Name: 一种可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的三维技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 了解结合电子显微镜与三维重建技术可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的方法。该技术无需昂贵设备即可实现细胞器的定性与定量分析，为癌症病理机制研究提供高效灵活的新型手段。

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本研究得到浙江省自然科学基金（Z23H290001、LY19H280001）；国家自然科学基金（82274364、81673607 和 81774011）；以及湖州市科技计划公益性研究项目（2021GY49、2018GZ24）的资助。我们感谢浙江中医药大学中医科学院医学研究中心公共平台提供的大力支持、技术协助和实验支持。

1. 材料准备
<ol>
	<li>将 2 × 106 个 Panc02 细胞接种于 12 mL DMEM 培养基（含 10% 胎牛血清和 100 U/mL 青霉素-链霉素）中，在 37 °C、95% 湿度、5% 二氧化碳和 95% 空气的气氛中培养 48 小时。</li>
	<li>收集 Panc02 细胞，以 28 × g 离心 2 分钟，弃去上清液。确保样品量适当（1 × 107 个细胞），否则后续的固定和脱水步骤将无法有效进行。</li>
	<li>向 1.5 mL 微量离心管中加入 1 mL 2.5% 戊二醛固定液，于 4 °C 过夜固定新鲜 Panc02 细胞。 
	注意：在后续各步骤（步骤 1.3–1.11）中，样品均需以 1,006 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除固定液，用 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下清洗样品两次，每次 10 分钟，再用双蒸水（ddH2O）清洗两次，每次 10 分钟。</li>
	<li>加入 50 µL 含 1% 四氧化锇（OsO4）和 1.5% 亚铁氰化钾的溶液（体积比 1:1），于 4 °C 反应 1 小时。然后用 0.1 M PBS 清洗两次，每次 10 分钟，再用 ddH2O 清洗 10 分钟。</li>
	<li>加入 1 mL 1% 硫代碳酰肼（TCH）溶液，室温孵育 30 分钟至 1 小时，然后用 ddH2O 清洗四次，每次 10 分钟。</li>
	<li>加入 50 µL 1% OsO4 溶液，室温固定 1 小时，然后用 ddH2O 清洗四次，每次 10 分钟。</li>
	<li>加入 1 mL 2% 醋酸铀溶液，于 4 °C 过夜孵育，然后用 ddH2O 清洗四次，每次 10 分钟。</li>
	<li>加入 1 mL Walton 溶液（将 0.066 g 硝酸铅溶解于 10 mL 0.03 mol/L 天冬氨酸储备液中），于 60 °C 继续孵育 1 小时。</li>
	<li>用 ddH2O 清洗四次，每次 10 分钟，然后依次用梯度乙醇溶液脱水，每次 10 分钟：50% 乙醇、70% 乙醇、80% 乙醇、90% 乙醇各一次，100% 乙醇两次。再用 100% 丙酮脱水两次，每次 10 分钟。每次使用 1 mL 溶液进行脱水。</li>
	<li>将 200 µL 丙酮与 Pon 812 环氧树脂按 3:1、1:1 和 1:3 的比例混合，将样品分别在室温下浸泡于树脂中 2 小时、4 小时和 4 小时，最后用 100% Pon 812 环氧树脂浸透过夜。 
	注意：在进行染色和树脂包埋操作时，必须在通风橱中进行，因为这些物质具有毒性。此外，实验过程中必须穿戴实验服和耐溶剂手套。</li>
