Name: TAGGG端粒长度测定性能参数优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 了解使用非放射性化学发光检测技术优化TAGGG端粒长度测定试剂盒的性能参数，建立标准化测量方案以提高端粒生物学研究的准确性和可靠性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Prachi Shah 女士在本实验方案初期优化过程中提供的帮助。感谢 Manoj Garg 博士提供 A2780 卵巢癌细胞系。EK 得到了生物技术部（编号 BT/RLF/Re-entry/06/2015）、科学技术部（ECR/2018/002117）研究基金以及 NMIMS 种子基金（IO 401405）的资助。

注意：有关下述实验步骤中使用的所有试剂的详细信息，请参见材料表。表1列出了实验室自制试剂及其优化用量，表2列出了市售试剂的工作浓度。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>将待测端粒长度的细胞（本实验使用 A2780 细胞，一种卵巢腺癌细胞系）培养于含 10% 胎牛血清（FBS）、链霉素、青霉素和两性霉素 B 的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）完全培养基中，置于 6 cm 培养皿内。于 37 °C、含 5% 二氧化碳的湿润恒温环境中培养，直至细胞融合度达到 80%–100%。</li>
	<li>移除培养基，并用 5 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>加入 1 mL 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，于 37 °C 孵育 3–5 分钟，使细胞脱落。</li>
	<li>加入 2 mL DMEM 完全培养基以中和胰蛋白酶活性，并将细胞收集至离心管中。</li>
	<li>在 2,348 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>用 1× PBS 洗涤沉淀物，并在 2,348 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀物储存于 -80 °C，待后续使用。 
	&#8203;注意：细胞数量可能因细胞系不同而有所差异。本实验中 A2780 细胞系可获得约 2.5 × 106 个细胞，用于后续步骤。</li>
</ol>
2. 基因组DNA提取
<ol>
	<li>向细胞沉淀中加入 500 µL 裂解缓冲液（10 mM tris-Cl，pH 8.0；25 mM EDTA，pH 8.0；100 mM NaCl；0.5% w/v 十二烷基硫酸钠），使用剪口枪头（开口直径至少 2 mm）轻轻混匀。加入 20 µg/mL 新鲜配制的 RNase A，通过轻柔颠倒混匀。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 30 分钟，孵育过程中偶尔颠倒离心管。</li>
	<li>加入蛋白酶 K 至终浓度为 100 µg/mL，轻柔颠倒混匀 10 次。在 55 °C 下孵育 2 小时，孵育期间定期颠倒离心管（每 10 分钟一次）。</li>
	<li>加入 500 µL 苯酚:氯仿:异戊醇试剂（25:24:1），轻柔颠倒混匀 20 次。在室温（约 25 °C）下以 9,391 × g 离心 15 分钟。 
	注意：图 1A 显示了离心后获得的三层结构。</li>
	<li>从可见的三层中取出黏稠的上层水相，使用剪口枪头转移至新的离心管中，加入等体积的氯仿，轻柔颠倒混匀 20 次。</li>
	<li>在室温下以 9,391 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>收集水相层，并加入适量的 5 M NaCl，使 NaCl 的终浓度为 0.2 M。</li>
