Name: 用于基于抗体的治疗分子质量数计算的开源框架 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: 了解mAbScale开源框架用于单克隆抗体治疗药物分子质量数计算的方法。该工具解决了大分子蛋白质质量缺陷问题，提高生物制药开发中的计算准确性，无需依赖外部服务器即可保护专有信息。

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作者感谢 Robert Schuster 在数据验证方面的协助。

mAbScale 的高级工作流程如图2所示。每个步骤均包含更为复杂的内部决策分支、循环和组合逻辑。详细的算法工作流程描述了计算过程，见补充图1。应用程序的输出结果将保存在用户选定文件夹中的电子表格格式文件中。输出文件包含多个独立的工作表，可分为用户输入、分子量计算以及平均同位素质量推导的参考信息（示例输出见补充表格）。用户输入工作表包括用户输入的蛋白质氨基酸序列及其他信息、平均元素质量以及糖链质量，这些数据用于计算元素组成和不同形式的分子量。分子量计算工作表包括各种形式的化学组成、有无糖基化和化学修饰的还原质量，以及有无糖基化和化学修饰的完整质量。如果用户在输入页面中输入了两条不同的重链（HC）和/或两条不同的轻链（LC），系统将自动生成包含半抗体质量的工作表，因为半抗体是需要相对于目标异源二聚体进行鉴定和定量的主要杂质。mAbScale 的源代码可通过以下代码仓库获取：https://github.com/kkhatri99/mAbScale。
<img alt="化学组成计算过程；流程图；肽序列；糖型质量；Excel结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：使用该应用程序计算元素组成和质量所涉及步骤的概览。 可使用颜色编码与补充图1中描述的流程相对应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 打开 mAbscale 应用程序
<ol>
	<li>通过双击可执行文件的图标来打开软件应用程序。</li>
</ol>
2. 序列录入
<ol>
	<li>在标有1的相应文本框中输入重链和轻链序列，序列中不得包含任何空格。
	<ol>
		<li>对于双特异性抗体（bsAbs），在标有2的第二组文本框中添加额外的重链或轻链。对于具有相同重链和轻链的单克隆抗体（mAbs），请将2留空。</li>
		<li>如果适用重链末端变体，请勾选N端环化和/或C端截短复选框。</li>
		<li>将任何化学修饰（包括抗体偶联药物（ADC）分子的连接子和载荷）添加到重链化学修饰和/或轻链化学修饰文本框中。
		<ol>
			<li>以元素组成为形式指定修饰，例如 CaCl2。该修饰将被添加至相应的蛋白质亚基或链上。 
			​注意：通过在元素组成前添加负号“-”，可从亚基或链中减去该化学组成。例如，-H2O 将从亚基的组成和质量中减去一个水分子。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 确定二硫键的数量
<ol>
	<li>在标记为二硫键总数的文本框中指定蛋白质分子中二硫键的数量。</li>
	<li>根据还原程度（完全或部分），将未还原重链二硫键的数量输入到未还原重链二硫键文本框中，将未还原轻链二硫键的数量输入到未还原轻链二硫键文本框中。 
	注意：单克隆抗体亚基的还原质量分析涉及通过还原/分离二硫键连接的重链和轻链。</li>
	<li>如果单克隆抗体轻链上存在糖基化，请勾选轻链发生糖基化复选框。</li>
</ol>
4. 设置输出文件夹并运行程序
<ol>
	<li>点击 浏览 按钮，在 输出文件夹 文本框中选择一个输出文件夹。</li>
	<li>在 Excel 文件（无扩展名） 文本框中输入输出文件名（无需文件扩展名，将自动保存为 .xlsx 格式）。</li>
	<li>点击 提交 按钮以启动应用程序。输出文件将保存在指定的文件夹中。 
	​注意：可通过编辑分隔符文本文件 Element_Mass.csv（补充编码文件 1）和 Glycan.csv（补充编码文件 2）来自定义元素质量及糖链列表。这些文件必须与可执行文件 mAbScale.exe（补充编码文件 3）位于同一文件夹中，程序才能正常运行。每次运行后，应用程序将自动关闭。若需进行第二次计算，用户需重新启动该程序。</li>
</ol>