	<li>将样品放入包埋模具中，置于 60 °C 烤箱中聚合 48 小时。采用平面包埋29 以减少样品周围树脂的形成，从而简化样品安装过程，并降低后续图像分割中电荷伪影的影响。 
	注意：若需获得水平切面，可在模具孔中加入少量树脂，注意不要过满。</li>
	<li>先清洗硅片，再用浓 H2SO4/H2O2 溶液处理 30 分钟使其亲水化。使用超薄切片机将厚度为 70 nm 的连续切片条收集到亲水化处理的硅片上，并在 60 °C 烤箱中干燥 10 分钟。 
	注意：当切片漂浮至硅片表面时，应缓慢捕获，以防止切片丢失或变形。</li>
</ol>
2. 图像采集与三维重建
<ol>
	<li>在将硅片安装到载物台之前，用蒸馏水清洗切片三次，并使其自然风干。裁剪一段尺寸为1 cm × 0.5 cm的导电碳胶带，将其粘贴在硅片与扫描电镜（SEM）样品台之间，以完成样品的安装（图2E）。</li>
	<li>将场发射扫描电镜（FE-SEM）的加速电压参数设置为2 kV，工作距离设为4 mm（图3B和表1）。 
	注意：为了提高信噪比并减少图像噪声，应尽可能在低倍率下进行观察。随着放大倍数的增加，扫描电镜的扫描范围减小，导致图像上的电荷积累增加。</li>
	<li>点击顶部菜单栏中的H/L图标。首先在低倍率下对目标切片条带的第一个切片进行定位，然后再次点击H/L选项（图3A），切换至高倍率模式；通过调节图像亮度、对比度和放大倍数，获取目标结构的合适图像。</li>
	<li>选择项目视图 &#62; 打开数据，并将待分析的图像文件导入软件中。</li>
	<li>点击对齐切片 &#62; 编辑（图4B）以对图像进行对齐，并通过调整图像透明度，在左下角菜单栏中调节强度范围的数值。此处采用半自动对齐策略；具体而言，先通过自动对齐使图像与前一张图像重叠，再进行手动微调。 
	注意：本研究中，在对齐过程中以前一张图像为参考，利用移动和旋转操作，使两张图像中的目标结构最大程度重叠。点击对齐当前切片对可实现图像的自动对齐，但可能出现错位情况。</li>
	<li>选择提取子体积模块，将对齐后的数据集裁剪至整个图像堆栈重叠部分的尺寸范围。</li>
	<li>在分割子部分（图4C）下，选择重采样 &#62; 分割 &#62; 保存。选择魔棒工具的阈值和画笔工具的大小，以确定正确的选择范围。此处再次采用半自动分割方法：首先使用魔棒工具自动选择一个适当的大面积区域，然后使用画笔工具精确描绘细节。 
	注意：魔棒工具可通过调整掩膜值并使用绘制限制线，基于目标结构与周围结构之间像素强度的明显差异来实现图像分割。但该工具无法区分图像采集过程中产生的电荷伪影，因此可能导致目标区域分割错误。画笔工具可用于手动分割，以精确重建生物结构。</li>
	<li>在分割 &#62; 选择下，点击+图标以添加选定区域（图4C）。</li>
	<li>重复上述步骤（2.8），在不同图像中选择相同的目标结构，直至完成目标微结构三维重建所需的全部选择。 
	注意：在进行线粒体重塑过程的研究时，目标对象的选择必须从一组连续图像的中间图像开始。若从第一张或最后一张图像开始选择，重建结果将无法呈现完整的三维可视化效果。</li>
	<li>完成区域分割后，根据目标结构的大小和图像分辨率选择最佳参数生成图像文件。点击裁剪编辑器，然后在虚拟滑块框中输入数字6（图4C）。</li>
	<li>在左侧下拉菜单中，右键点击项目子部分下的灰色区域，选择生成表面 &#62; 创建 &#62; 应用。在生成的文件中，使用表面视图模块创建表面结构及三维表示。</li>
</ol>
3. 定量分析
<ol>
	<li>单击 去除小斑点 &#62; 应用（图4D）。在项目子部分中，右键单击灰色区域，然后选择标签分析 &#62; 应用（图4D）。</li>
	<li>自定义列的名称，并选择一个测量组。从原始测量值框中选择Volume3d和Length3d。</li>
	<li>单击屏幕左下角的应用按钮。复制数据，并在统计软件（如GraphPad）中作图。</li>
</ol>

