水合时间序列的三个重复，每个重复在不同日期采集。每个重复包含不少于18个单独的花粉粒数值，三个重复总计55个花粉粒。在所有时间点，各重复间均值的最小值与最大值差异在3%以内（图7 和 补充表S1）。这些代表性的野生型授粉数据清楚表明，采用本文详述的方法，即使样本量相对较少且在不同日期进行实验，也能获得高度一致的结果。
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig07.jpg" /> 
图7：显示一致性的XY图 A. thaliana 野生型花粉在10分钟时间内的水合过程。 花粉亲本为Col-0生态型 A. thaliana 且以 pA9-barnase 雄性不育植株作为雌蕊亲本 A. thaliana （Col-0）品系。数据来自不同日期采集的三个独立数据集，显示出高度一致性。这些数据集的均值箱线图及统计分析结果见补充图S2。每个独立数据集的花粉测量数量（'n'）显示在图中相应基因型（WT1/WT2/WT3）旁。缩写：WT = 野生型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
第二组数据来自一个在花粉包被蛋白编码基因中带有T-DNA插入的植物品系，该插入导致产生“基因表达下调”突变，本文中简称为“KD突变体”。如实验方案所述，将突变体花粉沉积到pA9-barnase雄性不育柱头上进行水合过程分析。从结果数据（图8）可以看出，突变体花粉与野生型（WT）花粉在授粉后前5分钟内的水合曲线无明显差异。然而，在授粉后5至10分钟（MAP），突变体花粉的平均短轴变化开始落后于野生型花粉，该差异在授粉后10分钟（MAP）达到统计学显著性。该结果不仅表明该花粉包被蛋白在调控花粉水合过程中发挥一定作用，也充分展示了本高分辨率单花粉粒生物测定方法在追踪花粉水合动态方面的应用价值。在此特定示例中，该方法的灵敏度足以检测到花粉包被蛋白编码基因“表达下调”所产生的细微效应。
<img alt="图8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig08.jpg" /> 
图8：&#160;野生型（WT）与花粉包被蛋白“敲低”突变体系（KD突变体）的花粉水合曲线。 （A）野生型与突变体花粉在10分钟内的水合过程曲线。花粉亲本分别为拟南芥（A. thaliana）的Col-0生态型以及花粉包被蛋白KD突变体（同样处于Col-0遗传背景）。两种情况下，柱头亲本均为pA9-barnase雄性不育的拟南芥（A. thaliana，Col-0）品系。（B）箱线图显示了野生型与突变体花粉数据集在授粉后5分钟（5 MAP）和10分钟（10 MAP）时花粉水合程度（以短轴半径的百分比变化表示）。须线表示样本的最小值与最大值，箱体表示数据集的下四分位数、中位数和上四分位数，白色十字表示数据集的均值。非配对t检验分析表明，两种植物品系在10 MAP时的平均花粉水合百分比存在显著差异。一个星号表示p &lt; 0.05（非配对t检验）。缩写：WT = 野生型；KD = 敲低；MAP = 授粉后分钟数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图 S1：野生型花粉粒在 pA9-barnase 雄性不育植株的柱头乳突细胞上花粉水合生物测定的裁剪时间序列，持续 10 分钟。 图像每 1 分钟拍摄一次。0 MAP 和 10 MAP 时刻的图像已用于图 6（单独附上）。比例尺 = 50 µm。缩写：WT = 野生型；MAP = 授粉后分钟。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280_New Supplementary figure S1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S2：箱形图显示了 图7 中描述的三个野生型（WT）花粉数据集在10分钟时间内花粉水合程度（以短轴半径的百分比变化表示）。 雌蕊亲本为 pA9-barnase 不育的 A. thaliana（Col-0）品系。须线表示样本的最小值和最大值。箱体显示数据集的下四分位数（下铰链）、中位数（中铰链）和上四分位数（上铰链）。图中展示了各个数据点。单因素方差分析（One-way ANOVA）显示，在10分钟的时间范围内，三个数据集之间的花粉水合百分比均值差异无统计学显著性。显著性阈值为 p &#60; 0.05（单因素方差分析）。缩写：WT = 野生型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280_Supplementary figure S2 (2).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 S1：用于构建图7的花粉原始吸水数据（pA9-barnase 雄性不育柱头上的 A. thaliana WT Col-0 花粉）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280_Supplementary table S1.xls" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 S1：通过镊子尖端将单个野生型（Col-0 品系）花粉粒转移至“未授粉”柱头乳突细胞（pA9-barnase 雄性不育系）的视频演示。 为便于视频访问，图像质量已故意降低。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280_Supplementary Video S1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 S2：一段展示将单个野生型（Col-0 品系）花粉从镊子尖端的花粉单层转移至一个“未授粉”柱头乳突细胞（pA9-barnase 雄性不育系）的视频。 为便于视频访问，图像质量已故意降低。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280_Supplementary Video S2.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种改进的拟南芥（Arabidopsis thaliana）花粉水合过程检测方法。该新方法具有更高的分辨率、非侵入性且高度可重复。该实验方案为深入解析调控授粉早期阶段的生物学过程提供了一种新的研究工具。

开花植物的有性繁殖需要花粉粒与柱头表面之间的初始相互作用，其间发生分子水平的对话……

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科研

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Biology

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高分辨率单颗粒体内花粉水合生物测定法拟南芥

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