A Python-Based Tool for Accurate Mass Calculation of Biotherapeutic Entities

<ol><li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li>
<li>Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+developing+next-generation+protein+therapeutics+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).</li>
<li>Wang, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+Structure%2C+biology%2C+and+structure-based+therapeutics+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).</li>
<li>ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline">https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline</a> (2018).</li>
<li>Donnelly, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+and+benchmarks+for+intact+protein+analysis+for+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry.</a> Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).</li>
<li>Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+mass+accuracy+of+high+performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+intact+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).</li>
<li>Beck, A., Sanglier-Cianférani, S., Van Dorsselaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosimilar%2C+biobetter%2C+and+next+generation+antibody+characterization+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).</li>
<li>Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-dimensional+LC-MS%3A+the+next+generation+characterization+of+antibody-based+therapeutics+by+unified+online+bottom-up%2C+middle-up+and+intact+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches.</a> Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).</li>
<li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+structures+of+IgG+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond structures of IgG molecules.</a> mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li>
<li>Jakes, C., Füssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+biotherapeutics+using+protein+a+chromatography+coupled+to+orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).</li>
<li>Robotham, A. C., Kelly, J. F. Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobotham%2C+AC+%22Approaches+to+the+Purification%2C+Analysis+and+Characterization+of+Antibody-Based+Therapeutics%22">Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics</a>. Matte, A. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 1-33 (2020).</li>
<li>Valeja, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+mass+baseline+resolution+for+an+intact+148+kDa+therapeutic+monoclonal+antibody+by+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).</li>
<li>Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+analysis+of+monoclonal+antibodies+with+electron+transfer+dissociation+orbitrap+fourier+transform+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).</li>
<li>Berglund, M., Wieser, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+compositions+of+the+elements+2009+%28IUPAC+Technical+Report%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report).</a> Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ame2012+atomic+mass+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Physics+C%22%5BJournal%5D)">The Ame2012 atomic mass evaluation.</a> Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).</li>
<li>Peri, S., Steen, H., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPMAW--A+software+tool+for+analyzing+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).</li>
<li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).</li>
<li>De Leoz, M. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interlaboratory+study+on+glycosylation+analysis+of+monoclonal+antibodies%3A+Comparison+of+results+from+diverse+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).</li>
<li>Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+monoclonal+antibody+N-glycosylation+-+Structure%2C+function+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential.</a> Biologicals. 52, 1-11 (2018).</li>
<li>Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+site+localization+scoring+integrated+into+a+search+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification site localization scoring integrated into a search engine.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).</li>
<li>Chalkley, R. J., Clauser, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+site+localization+scoring%3A+Strategies+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification site localization scoring: Strategies and performance.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).</li>
</ol>

本软件在 Apache 2.0 许可下发布。版权所有 (2022) GlaxoSmithKline Research &amp;#38; Development Limited。保留所有权利。本软件已根据 Apache 许可证 2.0 版（以下简称“&#34;许可证&#34;）获得许可；除非遵守该许可证条款，否则不得使用本文件。您可以在 http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0 获取许可证副本。除非适用法律要求或书面同意，根据许可证分发的软件均按“&#34;现状&#34;”提供，不附带任何形式的明示或暗示的担保或条件。有关许可权限和限制的具体条款，请参见许可证。L.C. 为葛兰素史克（GSK）员工。T.H. 和 K.K. 在 GSK 任职期间开发了本软件，目前分别为默克（Merck）和莫德纳（Moderna）的合作者。