3D Technique to Visualize Mitochondrial Cristae in Pancreatic Cancer Cells

作者声明无利益冲突。

本文介绍的方法为应用三维重建技术提供了一个实用的分步指南，该技术涉及将电子显微镜与图像处理技术相结合，对连续超薄切片产生的二维断层图像进行堆叠与分割。本方案强调了二维图像存在的一项局限性，即可通过细胞器超微结构的三维可视化加以克服，后者具有高分辨率下结构可重复性强和准确性更高的优势。更重要的是，这种三维可视化技术可应用于肿瘤细胞，使病理机制的研究更加直观且可靠。本研究通过比较在不同条件下获取的三组连续切片，实现了对线粒体嵴立体结构的可视化，从而验证了RSL3在癌细胞中诱导线粒体嵴膜降解的现象56。这些结果为阐明RSL3作为抗胰腺癌药物的作用机制提供了新的见解。
获取高分辨率二维图像在实现线粒体嵴三维重构57过程中具有重要作用，图像质量直接影响重构结果22,58。因此，该方法也存在一些局限性，例如扫描电镜（SEM）图像中产生的荷电伪影59...

线粒体是细胞中最重要的细胞器之一。它们是细胞生物能量学和代谢的核心枢纽1,2，并在癌症中发挥关键作用3。胰腺癌（PC）是治疗难度最大的癌症之一4，因其扩散迅速且死亡率高。线粒体功能障碍主要由线粒体形态的改变引起3,5,6,7，已被证实与胰腺癌的疾病机制相关8。线粒体还具有高度动态性，表现为其网络连接性和嵴结构频繁而动态的变化9。嵴结构的重塑可直接影响线粒体功能和细胞状态10,11，而这些在肿瘤细胞生长、转移以及肿瘤微环境变化过程中均发生显著改变12,13。
近年来，科学家利用透射电子显微镜观察研究该细胞器14,15,16,17；例如，研究人员已采用三维重建技术分析线粒体动力学特征6,7,18,19。电子显微镜图像三维重建的总体概念与方法早在1968年即已正式确立20，当时通过结合电子显微术、电子衍射技术与计算机图像处理，成功重建了T4噬菌体尾部结构。迄今为止，电子显微镜三维成像技术在图像分辨率21、自动化程度22以及数据处理通量23方面均取得了显著进展，并已在生物学研究中得到日益广泛的应用，其应用范围从组织水平延伸至纳米尺度下的细胞器超微结构水平24。近年来，电子显微镜三维成像技术也成为多种研究领域中极具前景的技术手段25,26,27。
线粒体嵴日益受到关注，这尤其凸显了对超微结构体积成像的迫切需求。透射电子显微镜（TEM）已被用于观察载于铜网（400目）上的样品28，电子束穿过样品切片进行成像。然而，由于铜网承载范围有限，无法对同一样品的连续切片进行完整成像29，这给TEM成像过程中目标结构的研究带来了困难。此外，TEM依赖于耗时且易出错的手动操作，包括连续切片、收集多个切片并逐一切片成像21，因此不适用于大体积样品的超微结构重建23。目前，大体积样品的高分辨率重建依赖于专用设备，例如透射电镜相机阵列（TEMCA）30或第二代TEMCA系统（TEMCA2）31，这些设备可在短时间内实现自动化高通量成像。然而，此类成像技术因需定制化设备，难以普及，不具备易于获取和通用的优势。
与透射电子显微镜（TEM）相比，基于扫描电子显微镜（SEM）自动生成大范围区域数千张连续三维图像的方法32,33 提高连续成像的效率和可靠性，并实现更高的z轴分辨率34例如，连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）和聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）均实现了高速、高效且高分辨率的超微结构三维重建35,36然而，使用SBF-SEM的金刚石刀或FIB-SEM的聚焦离子束进行切削时，不可避免地会通过机械切削去除块体表面材料。33,37由于这两种方法会对样品造成破坏，无法再次重建相同的靶结构以进行进一步分析38,39,40此外，很少有研究尝试利用电子显微镜重建癌细胞的三维细胞器超微结构以观察病理变化12因此，为了进一步阐明癌细胞（如胰腺癌细胞）的病理机制，我们提出一种利用超薄切片机和场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）对连续切片图像进行三维重建的新技术，以在嵴水平上分析线粒体的超微结构；该技术可通过一种高效且易于实现的方法获取高分辨率数据。使用超薄切片机制备的连续超薄切片可长期保存于载网盒中，即使多年后仍可多次重新成像。41场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）因其能够提供高分辨率成像、高放大倍数以及多功能性，被广泛视为多个研究领域中极具价值的工具42为了以三维形式展示细胞器的精细结构，采用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）产生的背散射电子获取具有足够分辨率的连续二维图像堆栈的技术43,44 也可用于在无需特殊设备的情况下，对目标区域或其相关结构进行高通量、多尺度成像45电荷伪影的产生直接影响所获取图像的质量，因此保持较短的停留时间尤为关键。
因此，本研究详细阐述了采用该扫描电镜技术重建线粒体嵴三维结构的实验步骤46。具体而言，我们展示了为实现线粒体区域的半自动分割并利用Amira软件进行三维重建数字化所开发的流程，该流程还包括使用传统的OTO样品制备方法制备切片样品44,47，通过超薄切片机完成切片收集，以及利用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）获取连续的二维数据。