	<li>加入两倍体积的 100% 乙醇，轻柔颠倒混匀 20–25 次。在室温下以 15,871 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 500 µL 70% 乙醇洗涤沉淀。在室温下以 15,871 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀在空气中干燥数分钟，加入 50 µL 无菌无核酸酶水。在室温下让 DNA 重新水合 1–2 天。使用剪口枪头通过移液混匀。</li>
	<li>使用紫外（UV）分光光度法测定 DNA 浓度。如有必要，使用无菌无核酸酶水重新稀释样品，使浓度至少达到 300–500 ng/µL。</li>
	<li>通过 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的完整性（图 1B）。</li>
	<li>将稀释后的 DNA 储存于 -20 °C，以备后续使用。</li>
</ol>
3. 基因组DNA的消化
<ol>
	<li>配制含有 Rsa1（20 U）和 Hinf1（20 U）的酶混合液，每反应加入 2 µL 限制性消化缓冲液。</li>
	<li>取适量基因组 DNA，使 DNA 总量为 1.5 µg。用无菌无核酸酶水补足体积，确保加入酶后总体积为 20 µL。</li>
	<li>轻轻弹击管壁充分混匀，然后短暂离心。</li>
	<li>将反应混合物在 37 °C 下孵育 2 小时。</li>
</ol>
4. 琼脂糖凝胶电泳
<ol>
	<li>使用高纯度琼脂糖，在1x TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液中制备一块10 cm × 15 cm、浓度为0.8%的琼脂糖凝胶。</li>
	<li>向每份已消化的基因组DNA样品中加入5 µL上样染料，使最终体积为25 µL，并将样品上样至凝胶中。</li>
	<li>通过混合1 µL分子量标记物（DNA Ladder）、3 µL无菌无核酸酶水和1 µL 5x上样染料，制备分子量标记物混合液。</li>
	<li>若样品数量较多（约10个），在已消化基因组DNA样品的两侧各上样5 µL分子量标记物混合液；若样品数小于或等于5个，则仅在一侧上样。</li>
	<li>以5 V/cm的电压电泳6小时。电泳结束后，在凝胶一角切出一个缺口，以标记上样顺序。</li>
	<li>将凝胶浸入0.25 M HCl溶液中，室温下轻轻振荡处理10分钟。</li>
	<li>用蒸馏水将凝胶漂洗两次。</li>
	<li>将凝胶浸入含0.5 M NaOH和1.5 M NaCl的溶液中，室温下轻轻振荡，每次15分钟，共变性两次，以实现DNA变性。</li>
	<li>用蒸馏水将凝胶漂洗两次。</li>
	<li>将凝胶浸入含0.5 M Tris-HCl和3 M NaCl（pH 7.5）的溶液中，室温下轻轻振荡，每次15分钟，共中和两次，以中和DNA。</li>
</ol>
5. Southern 印迹杂交
<ol>
	<li>裁剪一张尺寸为 10 cm × 12 cm 的尼龙膜，并在与凝胶相同位置处剪出一个缺口。</li>
	<li>将膜依次浸入蒸馏水和 20× 柠檬酸钠缓冲液（SSC 缓冲液）中进行活化（见表 1）。</li>
	<li>搭建转移装置。
	<ol>
		<li>取一个洁净的玻璃托盘，将另一个托盘倒置放入其中。用普通滤纸制作一根虹吸芯，使其两端接触外层托盘底部。</li>
		<li>将凝胶置于滤纸上。轻轻将已活化的尼龙膜覆盖在凝胶上，确保缺口对齐，并用玻璃棒滚压以去除气泡。</li>
		<li>在膜上方依次放置 9.5 cm × 11.5 cm 的纤维素滤纸堆（高约 2 cm），再覆盖相同尺寸的普通滤纸堆（高约 6 cm）。在滤纸堆上放置重物，确保下方压力均匀。向外部托盘中加入 20× SSC 缓冲液（见图 2）。</li>
		<li>静置过夜，完成转移。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Southern 转移完成后，将 DNA 固定于膜上：将膜置于紫外透射仪或紫外交联仪中进行 UV 交联。使用 302 nm、8 W 紫外灯照射 5 分钟，或使用 254 nm、8 W 紫外灯照射 2 分钟（能量约为 120 mJ）。确保 DNA 所在的一面朝向紫外灯。</li>