mAbScale 提供了一个直观的用户界面，具有灵活调整质量与元素计算基本模块的功能。用户需对目标分子具备基本了解，以便正确使用该应用程序、推导准确的质量数据并解读结果。例如，完整分子或还原后分子的质量输出表可能因包含大量完整或还原质量数据而显得复杂，这是因为默认的糖链数据库包含 88 种常见于治疗性抗体 Fc 区域的 N-连接糖链，而该应用程序会计算数据库中所有可能的糖型质量18,19。尽管大多数治疗性单克隆抗体经过工程化设计以去除 Fab 区域的糖基化，但某些单克隆抗体仍可能保留该糖基化位点，这将进一步增加糖基化蛋白异构体的总数。建议用户根据特定分子定制糖链数据库，聚焦于最相关的糖型，以降低输出结果的复杂性，并使计算结果更贴近实测质量，从而有助于质谱峰的鉴定。
由于轻链和重链的异质性，双特异性抗体（bsAbs）的复杂程度进一步增加。该软件应用程序可根据提供的轻链（LC）、重链（HC）序列及糖型，生成所有可能的排列组合，从而预测抗体亚基错配或配对不完全所产生的各种...

在过去二十年中，生物治疗药物已发展成为现代制药行业的支柱。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV2）大流行及其他危及生命的疾病进一步加大了对生物制药分子更快速、更广泛开发的需求1,2,3。
生物治疗药物的分子量对于分子的鉴定至关重要，需结合其他分析检测方法共同使用。完整分子及还原亚基的分子量贯穿于发现和开发的整个生命周期，作为控制策略的一部分，以确保产品质量，如QTPP（质量目标产品概况）所述4。
生物制药行业的分析开发在很大程度上依赖于质量测定，用于完整分子量分析以及通过肽图谱或多重属性方法（MAM）监测进行深度表征。这些基于现代质谱（MS）平台的技术核心在于实现高分辨率准确质量（HR/AM）测定的能力。大多数HR/AM仪器的质量准确度范围为0.5–5 ppm，并随分子量范围变化。对完整大分子进行准确质量测量的能力，使得大分子治疗药物能够被快速且可靠地鉴定。由于在常规实验条件下无法对大分子（>10 kDa）实现同位素分辨，因此必须计算其平均质量用于比对和鉴定5,6。
典型的完整蛋白或亚基蛋白质谱反映了整体的蛋白异构体谱型，其中包含了由翻译后修饰（PTM）以及任何一级结构差异（如剪切片段或序列变异）所产生的各种分子形式的综合信息。这类检测方法操作相对简便且通量较高，因此在蛋白表征以及作为过程监控手段方面具有吸引力7,8。这些实验的数据分析通常需要用户预先定义分子形式的搜索范围（如PTM或其他分子形式的种类和范围）。对于糖基化蛋白而言，该搜索范围主要受糖型异质性的影响。多种PTM的组合、二硫键构象以及其他一级结构上的变异使得计算所有可能分子形式的过程极为繁琐。因此，人工计算可能的分子形式不仅耗时耗力，而且极易引入人为错误。
本文介绍了一种质量计算工具，该工具在设计时考虑了生物治疗分子（如单克隆抗体、双特异性抗体、抗体药物偶联物等）的最重要特征。该工具允许便捷地引入搜索空间变量，以实现对分子质量及元素组成的准确计算。该工具的模块化特性使其能够进一步拓展，应用于其他类型分子的质量计算与质量匹配。
GUI 模块允许用户指定质量计算的输入参数，如图 1所示；具体而言，用户需输入轻链和重链抗体的单字母氨基酸序列。重链N端环化和C端赖氨酸剪切等常见修饰以复选框形式提供。此外，可通过相应的Chem Mod文本框对这些蛋白链添加或减去化学式/元素组成。这使用户能够灵活地添加包含多种翻译后修饰的元素组成，或在抗体偶联药物（ADC）情况下添加小分子载荷。由于大多数治疗性单克隆抗体经过工程化改造以去除轻链中的糖基化位点，因此轻链中的糖基化被设为可选项，可通过GUI界面上的复选框进行指定。
对抗体进行完整质谱分析时，一种常见的变异方法是还原亚基质谱分析，该方法通过还原链间二硫键使轻链与重链分离。根据所用还原剂的强度不同，链内二硫键可能被断裂，也可能保持完整。用户可根据IgG亚型或半胱氨酸偶联抗体药物偶联物（ADC）的具体情况，灵活输入二硫键的总数9。
该程序以自下而上的方式计算质量，首先分别计算各条重链和轻链的元素组成。接着，通过调整计算所得的元素组成，考虑重链（HC）N端环化及赖氨酸剪切（Lys-clipping）的影响。然后将用户指定的任何化学修饰应用于重链和/或轻链。根据分析类型及用户指定的二硫键连接模式，对两条多肽链的氢原子数目进行相应调整。糖基化重链（HC）和轻链（LC）（可选）的质量根据用户输入进行计算。最后，将多个重链和轻链的质量组合，并自动更新二硫键数量，以完成完整分子质量的计算。
