Name: 基于荧光报告基因和染色质免疫沉淀法（ChIP）分析 秀丽隐杆线虫 的跨代表观遗传 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学习使用荧光报告基因和染色质免疫沉淀法分析秀丽隐杆线虫的跨代表观遗传机制。该标准化方案可研究RNA干扰诱导的基因沉默在多代之间的遗传规律，为发育生物学和表观遗传学研究提供可重复的技术方法。

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我们希望感谢 C. elegans 研究领域中开发并共享了相关工具的各个实验室，本文引用了他们的研究成果。部分菌株由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。本研究获得了加拿大卫生研究院（CIHR）项目资助（A.L.S.，PJT-175245）。C.L. 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）研究生奖学金（PGS-D）的支持。

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

<ol><li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li>
<li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li>
<li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+silencing+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882(2006).</li>
<li>Lee, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li>
<li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li>
<li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).</li>
<li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li>
<li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li>
<li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li>
<li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448(2019).</li>
<li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797(2021).</li>
<li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li>
<li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li>
<li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li>
<li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+coordinate+poly%28UG%29+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+GeneticsWormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li>
<li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).</li>
<li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li>
<li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li>
<li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li>
<li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
</ol>

所有作者确认无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，通过饲喂方式引入dsRNA，该方法已成为C. elegans18研究中的标准方法。对于RNAi遗传实验，饲喂法可简便地获得大量P0&#160;代个体2,11,12,22,23,24,25。然而，RNAi处理的时机和持续时间会影响转基因沉默的效果26，而RNAi细菌的浓度则影响可遗传RNAi沉默的持续性1。因此，标准化的RNAi细菌培养和线虫生长条件对于获得一致的GFP沉默水平及遗传持续时间至关重要。本方案中，将胚胎接种于RNAi平板上，使P0代个体自孵化起即暴露于RNAi细菌中。其他替代方法则将同步化的L124,27或L425期个体转移至RNAi-NGM平板。此外，由于饥饿及其他应激因素会影响RNAi遗传的维持13，必须定期监测平板，避免种群密度过高及食物耗尽。除饲喂法启动RNAi外，部分早期的C. elegans RNAi遗传研究采用性腺注射诱导RNAi，该方法可更精确地控制dsRNA浓度1,28。
在本实验方案中，每一代均通过群体传代并结合碱性次氯酸盐处理，具体方法如前所述16,22,23,24。次氯酸盐处理可确保F1代不会被亲代环境中的RNAi细菌污染22，并防止可能出现的群体瓶颈效应。然而，批量传代也可能存在局限性，因为个体动物可能具有不同的遗传模式1,29。建立每一代的另一种方法是选择单个动物进行传代1,2,9,11,25。该方法可实现对谱系内表型的追踪，并便于引入遗传杂交。对于外显率较低的表型，谱系分析可能更具优势12。
荧光蛋白表达是RNAi诱导沉默效应的一种强大且便捷的检测指标2,3,4,12,14,15,16,25,30。如本实验方案所述，GFP表达可通过人工判读为“开启”（ON）或“关闭”（OFF）状态11,12,15,16,25。人工判读还可通过赋予定性强度等级进一步细化3,4,14。或者，也可采用显微图像的自动化强度评分11,12,14,25,27，或对活体动物进行流式细胞术荧光检测2，以获得定量且高通量的读数。然而，由于报告基因表达局限于生殖系，自动化方法的一个局限性在于必须能够区分GFP表达被沉默的个体与缺乏生殖系的个体，尤其是在研究涉及生殖系发育异常的突变体时。除GFP荧光外，逆转录（RT）-qPCR也可用于定量RNAi靶标的pre-mRNA和mRNA水平2,16,23,24。该方法可更直接地反映以RNA为靶标的沉默效果，特别适用于沉默后不产生可见表型的其他RNAi靶标。使用人工GFP报告基因的一个局限在于，在跨代表观遗传RNAi中，外源序列与内源序列的调控方式存在差异11。因此，针对内源靶标的研究，例如温度敏感型胚胎致死等位基因 oma-1(zu405)1,11,16,25，应被视为荧光转基因报告系统的一种互补性研究手段。
在RNAi遗传实验背景下进行ChIP分析时，需要对不同处理组和重复样本进行比较。首先，为了校正各样本起始材料的差异，需将ChIP信号相对于同一基因座的Input信号进行归一化，表示为“Input百分比”。同时平行处理组蛋白H3的ChIP，有助于判断组蛋白修饰的变化是否与核小体密度的改变相关。此外，由于ChIP是一个多步骤的实验流程，其效率可能在不同样本之间存在差异。因此，选择合适的阳性和阴性对照基因座有助于评估并比较各样本及实验之间的信噪比。另外，为了便于样本间的比较，通常将RNAi靶基因座处ChIP DNA的qPCR阈值循环值（Ct值）归一化至一个对照基因座3,11,15,23,30,31。为了评估RNAi处理的效果，还需比较处理组（RNAi）与对照组（无RNAi）之间ChIP信号的比值。当前方法的一个局限性在于ChIP实验使用的是整个动物组织，而对RNAi处理的响应可能仅特异存在于生殖系中。克服这一局限的一种策略是利用分离的生殖系细胞核进行ChIP实验。有关优化ChIP实验的其他技术考量，已在其他文献中被广泛讨论32,33。
总体而言，该RNAi遗传与ChIP实验方案提供了一个详细且易于调整的基础，可与其他技术相结合，以进一步探索跨代表观遗传调控。例如，可利用ChIP DNA（ChIP-seq）构建高通量测序文库，从而更详细地分析RNAi靶标附近区域乃至全基因组范围内的染色质状态。