	<li>用 25 mL 的 2× SSC 缓冲液将膜清洗两次。</li>
	<li>如需暂停实验流程，可将膜完全干燥后用铝箔松散包裹，于 2–8 °C 保存，待后续处理。</li>
</ol>
6. 杂交与化学发光检测
<ol>
	<li>将预杂交缓冲液预热至 42 °C。 
	注意：以下步骤中所列溶液/缓冲液的用量为每 100 cm2 膜面积所需体积。</li>
	<li>将膜置于 10 mL 预热的预杂交缓冲液中，在 42 °C 下轻轻振荡孵育 1 小时，进行预杂交。</li>
	<li>每 5 mL 预热的预杂交缓冲液中加入 0.5 µL 端粒探针，配制杂交溶液。</li>
	<li>将膜在 10 mL 杂交溶液中于 42 °C 轻轻振荡孵育 3 小时。</li>
	<li>用严格性缓冲液 1（表 1）在室温下轻轻振荡洗涤膜两次，每次 10 分钟（每次 25 mL）。</li>
	<li>将严格性缓冲液 2（表 1）在 50 °C 预热 30 分钟。</li>
	<li>用严格性缓冲液 2 在 50 °C 轻轻振荡洗涤膜两次，每次 15 分钟（每次 25 mL）。</li>
	<li>在室温下用 15 mL 洗涤缓冲液轻轻振荡漂洗 5 分钟。</li>
	<li>将膜置于 10 mL 新鲜配制的 1× 封闭溶液中，在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。</li>
	<li>将膜置于 10 mL 碱性磷酸酶偶联的抗地高辛工作液中（见 表 2），在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。</li>
	<li>用洗涤缓冲液在室温下轻轻振荡洗涤膜两次，每次 15 分钟。</li>
	<li>将膜在 10 mL 检测缓冲液中于室温轻轻振荡孵育 5 分钟。</li>
	<li>去除多余的检测缓冲液，将膜 DNA 面朝上放置于杂交袋或醋酸纤维片上。滴加约 1–1.5 mL 底物溶液至膜表面，立即覆盖另一张薄膜，于室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>挤出多余的底物溶液，准备成像。</li>
	<li>在凝胶成像系统中对膜进行约 20 分钟的成像，于不同时间点采集多张图像。选择未饱和的图像用于后续分析。 
	&#8203;注意：若信号较弱，可延长成像时间。</li>
</ol>
7. 分析
<ol>
	<li>获取图像文件后，以最高可能分辨率（本例中为600 dpi）将图像导出为适用于出版的 .tif 格式。</li>
	<li>安装 Telotool 软件。该软件需要特定版本（R2012a）的 MATLAB（可免费获取）才能运行。</li>
	<li>打开软件，点击右上角的 加载图像文件 按钮。</li>
	<li>图像加载完成后，点击 反转图像，使图像背景变为黑色，而条带/弥散区域为白色。</li>
	<li>从加样孔开始，以图像的上角为起点进行裁剪。完成裁剪区域选择后，在区域内单击右键，选择 裁剪图像。</li>
	<li>图像裁剪完成后，点击 计算泳道，使系统自动进行泳道检测。</li>
	<li>如果泳道未被正确检测，例如某些泳道完全未被识别，或检测出额外或不完整的泳道，请按以下方法进行泳道调整。
	<ol>
		<li>点击 调整泳道，在弹出的窗口中根据需要添加和/或调整泳道，然后点击 应用并关闭。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整泳道后，确保每条泳道上均显示一个红色圆点，并使用 标准品拟合 按钮调整标准品，确保两个标准品泳道中的峰数量处于相同位置。使用 删除极值 按钮删除任何多余的峰。</li>
	<li>标准品调整完成后，选择 泳道轮廓，点击 标准品拟合，然后选择 多项式拟合。</li>
	<li>按照软件建议，点击 趋势线，然后在下一项中选择 校正后。</li>
	<li>点击 获取结果，以表格形式显示结果，其中 平均TRF 行即为相应泳道样品的端粒长度测量值。</li>
	<li>点击 全部保存，将结果以电子表格形式存储。</li>
</ol>