对于完整蛋白质等较大分子，由于使用典型分辨能力的质谱仪时存在累积的质量偏差，无法测量其单一同位素质量。因此，通常测量或报告的是标称质量或平均质量5,10,11,12,13。平均元素质量可能因所采用的质量数据来源不同而有所差异14,15。尽管各元素质量的差异可能很小，但在大分子分子量计算中，这些差异可能累积成显著的数值。软件应用程序默认使用的平均元素质量列于补充表1中。在生物制药研发（R&amp;D）等受监管的环境中，保持分子质量的一致性至关重要，因为质量的变化可能在法规申报过程中被解读为分子实体本身发生了改变。为了确保元素质量使用的一致性，软件工具中包含了一个元素质量字典，以逗号分隔值（csv）文本文件形式提供：Element_Mass.csv （补充编码文件1）。类似地，还包含了一个通常在单克隆抗体（mAbs）上观察到的糖链组成的 curated 列表：Glycan.csv （补充编码文件2）。这两个文件均保存在可执行程序所在的同一文件夹中，用户可根据需要修改，以使用特定的元素质量列表或糖链库。
<img alt="蛋白质修饰界面；序列分析，二硫键计数；化学修饰示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：mAbScale 应用程序的图形用户界面（GUI）。 该 GUI 模块允许用户设定质量计算的输入参数。用户需输入抗体轻链和重链的单字母氨基酸序列。重链N端环化和C端赖氨酸剪切等常见修饰以复选框形式提供选项。可通过相应的 Chem Mod 文本框添加或减去化学式/元素组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>Acquity UPLC 系统&amp;nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>N/A</td><td>模块化系统</td></tr><tr><td>抗体-药物偶联物（ADC）</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td>专有分子</td></tr><tr><td>BEH 200 SEC 色谱柱&amp;nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>176003904</td><td></td></tr><tr><td>双特异性单克隆抗体</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td>专有分子</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics, Cupertino, CA</td><td>https://proteinmetrics.com/byos/&lt;br/&gt; 版本 4.5</td><td></td></tr><tr><td>GPMAW</td><td>GPMAW</td><td>http://www.gpmaw.com/</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 级水&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗体标准品&amp;nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>186009125</td><td>Waters 人源化单克隆抗体质量校验标准品</td></tr><tr><td>mAbScale</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>Apache 许可证，版本 2.0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF 质谱仪</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>N/A</td><td>模块化系统</td></tr></tbody></table>

一种用于抗体类治疗分子质量计算的开源框架

An Open-Source Framework for Mass Calculation of Antibody-Based Therapeutic Molecules