表观遗传继承使得基因调控信息能够在世代之间传递，因此亲代所处的环境或经历可能影响其后代。在 C. elegans 中，由外源双链 RNA（dsRNA）引发的生殖系基因沉默可在未暴露于原始触发因素的后代中持续传递多代1,2,3,4。这一过程被称为 RNA 干扰（RNAi）继承，是 C. elegans 中多种相关表观遗传沉默现象之一，其他现象包括由 piRNA 引发的多代沉默2,5、参数突变/RNAe（RNA 诱导的表观遗传沉默）6,7,8，以及由多拷贝阵列引发的沉默9，这些过程在小 RNA 和染色质调控机制的需求上既有重叠又各具特异性。在 C. elegans 的外源 RNAi 过程中，dsRNA 被加工成小干扰 RNA（siRNA），后者与初级 Argonaute 蛋白形成复合物，识别其靶标 mRNA。这种靶向作用会引发次级 siRNA 的扩增，次级 siRNA 与次级 Argonaute 蛋白结合，通过细胞质和细胞核内的沉默通路共同实现对靶标 mRNA 的沉默。对于在生殖系中表达的 RNAi 靶标，核内次级 Argonaute 蛋白 HRDE-1 及其他核内 RNAi 因子可靶向新生转录本，导致转录抑制，并招募组蛋白甲基转移酶沉积抑制性染色质标记，包括 H3K9me310。组蛋白 H3K9me3 有助于通过 RNAi 继承机制建立对生殖系表达的绿色荧光蛋白（GFP）转基因的可遗传沉默11,12。
本实验方案的目的是利用在生殖系中表达GFP-组蛋白融合蛋白的转基因作为报告系统，研究RNA干扰（RNAi）的遗传特性，并通过染色质免疫沉淀结合定量聚合酶链式反应（ChIP-qPCR）检测该报告转基因位点组蛋白修饰的变化。本方案描述了一种标准化的基于培养板的RNAi饲喂方法，用于启动报告基因的沉默。同时提供了通过碱性次氯酸盐处理（“漂白”）从成年 gravid 线虫中分离in utero胚胎以实现代际传代的详细时间流程。此外，还介绍了通过荧光显微镜监测群体中部分个体GFP沉默频率的方法及组蛋白H3K9me3的ChIP-qPCR代表性数据。基于报告基因的RNAi遗传实验为功能解析遗传和环境因素在表观遗传调控中的作用提供了一个高度可行的研究体系13,14，利用此类报告系统开展的遗传筛选已鉴定出若干在跨代表观遗传持续时间中起必需作用的基因2,3,15，以及负向调控该过程的基因16,17。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Bioshop</td><td>AGA002</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Bioshop</td><td>AMP201</td><td>用超纯水配制成100 mg/mL的溶液，过滤除菌后于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>抗H3K9me3兔多克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td>浓度依批次而定（0.9 - 1 mg/mL）。</td></tr><tr><td>抗组蛋白H3兔多克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>浓度依批次而定（0.7 - 1 mg/mL）。</td></tr><tr><td>漂白剂（6%次氯酸钠）</td><td>Lavo</td><td>02358107</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; GFP RNAi报告菌株</td><td>NA</td><td>SX1263</td><td>Sapetschnig 等，2015年（参考文献7）。由剑桥大学E. Miska实验室惠赠。</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>BioShop</td><td>CAR544</td><td>用超纯水配制成25 mg/mL的溶液，过滤除菌后于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; HT115(DE3)菌株</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）</td><td>HT115(DE3)</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; OP50-1菌株</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）</td><td>OP50-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（0.5 M，pH 8.0）</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（37%）</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td>配制成1.25 M溶液，4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>HEPES-KOH（1 M，pH 7.5）</td><td>Teknova</td><td>H1035</td><td></td></tr><tr><td>疏水性打印载玻片，10孔</td><td>VWR</td><td>100488-904</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630（辛基苯基聚氧乙烯醚）</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>用超纯水配制成10%（v/v）溶液，室温保存。</td></tr><tr><td>IPTG（异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷）</td><td>BioShop</td><td>IPT001</td><td>用超纯水配制成0.2 g/mL溶液，过滤除菌后于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>iTaq通用SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>添加100 &amp;micro;g/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板</td><td>NA</td><td>NA</td><td>标准实验室配方。</td></tr><tr><td>左旋咪唑（盐酸四咪唑）</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>用超纯水配制成200 mM溶液，-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>LiCl（8 M）</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>M9缓冲液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>22 mM KH2PO4，42 mM Na2HPO4，86 mM NaCl，1 mM MgSO4。