<table><tbody><tr><td>(1S,3R)-RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>SIGMA</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td>2020.2</td></tr><tr><td>天冬氨酸</td><td>MCE</td><td>HY-42068</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔&amp;rsquo;s medium</td><td>Gibco</td><td>11995115</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>默克</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>MCE</td><td>HY-100579</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>场发射扫描电子显微镜</td><td>HITACHI</td><td>SU8010</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10500.22</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铅</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-211724</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-206008B</td><td></td></tr><tr><td>Panc02</td><td>欧洲认证细胞培养库&amp;nbsp;</td><td>98102213</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Biosharp</td><td>BL505A</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Pon 812 环氧树脂</td><td>SPI CHEM</td><td>GS02660</td><td></td></tr><tr><td>亚铁氰化钾</td><td>Macklin</td><td>P816416</td><td></td></tr><tr><td>硫代碳酰肼</td><td>默克</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>LEICA</td><td>EMUC7</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>RHAWN</td><td>R032929</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的三维技术

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

了解细胞器超微结构的动态特征对于机制研究至关重要，这些特征不仅包含大量未知信息，而且从三维（3D）角度来看也极为复杂。电子显微镜（EM）具有良好的成像深度，能够重建高分辨率的图像序列，从而在纳米尺度上研究细胞器的超微结构形态；因此，3D重建因其无可比拟的优势而日益重要。扫描电子显微镜（SEM）提供了一种高通量的图像采集技术，可对连续切片中同一感兴趣区域进行成像，进而重建大尺度的三维结构。因此，SEM在大规模3D重建中的应用正变得越来越普遍，以恢复细胞器真实的三维超微结构。在本实验方案中，我们提出结合连续超薄切片与3D重建技术，用于研究胰腺癌细胞中线粒体嵴的结构。本方案以逐步说明的方式详细描述了这些技术的具体操作步骤，包括四氧化锇-硫碳酰肼-四氧化锇（OTO）染色法、连续超薄切片成像以及三维可视化展示。

在细胞培养过程中（图1A），我们首先将胰腺癌细胞分为对照组，用完全培养基培养，以及用(1S,3R)-RSL3处理的实验组48 （RSL3，一种铁死亡激活剂，100 nM）组，以及 RSL3（100 nM）联合 ferrostatin-1 组49 （Fer-1，一种铁死亡抑制剂，100 nM）组。通过上述实验步骤，扫描电子显微镜获得了38（补充图1), 43 (补充图2），以及44（补充图3) 对照组、RSL3组和抑制剂组（RSL3 + Fer-1组）的连续图像。图像分辨率为1,280 × 960像素，放大倍数为8,000倍（分辨率为12.40 nm/像素）。在切片上方的细胞区域内未观察到皱褶和污染。透射电镜图像可清晰区分细胞内的细胞器，如线粒体和内质网。图1E).
<p class=...