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

<ol><li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Telomere length regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).</li>
<li>Valdes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+cigarette+smoking%2C+and+telomere+length+in+women%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women.</a> Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).</li>
<li>Allsopp, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+predicts+replicative+capacity+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).</li>
<li>Epel, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+telomere+shortening+in+response+to+life+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Accelerated telomere shortening in response to life stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).</li>
<li>Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+telomere+length+quantification+by+FISH+and+its+application+to+human+population+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).</li>
<li>Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+as+a+marker+of+cellular+aging+is+associated+with+prevalence+and+progression+of+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).</li>
<li>Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+variations+in+aging+and+age-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Aging+Science%22%5BJournal%5D)">Telomere length variations in aging and age-related diseases.</a> Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).</li>
<li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+restriction+fragment+%28TRF%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Telomere restriction fragment (TRF) analysis.</a> Bio-Protocol. 5 (22), e1658(2015).</li>
<li>Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+and+its+role+in+the+aging+pathways%3A+telomere+shortening%2C+cell+senescence+and+mitochondria+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction.</a> Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).</li>
<li>Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TeloTool%3A+a+new+tool+for+telomere+length+measurement+from+terminal+restriction+fragment+analysis+with+improved+probe+intensity+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 21(2014).</li>
<li>Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+terminal+restriction+fragment+analysis+for+quantifying+telomere+length+using+in-gel+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e56001(2017).</li>
<li>Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+restriction+fragments+%28TRF%29+method+to+analyze+telomere+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths.</a> Bio-protocol. 5 (23), e1671(2015).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Trigodet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+molecular+weight+DNA+extraction+strategies+for+long-read+sequencing+of+complex+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes.</a> Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).</li>
<li>Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+telomere+length+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of telomere length measurement methods.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451(2018).</li>
<li>Mochida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+size+and+telomerase+activity+in+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+and+EBV-negative+Burkitt%27s+lymphoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines.</a> Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).</li>
<li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+senescence%2C+telomere+shortening+and+cell+proliferation+rate+in+Gaddi+goat%27s+skin+fibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line.</a> Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).</li>
<li>Michaeli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+telomere+length+correlates+with+extended+female+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility.</a> Cells. 11 (3), 513(2022).</li>
<li>Lesmana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+reference+intervals+for+leukocyte+telomere+length+in+children%3A+the+method+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

我们描述了一种基于化学发光、非放射性的端粒长度检测方法的详细实验步骤，该方法采用Southern印迹技术。本方案经过优化，可在不影响结果质量的前提下合理使用多种试剂。预杂交和杂交缓冲液最多可重复使用五次。每1.5–2 µg基因组DNA所用的酶浓度可在10–20 U之间变动，而不影响实验结果。其他多种试剂盒组分，如地高辛（DIG）标记的分子量标记物和杂交探针，均可在低于推荐浓度的条件下使用。优化后的用量详见表2。我们已测试将其用量或浓度减半的情况，仍可获得最佳实验效果。采用这些优化步骤可极大降低每个样本的检测成本，从而使研究人员能够大规模应用此方法进行端粒长度的测定。
已有多种发表的TRF实验方案。我们对市售试剂盒方案进行了优化，以提高其成本效益。本方案与部分已发表的方案不同，不使用放射性物质11,12。此外，该方案相对简便，使用试剂盒中的组分而非自行配制试剂，特别是端粒探针13。</p...