</td></tr><tr><td>磁力架（适用于1.5 mL离心管）</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>磁力架（适用于0.2 mL离心管）</td><td>Permagen</td><td>MSR812</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541B</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Technologist Choice</td><td>LAB-037</td><td></td></tr><tr><td>NaCl（5 M）</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td>用于ChIP缓冲液。</td></tr><tr><td>NaOH&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>配制成10 M溶液，室温保存。</td></tr><tr><td>NGM平板</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1.7%（w/v）琼脂，0.3%（w/v）NaCl，0.25%（w/v）蛋白胨，1 mM CaCl2，5 &amp;mu;g/mL胆固醇，25 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0），1 mM MgSO4，50 &amp;micro;g/mL链霉素。</td></tr><tr><td>正常兔IgG（1 mg/mL）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（35 mm × 10 mm）</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（10X）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>质粒 - 对照RNAi&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4440（质粒#1654）</td><td></td></tr><tr><td>质粒 - 靶向GFP的RNAi&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4417（质粒#1649）</td><td>注意：可使用其他源自L4440的靶向GFP的质粒。</td></tr><tr><td>引物对 [-3.3 kb gfp上游区]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td></tr><tr><td>引物对 [+1.3 kb gfp下游区]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT</td></tr><tr><td>引物对 [clec-18]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA</td></tr><tr><td>引物对 [gfp外显子1]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC</td></tr><tr><td>引物对 [gfp外显子4]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA</td></tr><tr><td>引物对 [hrp-2]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNAi-NGM平板</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1.7%（w/v）琼脂，0.3%（w/v）NaCl，0.25%（w/v）蛋白胨，1 mM CaCl2，5 &amp;micro;g/mL胆固醇，25 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0），1 mM MgSO4，25 &amp;micro;g/mL羧苄青霉素和5 mM IPTG。</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl（月桂酰肌氨酸钠）</td><td>Sigma</td><td>L5777</td><td>配制成10%（w/v）溶液，避光室温保存，最多保存1个月。</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>74255</td><td>配制成10%（w/v）溶液，室温保存。</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>配制成5%（w/v）溶液，避光室温保存，最多保存1个月。</td></tr><tr><td>超声破碎管</td><td>Evergreen</td><td>214-3721-010</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎管盖</td><td>Evergreen</td><td>300-2911-020</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q800R3-110</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Bioshop</td><td>STP101</td><td>用超纯水配制成50 mg/mL溶液，过滤除菌后于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>TAE缓冲液（1X）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>40 mM Tris，20 mM乙酸，1 mM EDTA</td></tr><tr><td>计数器</td><td>Uline</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Bioshop</td><td>TET701</td><td>用乙醇配制成5 mg/mL溶液，-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-205</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl（1 M，pH 8.0）</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>用超纯水配制成10%（v/v）溶液，室温保存。</td></tr></tbody></table>