生物治疗药物的质量测定是验证其身份和结构完整性的方法。对完整蛋白质或蛋白质亚基进行质谱分析（MS）为生物制药研发的各个阶段提供了一种简便的分析工具。当质谱测得的实验质量在理论质量的预定义质量误差范围内时，即可确认蛋白质的身份。尽管目前已有一些用于计算蛋白质和多肽分子量的计算工具，但这些工具要么并非专为生物治疗分子的直接应用而设计，要么因需付费授权导致使用受限，要么要求将蛋白质序列上传至服务器主机。
我们开发了一种模块化的质量计算程序，可便捷地确定治疗性糖蛋白（包括单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）和抗体-药物偶联物（ADC））的平均质量或单一同位素质量及其元素组成。该基于 Python 的计算框架具有模块化特性，未来可扩展至其他治疗模式，如疫苗、融合蛋白和寡核苷酸，并且该框架也可用于解析自上而下的质谱数据。通过开发一个带有图形用户界面（GUI）的开源独立桌面应用程序，我们希望克服在无法将专有信息上传至基于网络工具的环境中使用所受到的限制。本文介绍了该工具 mAbScale 的算法及其在不同抗体类治疗模式中的应用。

选择了多种单克隆抗体（mAbs）以代表不同类型的mAbs。选用一种 commercially available mAb 标准品来代表具有相同重链、相同轻链以及在Fc区含有一个N-连接糖基化位点的传统mAb。&#160;还选择了具有额外轻链N-连接糖基化的单克隆抗体、双特异性单克隆抗体以及抗体-药物偶联物（ADC）单克隆抗体，以拓展其应用范围。这些示例单克隆抗体的化学组成、计算质量、实测质量及质量误差汇总如下 表1mAbScale 报道的蛋白质化学组成和计算质量经 GPMAW 确认16一种用于蛋白质和多肽一级结构分析的程序。
进行完整分子量分析时，将单克隆抗体样品用液相色谱-质谱级水稀释至1 mg/mL后进样分析。进行还原分析时，样品首先用二硫苏糖醇处理，并在37 °C孵育15分钟，以断裂链间二硫键。所有样品均采用与质谱仪联用的Acquity UPLC系统进行分析。使用BEH 200 SEC色谱柱，以水/乙腈（65:35）含0.1%三氟乙酸作为流动相，通过等度洗脱方法实现在线脱盐以及重链与轻链的分离。...

本文介绍了使用软件应用程序 mAbScale 来计算基于单克隆抗体的蛋白质治疗药物的质量。

生物治疗药物的分子量可用于验证其身份和结构完整性。对完整蛋白质或蛋白质亚基进行质谱分析（MS）可提供……

对于大分子蛋白质而言，精确质量计算的难点在于测量过程中相关的质量亏损。因此，只能测得其平均质量。微小的元素质量差异可能逐渐累积，导致单克隆抗体等大型治疗性分子出现显著的质量偏差。我们的工具明确解决了基于抗体的治疗药物（如单克隆抗体、双特异性抗体和抗体药物偶联物）在质量一致性计算方面的挑战。在商业生物制药研发领域的研究人员通常依赖手动计算，或使用不依赖与外部服务器通信的工具。由于涉及专有信息，现有工具要么需要授权许可，要么在设计时未充分考虑生物制药研发的具体需求。Mabscale 为用户和开发者提供了友好的界面以及可灵活扩展的开源框架。它支持维护多种版本的元素质量及修饰列表，并允许共享列表以确保计算结果的一致性。该代码可通过内部服务器或基于云的部署在企业范围内共享，同时通过受控访问保护专有信息。首先，通过双击可执行文件的图标来打开软件程序。在单列下方的文本框中输入重链和轻链序列，序列中不得包含任何空格。对于双特异性抗体，需在双列下方第二组文本框中添加额外的重链或轻链序列。对于具有相同重链和轻链的单克隆抗体，请将这些框留空。如果存在重链末端环化和C端截短的变体，请勾选相应的复选框。将化学修饰（包括抗体药物偶联物的连接子和有效载荷）添加到重链和轻链的化学修饰框中，使用氯化钙等元素组成表示。这些修饰将添加到相应的蛋白质亚基或肽链上。在标记为“二硫键总数”的文本框中，填写蛋白质分子中二硫键的总数。根据还原程度，将未还原重链二硫键的数量填入“未还原重链二硫键”文本框中，将未还原轻链二硫键的数量填入“未还原轻链二硫键”文本框中。如果单克隆抗体的轻链上存在糖基化，请勾选“轻链发生糖基化”复选框。点击“浏览”按钮，为输出文件夹文本框选择一个输出文件夹，并在“Excel 文件（无扩展名）”文本框中输入输出文件名（不要包含文件扩展名）。然后点击“提交”按钮。屏幕上将显示一条质量计算报告已创建的消息，输出文件可在用户指定的文件夹中找到。该应用程序将自动关闭。本表汇总了多种单克隆抗体的化学组成、计算质量、实测质量及质量误差。选择了一种市售的单克隆抗体标准品，以代表具有相同重链、相同轻链以及在Fc区含有一个N-连接糖基化位点的传统单克隆抗体。此外，还选用了具有额外轻链N-连接糖基化位点的单克隆抗体、双特异性单克隆抗体以及抗体药物偶联单克隆抗体，以拓展应用范围。计算质量与实测质量之间的微小质量误差均在正常可接受的质量误差范围内，表明计算质量准确可靠。