端粒是位于染色体末端的重复DNA序列，包含串联重复的TTAGGG序列，通过保护染色体末端免于磨损以及解决末端复制问题来维持基因组的完整性。末端复制问题指的是DNA聚合酶无法完全复制3'端突出部分1,2。端粒过短会导致细胞内出现染色体异常，从而使细胞永久停滞于一种称为复制性衰老的阶段3。端粒过短还会引发一系列其他问题，例如线粒体功能障碍4,5以及细胞功能异常。
细胞每次分裂时都会丢失端粒DNA重复序列，平均每年丢失25至200个碱基对6，经过一定次数的分裂后会导致细胞衰老6。衰老与共病频率升高相关，其特征表现为端粒长度缩短7。如Mender所述，端粒限制性片段（TRF）分析是一种成本很高的方法8，因此在大多数研究中并未用于端粒长度的定量分析。
目前，大多数流行病学研究采用基于定量聚合酶链式反应（qPCR）的方法来测量端粒长度。然而，qPCR方法是一种相对测量法，因为它测量的是端粒与单拷贝基因扩增产物之间的比值，而非端粒的绝对长度。使用TRF（末端限制性片段）方法测量端粒长度是公认的金标准，因为它能够测量样本中端粒长度的分布情况，并以千碱基（kb）为单位用绝对数值表示测量结果。然而，该方法的应用受到限制，因其操作繁琐、劳动强度大且成本较高。本文中，我们介绍了一种基于化学发光的TRF端粒长度测量优化方案。
TRF 分析包括七个主要步骤：1）培养细胞以提取基因组 DNA，2）使用苯酚:氯仿:异戊醇（P:C:I）法提取基因组 DNA，3）对基因组 DNA 进行限制性酶切，4）琼脂糖凝胶电泳，5）将限制性酶切后的 DNA 片段进行 Southern 印迹，6）杂交与检测 通过 化学发光——通过碱性磷酸酶的高灵敏度化学发光底物二钠 2-氯-5-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5-氯三环[3.3.1.13.7]癸烷)]-4-基)-1-苯基磷酸盐（CDP-Star）显影固定化的端粒探针；7）分析这些端粒弥散条带以获得平均端粒长度及长度范围信息。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A2780（卵巢腺癌细胞系）</td><td>作为礼物获赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+（用于成像和紫外交联）</td><td>Biorad</td><td>Universal hood II (721BR14277)</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop（Epoch 2）</td><td>Biotek</td><td>EPOCH2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TeloTool</td><td>版本 1.3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Molychem</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>MP</td><td>180720</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>HyClone, Cytiva, USA</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸&amp;nbsp;</td><td>Molychem</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（HI FBS）</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Molychem</td><td>76-47-01-0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Molychem</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Molychem</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>尼龙膜</td><td>Sigma</td><td>11209299001</td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Affymetrix</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BIORAD</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman滤纸</td><td>GE healthcare lifesciences</td><td>1001-917</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG AP</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>封闭液（10x）</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B6004</td><td></td></tr><tr><td>检测缓冲液（10x）</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>Dig easy hyb</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>消化缓冲液</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>Hinf 1</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>Hinf 1（试剂盒替代品）</td><td>NEB</td><td>R0155T</td><td></td></tr><tr><td>上样染料</td><td>BIOLABS</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>马来酸缓冲液（10x）</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>分子量标记物</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>探针</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>Rsa 1</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>Rsa 1（试剂盒替代品）</td><td>NEB</td><td>R0167L</td><td></td></tr><tr><td>底物</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td><td>12209136001</td><td></td></tr></tbody></table>

taggg端粒长度检测法性能参数的优化

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

端粒是位于染色体末端的重复序列，其缩短是人类体细胞的一个典型特征。端粒缩短是由于末端复制问题以及缺乏端粒酶所致，端粒酶是负责维持端粒长度的酶。有趣的是，端粒长度也会因多种内部生理过程（如氧化应激和炎症）而缩短，而这些过程可能受到污染物、病原体、营养物质或辐射等细胞外因子的影响。因此，端粒长度是评估衰老及多种生理健康状况的优良生物标志物。TAGGG端粒长度检测试剂盒采用端粒限制性片段（TRF）分析法来定量平均端粒长度，具有高度可重复性。然而，该方法成本较高，因此不常用于大样本量的常规检测。本文中，我们描述了一种经过优化、经济高效的端粒长度检测详细实验方案，该方法基于Southern印迹或TRF分析，并采用非放射性化学发光检测技术。

提取的基因组DNA（gDNA）在1%琼脂糖凝胶上电泳后显示出良好的完整性，如图1B所示，表明该样品可用于后续的TRF分析。随后通过调整每一步所需溶液的体积进行TRF实验（见表1和表2）。TRF信号清晰可见（图3）。因此，通过调整溶液体积和浓度，可以在不影响结果的前提下处理更多样品，并且可以使用免费软件（如Telotool10）成功测定端粒长度。
<img alt="DNA提取过程、相分离示意图以及核酸分析的凝胶电泳结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65288/65288fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
<strong c...