利用荧光报告基因与染色质免疫沉淀（chip）分析秀丽隐杆线虫（c. elegans）中的跨代表观遗传

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

跨代表观遗传（TEI）能够在不改变基因组序列的情况下，通过非编码RNA和染色质修饰等因素实现遗传信息经由生殖系的传递。在线虫Caenorhabditis elegans中，RNA干扰（RNAi）的遗传现象是研究TEI的有效模型，该模型充分利用了该模式生物生命周期短、可自我繁殖以及身体透明等优势。在RNAi遗传过程中，动物暴露于RNAi后，其靶基因位点会发生基因沉默以及染色质特征的改变，且这些变化可在初始诱导因子消失后持续多个世代。本实验方案描述了利用生殖系表达的核定位绿色荧光蛋白（GFP）报告基因来分析C. elegans中RNAi遗传的方法。通过喂食表达靶向GFP的双链RNA的细菌，启动报告基因的沉默。在每一代中，动物均需传代以维持发育同步，并通过显微镜观察确定报告基因的沉默状态。在特定世代，收集群体并进行染色质免疫沉淀（ChIP）-定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，以检测GFP报告基因位点处组蛋白修饰的富集水平。本研究RNAi遗传的实验方案易于修改，并可与其他分析方法结合，进一步探究小RNA和染色质通路中的TEI相关因子。

通过饲喂方式对携带生殖系表达的 GFP-组蛋白 H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 报告基因（图 2A）的动物施加 GFP RNAi 或对照 RNAi，并按照本方案及图 1所述进行传代。在每一代中，随机选取部分群体，使用荧光体视显微镜手动评估其生殖系细胞核中的 GFP 信号。在经 GFP RNAi 处理的 P0 和 F1 代动物中，转基因沉默完全外显（图 2B）。在 F2 代中，表现出 GFP 沉默遗传的个体比例约为 50%。至 F5 代时，大多数个体不再表现出沉默的遗传现象；到 F10 代时，未检测到任何遗传沉默，所有动物均表达 GFP。
为了确定组蛋白H3K9me3富集程度的变化与RNAi诱导的沉默之间的关系，在F1代动物中分别进行GFP RNAi或对照RNAi处理后，进行了ChIP-qPCR实验。正如预期，与对照RNAi处理的动物相比，GFP RNAi处理的群体在GFP靶位点及其下游1.3 kb区域表现出更高的组蛋白H3K9me3水平（图2C）。组蛋白H3K9me3 ChIP的特异性由阳性对照位点（clec-18）的富集所支持，该位点已知富含此修饰，而在邻近的阴性对照位点（hrp-2）则未观察到富集。在所有qPCR检测位点，组蛋白H3的富集以及IgG对照免疫沉淀中的接近背景水平的富集也均如预期被检测到。当将报告基因位点的ChIP富集程度相对于阳性对照位点clec-18进行归一化时，结果显示GFP RNAi处理导致更高的组蛋白H3K9me3富集，而组蛋白H3的富集在对照与GFP RNAi处理之间相似（图2D）。由于GFP RNAi预期不会影响clec-18位点的组蛋白H3K9me3水平或总组蛋白H3占据情况，因此该归一化方法可消除技术性变异的影响，例如GFP RNAi与对照RNAi样品之间ChIP效率的差异。不同RNAi处理之间组蛋白H3K9me3和组蛋白H3水平的倍数变化显示，在GFP RNAi诱导的沉默条件下，报告基因特异性的组蛋白H3K9me3富集独立于组蛋白占据情况而发生（图2E）。
<img alt="RNAi 对 GFP 沉默和组蛋白甲基化的影响；示意图与图表；基因表达研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：GFP RNAi 诱导的沉默与 RNAi 靶标位点 H3K9me3 富集水平升高相对应。 （A）生殖系表达的 GFP RNAi 报告基因 mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] 的示意图，标注了 qPCR 扩增区域。（B）在 21 °C 下进行 RNAi 处理后，各代中 GFP 表达的评分结果。误差条表示两次生物学重复的标准差。（C）来自两次生物学重复的 F1 代年轻成虫的 H3K9me3、组蛋白 H3 和 IgG 对照的 ChIP-qPCR 结果。clec-18 和 hrp-2 分别为 H3K9me3 富集的阳性和阴性对照位点。（D）GFP RNAi 报告基因位点的 H3K9me3 和组蛋白 H3 富集水平，相对于 clec-18 阳性对照位点进行归一化。（E）GFP RNAi 处理组与对照 RNAi 处理组动物之间 H3K9me3 和组蛋白 H3 富集水平的变化，归一化至 clec-18。虚线表示 1 倍变化量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种RNA干扰和染色质免疫沉淀实验，用于研究RNA干扰诱导的沉默及其相关染色质修饰在C. elegans中的表观遗传遗传。