本方案描述了如何重建线粒体嵴以实现高精度、高分辨率和高通量的三维成像。

了解细胞器超微结构的动态特征，这些特征不仅富含未知信息，而且在结构上极为复杂，从……

本项目旨在通过改变亚细胞纳米尺度的超微结构，研究药物的抗癌作用，并建立细胞器形态与癌症病理机制之间的关联。该技术结合了传统的电子显微技术与三维重建技术，无需特殊设备。与其他技术相比，该方法可提高成像效率和重建灵活性，能够随时对目标结构进行真实形态的三维重建，因此具有高度的便捷性和普适性。这种连续超薄切片三维重建技术无需特殊昂贵设备，可反复真实还原立体结构。该技术可随时对所有细胞器进行定性和定量分析，实现了超微结构观察的简便操作。首先，将200万个Pan02细胞接种于12毫升DMEM培养基中，在37°C、95%湿度、5%二氧化碳和35%空气条件下培养。48小时后，在28 ×g条件下离心培养物2分钟，并弃去上清液。在1.5毫升微量离心管中加入1毫升2.5%戊二醛，于4°C固定细胞，过夜。第二天，将样品在1006 g下离心5分钟，吸除固定液，然后用0.1摩尔PBS冲洗样品两次。随后用双蒸水冲洗样品两次，每次10分钟。接着加入50微升1%四氧化锇和1.5%亚铁氰化钾按1:1比例配制的溶液，在4摄氏度下孵育1小时。将样品用0.1摩尔PBS离心并冲洗两次，再用双蒸水冲洗一次。然后加入1毫升1%硫代碳酰肼，室温孵育30至60分钟。孵育后，离心并弃去上清液，再用双蒸水冲洗样品四次。接着，加入50微升1%四氧化锇，室温下固定1小时。再次离心，并用双蒸水冲洗样品四次。加入1 mL 2%醋酸铀酰溶液，在4°C下染色过夜。用双蒸水冲洗样品后，加入1 mL Walton溶液，在60°C下孵育1小时。孵育后，用双蒸水冲洗细胞四次，然后依次用梯度乙醇溶液脱水，每次10分钟。接着，在1 mL 100%丙酮中脱水两次，每次10分钟。随后，将200微升丙酮与Pon 812环氧树脂按3:1、1:1和1:3的比例混合，并将样品分别在室温下浸泡于上述树脂中，时间分别为2小时、4小时和4小时。分别孵育后，将样品在100% Pon 812环氧树脂中浸泡过夜。次日，将样品转移至平底包埋模具中，并于60 °C烘箱内聚合48小时。聚合完成后，使用超薄切片机在水解的硅片上连续切取70纳米厚的切片条带，并于60 °C烘箱中干燥10分钟。裁剪一段导电碳胶带，将其粘贴在载有胰腺细胞切片的硅片与扫描电镜样品台之间。接着，将场发射扫描电镜（FE-SEM）的加速电压设为2 kV，工作距离设为4 mm。在顶部菜单栏中，点击HL图标。然后在低倍镜下定位目标切片条的第一部分，再次点击HL图标以切换至高倍镜模式。通过调节图像、亮度、对比度和放大倍数，获取目标结构的合适图像。接下来选择项目视图。然后打开数据，将待分析的图像文件导入软件中。通过点击“对齐切片”和“编辑”来对齐图像。接着在左下角的菜单栏中，通过调整图像透明度来修改强度范围值。选择“提取子体积”模块，然后单击“对齐数据集”以匹配整个堆栈重叠部分的大小。接下来，在“分割”子部分中，选择“重采样”。然后进行分割并单击“保存”。然后选择魔棒工具的阈值和画笔工具的大小，以选中正确的范围。在选择菜单中，单击“添加”图标以添加选定的区域。完成区域分割后，根据物体大小和图像分辨率的最佳效果生成图像文件。单击裁剪编辑器，在虚拟滑块框中输入数字六。接着，从左侧下拉菜单中，右键单击“项目”子部分下方的灰色区域，选择生成表面，然后选择创建并应用。在生成的文件中，使用表面视图模块创建表面结构和三维表示。二维场发射扫描电镜图像显示，在对照组中，线粒体均匀分布，且具有规则的嵴结构。相比之下，RSL3组的线粒体出现收缩，膜密度增加，嵴结构模糊。然而，并非RSL3组中所有线粒体嵴均发生退化，部分嵴结构仍保持完整。与RSL3组相比，抑制剂组的线粒体嵴结构大部分保持完整，仅有少数不明显。对照组的三维图像更准确地展示了线粒体及其嵴的结构。RSL3组的三维图像显示线粒体形态不规则且出现空泡化，而抑制剂组则呈现出多样化的嵴形态。线粒体形态改变的定量分析显示，与对照组相比，RSL3组线粒体长度和体积显著减小，而抑制剂组呈现中间状态的结果。RSL3还通过改变线粒体形态并触发铁死亡，导致线粒体功能障碍和细胞代谢异常。

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癌症研究

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方法 原位 小鼠肌肉和终末施万细胞中线粒体形态的定量分析

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