本文详细描述了使用非放射性化学发光检测法测定端粒长度的实验方案，重点优化了TAGGG端粒长度检测试剂盒的多个性能参数，例如缓冲液体积和探针浓度。

TAGGG端粒长度检测法性能参数的优化

端粒是位于染色体末端的重复序列，其缩短是人类体细胞的一个特征性现象。缩短……

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

我们的研究范围包括测量不同研究组之间的端粒长度差异。我们试图回答的问题主要围绕生理状况相关疾病，以及这些疾病如何影响端粒长度，反之亦然。目前用于推动端粒长度生物学研究的技术包括纳米孔测序，以及近期发展的基于CRISPR-Cas的测量方法。目前实验面临的挑战是准确测量端粒的绝对长度及其变化。同一份样本在使用不同的端粒长度测量方法时，可能会得到不同的结果。我们所要解决的研究空白在于缺乏一种标准化的端粒长度测量方法。端粒限制性片段分析（TRF）仍是评估所有新技术的标准。此外，我们优化的实验流程有助于在资源有限的情况下处理更多样本。我们的研究结果将通过提供一种可靠且相对经济的方法来将新方法与TRF这一金标准进行比较，从而推动端粒长度生物学领域的研究进展。我们的实验室将重点研究小分子抑制剂对端粒长度的影响。我们还将探讨生活方式疾病与端粒长度之间的相互作用。首先，向先前获得的 A2780 细胞沉淀中加入 500 µL 裂解缓冲液，并使用最小开口直径为 2 mm 的去尖枪头轻轻混匀。加入终浓度为 20 µg/mL 的新鲜配制的 RNase A，通过轻柔颠倒混匀。在 37 °C 下孵育 30 分钟。孵育结束后，加入蛋白酶 K 至终浓度为 100 µg/mL，并轻轻颠倒 10 次。再次于 55 摄氏度孵育一小时，每 10 分钟倒置离心管一次。用移液器将 500 微升漏斗状氯仿异戊醇试剂加入离心管中，轻轻倒置离心管约 20 次。于室温下以 9,391 ×g 离心 15 分钟。用移液器将上层水相黏稠层转移至新离心管中。加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀。离心一次后，收集水相层。加入适量的5摩尔氯化钠至离心管中，使浓度增加0.2摩尔。向管中加入两倍体积的100%乙醇，并轻轻颠倒混匀20次。在室温下以15,871 ×g离心5分钟。弃去上清液后，加入 500 微升 70% 乙醇。在相同条件下再次离心，然后弃去上清液。待沉淀物空气干燥后，加入 50 微升无菌无核酸酶水，使其重新水合。然后使用剪去末端的吸头通过移液操作混匀DNA。采用紫外分光光度法测定DNA的浓度。DNA消化完成后，使用0.8%琼脂糖凝胶进行分离。将琼脂糖凝胶浸入0.25摩尔盐酸溶液中，在室温下轻轻振荡10分钟。然后用蒸馏水冲洗凝胶两次。为使DNA变性，将凝胶浸入氢氧化钠和氯化钠溶液中。然后，用蒸馏水冲洗凝胶两次。为中和DNA，如图所示，将凝胶浸入pH为7、含有0.5摩尔盐酸和3摩尔氯化钠的溶液中。提取的基因组DNA显示出良好的完整性，表明其可用于后续端粒限制性片段的加工处理。进行Southern印迹杂交时，首先将尼龙膜裁剪成10厘米×12厘米大小的片段。在与凝胶相同的位置上剪出一个缺口。通过将膜浸入蒸馏水中，随后浸入20×SSC缓冲液中，以活化膜。将滤纸灯芯置于双层倒置托盘上，使其两端接触外层托盘的底部。将凝胶放置在滤纸上方。然后将活化的尼龙膜覆盖在凝胶上，确保切口位置对齐。用玻璃棒去除所有气泡。放置一堆高度为2厘米、尺寸为9.5 × 11.5厘米的纤维素滤纸，以及另一堆高度为6厘米的普通滤纸。在装置上方放置一个重物以确保重量均匀分布。在外层托盘中加入20×柠檬酸钠缓冲液（SSC），并过夜孵育以实现高效转印。Southern转印后，使用紫外透射仪通过紫外交联将转印至膜上的DNA固定。用25毫升2× SSC缓冲液洗涤膜两次。进行杂交时，将膜置于10毫升预热的预杂交缓冲液中孵育，并在孵育过程中频繁手动轻轻振荡膜。然后，将印迹膜置于10毫升杂交缓冲液中，在42摄氏度下轻轻振荡孵育3小时。用25毫升严格洗涤缓冲液在室温下轻轻振荡洗涤印迹膜两次，每次10分钟。接着，用25毫升预热至50摄氏度的严格洗涤缓冲液轻轻振荡洗涤印迹膜两次，每次15分钟。用 15 毫升洗涤缓冲液在室温下轻轻振荡洗涤 5 分钟。将膜置于 10 毫升新鲜配制的封闭液中，在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。然后将其放入含有碱性磷酸酶标记的抗地高辛工作溶液 10 毫升中。在室温下用洗涤缓冲液洗涤印迹膜两次，每次15分钟。随后在10毫升检测缓冲液中室温孵育5分钟。去除多余缓冲液后，将膜放置在醋酸纤维素膜上，DNA面朝上。将约1至1.5毫升底物溶液逐滴加至膜上。立即在膜上覆盖另一张醋酸纤维片，于室温孵育5分钟。成像前挤出多余的底物溶液。使用凝胶成像系统，在不同时间点采集多个未饱和的图像用于分析。在进行Southern印迹和杂交后，端粒限制性片段清晰可见，表现为一条弥散条带。