利用荧光报告基因与染色质免疫沉淀（ChIP）分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的跨代表观遗传

跨代表观遗传（TEI）能够在不改变基因组序列的情况下，通过生殖系传递信息，其机制包括……

本实验室的研究重点是染色质相关蛋白、组蛋白修饰以及小RNA通路因子在发育过程和跨代表观遗传中的协同作用。利用GFP报告基因的RNA遗传检测已成为一种非常强大的工具。本实验方案详细描述了线虫的制备、评分和传代标准化流程，以及芯片样品的制备方法，有助于获得可重复的实验结果。研究生殖系表达的转基因时，一个实验难点在于分离出该转基因在动物生殖系中的效应。目前我们使用整个生物体进行芯片实验，但未来我们希望开发出能够特异性检测生殖系染色质状态的分析方法。我们的实验室关注组蛋白甲基化以及识别这些修饰标记的蛋白质。未来，我们希望研究这些染色质阅读蛋白与小RNA通路在转基因RNAi遗传及内源序列调控过程中的相互作用。通过在接种了OP50-1细菌的标准35毫米NGM平板上挑选三到四条产卵期的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）成虫，来准备用于RNAi遗传实验的动物。四天后，使用800微升添加了Triton X-100的M9缓冲液将产卵期成虫从平板上冲洗下来，收集至1.5毫升离心管中。重复洗涤步骤，并将线虫收集至一个离心管中。在1,000 G条件下离心线虫1.5至2分钟，随后吸除上清液，保留100微升液体，注意不要扰动线虫沉淀。向每管含有线虫沉淀的样品中加入650微升双蒸水。为了从收集的群体中分离秀丽隐杆线虫（C. Elegans）胚胎，加入250微升 freshly-prepared 漂白溶液，并启动计时器。每隔一到两分钟，将试管充分涡旋振荡。五分钟后，在体视显微镜下观察成虫的降解情况。继续涡旋振荡，直至线虫完全溶解，仅剩下胚胎。此过程通常需要六到七分钟。立即以1,000 G离心1.5分钟，并吸除上清液，留下约50至100微升上清液与胚胎一同保留。向胚胎中加入1毫升添加了Triton X-100的M9缓冲液，涡旋混匀。离心悬浮液，并重复洗涤两次。最后一次洗涤后，吸除上清液，管中保留约100微升。将分离的胚胎置于离心管中涡旋混匀，然后用移液器从每管中各取2微升，重复两次，滴加到标记好的玻璃载片上。使用计数器统计胚胎数量，以估算每微升中的胚胎浓度。为启动半同步化的种群生长，将约250个胚胎分别转移至含有表达GFP或对照RNAi载体的E.coli HT115细菌的RNAi NGM平板上。让液体充分吸收，将经RNAi处理的P0代线虫在21摄氏度下培养四天。开始制备琼脂糖垫：用玻璃巴斯德吸管吸取融化的1%琼脂糖，在黑胶唱片下方滴加一滴。将载玻片摆放至使唱片上的线条呈水平或垂直方向，然后迅速将载玻片置于琼脂糖液滴上，静置30秒。从记录中取出玻璃载玻片，在体视显微镜下加入约五微升新配制的五毫摩尔左旋咪唑。轻轻弹击含有线虫的离心管，将五至十微升样品转移至琼脂糖垫上以固定线虫。在添加过程中估算线虫数量，使每个重复样本中约有40条线虫。使用睫毛挑针将线虫排成行，并在载玻片上放置玻璃盖玻片。利用漂白法从剩余线虫中分离胚胎，并将250个胚胎接种到接种了OP50-1细菌的35毫米NGM平板上。在荧光体视显微镜下，使用GFP滤光片组，借助计数器对每份重复样品载玻片上的GFP阳性与GFP阴性线虫数量进行计数并记录。对每一代生殖系中细胞核GFP信号进行人工评分的结果显示，在经GFP RNAi处理的P0代和F1代线虫中，该转基因的沉默效应完全渗透。