利用荧光报告基因与染色质免疫沉淀（ChIP）分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的跨代表观遗传

本实验室的研究重点是染色质相关蛋白、组蛋白修饰以及小RNA通路因子在发育过程和跨代表观遗传中的协同作用。利用GFP报告基因的RNA遗传检测已成为一种非常强大的工具。本实验方案详细描述了线虫的制备、评分和传代标准化流程，以及芯片样品的制备方法，有助于获得可重复的实验结果。

研究生殖系表达的转基因时，一个实验难点在于分离出该转基因在动物生殖系中的效应。目前我们使用整个生物体进行芯片实验，但未来我们希望开发出能够特异性检测生殖系染色质状态的分析方法。我们的实验室关注组蛋白甲基化以及识别这些修饰标记的蛋白质。

未来，我们希望研究这些染色质阅读蛋白与小RNA通路在转基因RNAi遗传及内源序列调控过程中的相互作用。通过在接种了OP50-1细菌的标准35毫米NGM平板上挑选三到四条产卵期的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）成虫，来准备用于RNAi遗传实验的动物。四天后，使用800微升添加了Triton X-100的M9缓冲液将产卵期成虫从平板上冲洗下来，收集至1.5毫升离心管中。

重复洗涤步骤，并将线虫收集至一个离心管中。在1,000 G条件下离心线虫1.5至2分钟，随后吸除上清液，保留100微升液体，注意不要扰动线虫沉淀。向每管含有线虫沉淀的样品中加入650微升双蒸水。

为了从收集的群体中分离秀丽隐杆线虫（C. Elegans）胚胎，加入250微升 freshly-prepared 漂白溶液，并启动计时器。每隔一到两分钟，将试管充分涡旋振荡。五分钟后，在体视显微镜下观察成虫的降解情况。

继续涡旋振荡，直至线虫完全溶解，仅剩下胚胎。此过程通常需要六到七分钟。立即以1,000 G离心1.5分钟，并吸除上清液，留下约50至100微升上清液与胚胎一同保留。

向胚胎中加入1毫升添加了Triton X-100的M9缓冲液，涡旋混匀。离心悬浮液，并重复洗涤两次。最后一次洗涤后，吸除上清液，管中保留约100微升。

将分离的胚胎置于离心管中涡旋混匀，然后用移液器从每管中各取2微升，重复两次，滴加到标记好的玻璃载片上。使用计数器统计胚胎数量，以估算每微升中的胚胎浓度。为启动半同步化的种群生长，将约250个胚胎分别转移至含有表达GFP或对照RNAi载体的E.coli HT115细菌的RNAi NGM平板上。

让液体充分吸收，将经RNAi处理的P0代线虫在21摄氏度下培养四天。开始制备琼脂糖垫：用玻璃巴斯德吸管吸取融化的1%琼脂糖，在黑胶唱片下方滴加一滴。将载玻片摆放至使唱片上的线条呈水平或垂直方向，然后迅速将载玻片置于琼脂糖液滴上，静置30秒。

从记录中取出玻璃载玻片，在体视显微镜下加入约五微升新配制的五毫摩尔左旋咪唑。轻轻弹击含有线虫的离心管，将五至十微升样品转移至琼脂糖垫上以固定线虫。在添加过程中估算线虫数量，使每个重复样本中约有40条线虫。

使用睫毛挑针将线虫排成行，并在载玻片上放置玻璃盖玻片。利用漂白法从剩余线虫中分离胚胎，并将250个胚胎接种到接种了OP50-1细菌的35毫米NGM平板上。在荧光体视显微镜下，使用GFP滤光片组，借助计数器对每份重复样品载玻片上的GFP阳性与GFP阴性线虫数量进行计数并记录。

对每一代生殖系中细胞核GFP信号进行人工评分的结果显示，在经GFP RNAi处理的P0代和F1代线虫中，该转基因的沉默效应完全渗透。在F2代中，表现出GFP沉默遗传的个体占群体比例约为50%。到F5代时，大多数个体不再表现出沉默效应的遗传。到F10代时，所有线虫均表达GFP，且未检测到任何遗传现象。

首先，将约 3,500 个秀丽隐杆线虫（C. elegans）F1 代胚胎接种至 14 个培养板中，在 21 摄氏度下培养三天，使其发育至年轻成虫阶段。使用 PBS/TX 缓冲液冲洗并收集线虫至 1.5 毫升离心管中，在 1,000 ×g 条件下离心 2 分钟。

吸出并收集一个品系的线虫至一个离心管中。用 PBS/TX 重复洗涤三次。随后，吸去上清液，每管中保留 1 毫升，倒置混匀。

重复三次计数 3 微升中的秀丽隐杆线虫（C. Elegans）数量后，计算线虫浓度，并转移相当于 3,000 条线虫的体积至新管，用于甲醛交联。首先，向含有线虫的管中加入甲醛，使其终浓度达到 1.8%，在室温下旋转孵育 6 分钟。随后，立即用液氮速冻管子，并将样品储存在 -80 摄氏度条件下。

接下来，将甲醛交联样品在室温水浴中解冻三分钟，并在室温下旋转孵育16分钟。加入1.25摩尔的甘氨酸，使终浓度为125毫摩尔，并在室温下旋转孵育五分钟。此步骤完成后，将样品置于冰上或4摄氏度环境中，并在磁珠稀释前始终使用预冷的缓冲液。

将样品在 1,000 G 条件下离心 3 分钟后，用 1 毫升 PBS/TX 洗涤 3 次。然后用 1 毫升重悬缓冲液洗涤 2 次。最后一次洗涤后，保留足够的缓冲液，确保总体积至少为沉淀体积的 3 倍，且最小体积不少于 100 微升。

首先将90至120微升的甲醛交联秀丽隐杆线虫（C. Elegans）样品混匀，并分装到聚苯乙烯超声处理管中。加入等体积含有2倍去垢剂的重悬缓冲液。在水浴超声仪中进行超声处理，持续7分钟。

用移液器轻轻混匀样品，并再次进行超声处理，额外持续七分钟。完成后，将超声处理后的裂解液转移至1.5毫升离心管中。加入一半体积的不含去垢剂的重悬缓冲液。

在4°C、13,000 G条件下离心15分钟后，将裂解液上清分为四部分。将输入裂解液部分加入1.5毫升离心管中，于-20°C保存。向相应的免疫沉淀（IP）样品中分别加入0.5微克的抗H3K9三甲基化抗体、抗组蛋白H3抗体或IgG。

将反应物在4°C条件下旋转孵育过夜。次日，将每个免疫沉淀样品中的9 µL Protein G包被的磁珠分装至1.5 mL离心管中。用1 mL FA 150缓冲液洗涤两次后，将磁珠重悬于FA 150缓冲液中。

操作完成后，将7.5 µL磁珠悬浮液加入每种IP抗体混合物中，随后将各离心管置于4°C条件下旋转孵育2小时。接着，使用每种缓冲液至少200 µL对磁珠进行7次洗涤。每次洗涤均在4°C条件下旋转孵育5分钟，然后将离心管置于磁力架上收集磁珠，并吸除洗涤液。

吸尽最后一次缓冲液洗涤液后，将磁珠重悬于50 µL染色质免疫沉淀洗脱缓冲液中，并转移至1.5 mL离心管。在恒温混匀仪中洗脱样品后，将磁珠置于磁力架上收集，然后将上清液转移至新的离心管中。再用另外50 µL染色质免疫沉淀洗脱缓冲液重复洗脱一次。

完成后，将总共100 µL上清液合并，然后进行逆转交联和DNA洗脱。