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用于基于抗体的治疗分子质量数计算的开源框架

在本视频中，我们展示了在流动池中利用质量光度法研究抗原-抗体相互作用的方法。聚焦光根据分子质量的不同而产生差异化的散射。探测器收集散射光，并生成具有不同强度的光斑干涉图样，这些光斑强度与分子质量相对应。...

利用质谱光度法在单分子水平研究抗原-抗体相互作用

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。...

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

本方案描述了在哺乳动物表达系统中生产治疗性抗体的方法。所述方法包括载体DNA的制备、人胚胎肾293细胞系的稳定转染和无血清适应、大规模培养体系的建立，以及利用亲和层析进行纯化。...

治疗性抗体的小规模生产与纯化

病毒来源的肽段与抗体偶联物（ACs）相结合是一种日益受到关注的方法，因其具有增强分子载荷在肿瘤细胞内蓄积的潜力。本实验方案利用常规方法评估肽段偶联效率、抗体偶联物及其载荷在细胞内的积累情况以及肿瘤靶向性，可为研究人员在关键的早期研发阶段提供支持。...

利用病毒衍生肽修饰抗体偶联物的初步评估：提高细胞摄取与增强肿瘤靶向性

本文介绍一种单细胞蛋白质组学方法，通过质谱流式细胞术分析外周全血样本中免疫表型及功能（细胞内细胞因子诱导）的变化。...

通过质谱流式细胞术对全外周血进行免疫表型和细胞因子产生的单细胞分析

将赖氨酸的环丙烯衍生物引入抗体，可实现含四嗪分子的位点特异性、快速且高效的连接，从而生成抗体-药物偶联物。...

通过快速生物正交反应遗传编码非天然氨基酸以生成抗体-药物偶联物

本文介绍了针对完整抗体库结构与组成的分析及可视化方法。该方法涉及利用高通量测序技术获取大量抗体RNA序列。...

通过下一代测序鉴定小鼠和人类抗体库

本研究旨在提出一种用于鉴定药物-肽相互作用的策略。该策略基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器进行识别药物的短肽的生物筛选，随后通过生物信息学分析，对获得的药物识别信息及蛋白质上药物结合位点的注释进行定量评估。...

基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证

本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。...

在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

了解mAbScale开源框架用于单克隆抗体治疗药物分子质量数计算的方法。该工具解决了大分子蛋白质质量缺陷问题，提高生物制药开发中的计算准确性，无需依赖外部服务器即可保护专有信息。

一种用于抗体类治疗分子质量计算的开源框架

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