在F2代中，表现出GFP沉默遗传的个体占群体比例约为50%。到F5代时，大多数个体不再表现出沉默效应的遗传。到F10代时，所有线虫均表达GFP，且未检测到任何遗传现象。首先，将约 3,500 个秀丽隐杆线虫（C. elegans）F1 代胚胎接种至 14 个培养板中，在 21 摄氏度下培养三天，使其发育至年轻成虫阶段。使用 PBS/TX 缓冲液冲洗并收集线虫至 1.5 毫升离心管中，在 1,000 ×g 条件下离心 2 分钟。吸出并收集一个品系的线虫至一个离心管中。用 PBS/TX 重复洗涤三次。随后，吸去上清液，每管中保留 1 毫升，倒置混匀。重复三次计数 3 微升中的秀丽隐杆线虫（C. Elegans）数量后，计算线虫浓度，并转移相当于 3,000 条线虫的体积至新管，用于甲醛交联。首先，向含有线虫的管中加入甲醛，使其终浓度达到 1.8%，在室温下旋转孵育 6 分钟。随后，立即用液氮速冻管子，并将样品储存在 -80 摄氏度条件下。接下来，将甲醛交联样品在室温水浴中解冻三分钟，并在室温下旋转孵育16分钟。加入1.25摩尔的甘氨酸，使终浓度为125毫摩尔，并在室温下旋转孵育五分钟。此步骤完成后，将样品置于冰上或4摄氏度环境中，并在磁珠稀释前始终使用预冷的缓冲液。将样品在 1,000 G 条件下离心 3 分钟后，用 1 毫升 PBS/TX 洗涤 3 次。然后用 1 毫升重悬缓冲液洗涤 2 次。最后一次洗涤后，保留足够的缓冲液，确保总体积至少为沉淀体积的 3 倍，且最小体积不少于 100 微升。首先将90至120微升的甲醛交联秀丽隐杆线虫（C. Elegans）样品混匀，并分装到聚苯乙烯超声处理管中。加入等体积含有2倍去垢剂的重悬缓冲液。在水浴超声仪中进行超声处理，持续7分钟。用移液器轻轻混匀样品，并再次进行超声处理，额外持续七分钟。完成后，将超声处理后的裂解液转移至1.5毫升离心管中。加入一半体积的不含去垢剂的重悬缓冲液。在4°C、13,000 G条件下离心15分钟后，将裂解液上清分为四部分。将输入裂解液部分加入1.5毫升离心管中，于-20°C保存。向相应的免疫沉淀（IP）样品中分别加入0.5微克的抗H3K9三甲基化抗体、抗组蛋白H3抗体或IgG。将反应物在4°C条件下旋转孵育过夜。次日，将每个免疫沉淀样品中的9 µL Protein G包被的磁珠分装至1.5 mL离心管中。用1 mL FA 150缓冲液洗涤两次后，将磁珠重悬于FA 150缓冲液中。操作完成后，将7.5 µL磁珠悬浮液加入每种IP抗体混合物中，随后将各离心管置于4°C条件下旋转孵育2小时。接着，使用每种缓冲液至少200 µL对磁珠进行7次洗涤。每次洗涤均在4°C条件下旋转孵育5分钟，然后将离心管置于磁力架上收集磁珠，并吸除洗涤液。吸尽最后一次缓冲液洗涤液后，将磁珠重悬于50 µL染色质免疫沉淀洗脱缓冲液中，并转移至1.5 mL离心管。在恒温混匀仪中洗脱样品后，将磁珠置于磁力架上收集，然后将上清液转移至新的离心管中。再用另外50 µL染色质免疫沉淀洗脱缓冲液重复洗脱一次。完成后，将总共100 µL上清液合并，然后进行逆转交联和DNA洗脱。

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科研

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Genetics

遗传学

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