optimization-performance-parameters-taggg-telomere-length

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

TAGGG端粒长度测定性能参数优化

本文描述了一种准确、快速、精密且低成本的方法，利用qRT-PCR技术在多种组织和物种中检测端粒长度。此外，我们还将介绍一种简单的检测端粒酶活性的实验方法，作为端粒长度检测的互补性基础实验。...

端粒长度与端粒酶活性：细胞衰老的阴阳平衡

本文讨论了一种使用改良末端限制性片段分析法来定量端粒长度的详细实验方案，该方法可快速高效地直接测量端粒长度。该技术可应用于多种DNA细胞来源，用于定量端粒长度。...

使用凝胶内杂交法进行改良末端限制性片段分析以定量端粒长度

ATAC-Seq 在癌症表观遗传学研究中的优化

基于转录组学的低成本药物筛选

本文介绍了一种利用单色多重定量聚合酶链式反应（MMqPCR）检测法测定相对端粒长度（TL）的实验方案。MMqPCR检测法是一种可重复、高效且经济的方法，适用于在基于人群的研究中测定人源DNA的端粒长度。...

单色多重定量聚合酶链式反应端粒长度测量

对...的了解不足 体内 纳米药物的性能阻碍了其临床转化。用于评估的程序 体内...

全面评估的综合流程 在体 内 癌症纳米药物的性能评估

本研究报道了两种用于分析细胞侵袭和迁移的不同方法：Boyden小室实验和 体外...

细胞侵袭与迁移过程的评估：基于视频显微镜的划痕伤口实验与Boyden小室实验的比较

细胞迁移对于发育、组织维持与修复以及肿瘤发生至关重要，其过程受到生长因子、趋化因子和细胞因子的调控。本实验方案描述了点迁移实验（dot...

利用点阵分析法研究细胞层的迁移

需要一种动物模型来解析循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移过程中促进肺部定植的作用。在此，我们建立并成功实施了一种体内检测方法，专门用于验证CTC表面聚合纤连蛋白（polyFN）组装对肺部定植的必要性。...

肺组织中循环肿瘤细胞可视化肺定植检测方法的建立

本文介绍了一种全面的评估流程 体外...

全面评估的综合流程 体外 使用球体出芽实验评估假定性血管母细胞瘤新生血管形成能力

了解使用非放射性化学发光检测技术优化TAGGG端粒长度测定试剂盒的性能参数，建立标准化测量方案以提高端粒生物学研究的准确性和可靠性。

TAGGG端粒长度检测法性能参数的优化

探索更多视频