生物膜感染与隐性伤口的猪模型

生物膜感染是导致伤口慢性化的重要因素。本临床前模型通过在全层Q-TDS猪伤口中接种临床分离的病原体，用于研究伤口生物膜的形成及其对伤口结局的生物膜依赖性影响。通过同时纳入微生物因素和宿主因素，我们旨在探究慢性伤口中致病性生物膜背后复杂的宿主-微生物相互作用。

尽管目前的文献并未区分这两种伤口生物膜聚集体，但其与在缺乏宿主防御条件下由微生物相互作用形成的生物膜聚集体存在显著差异。例如，在塑料表面或无生命皮肤上生长的生物膜。微生物过程与宿主免疫防御系统之间的反复相互作用，导致了伤口生物膜聚集体的形成。

由于该过程需要数天时间，建立长期的伤口感染模型至关重要。体外和离体系统均缺乏研究伤口生物膜所必需的宿主免疫反应。尽管短期的体内研究可获得急性反应，但不足以支持生物膜的成熟。我们建立的标准化临床前实验系统已报道具有临床相关性结果，可弥补上述不足。

尽管生物膜感染的伤口在结构上可能闭合，但其可能并未实现功能性愈合，因为修复后的皮肤往往无法重建屏障功能。屏障功能受损的受累皮肤构成了一个结构上被覆盖但功能上仍开放的隐性创面。本研究强调了检测皮肤屏障功能及伤口修复部位以确定功能性伤口愈合的重要性。

通过经临床验证的经皮水分流失床旁检测方法来评估屏障功能。在准备妥当的手术室内开始操作时，将麻醉后的猪置于胸卧位，并确保所有连接的管线均已固定。使用脱毛膏清除指定创伤区域剃毛部位残留的毛发。

对创面部位进行消毒后，使用无菌烧伤模板和外科皮肤标记笔标记区域。通过调节控制单元的设定点至150摄氏度，低设定点至145摄氏度，高设定点至155摄氏度，设置烧伤装置。利用连接至烧伤设备的加热不锈钢块，将钢块置于皮肤上60秒，制造全层皮肤烧伤创面。

拍摄猪背部整体的数码照片，包括带有猪只标识时间点和日期的标牌。然后分别对每个伤口拍摄图像，每张图像需包含一把刻度尺以及显示猪只编号、伤口编号和时间点的标牌。为实时评估伤口微血管灌注情况，可使用激光散斑成像（LSI）技术，利用LASCA血流灌注成像仪对所有伤口进行单次记录成像。

为了测量经表皮水分流失（TEWL），将一个干净的探头套覆盖在TEWL探头尖端上，该尖端将与伤口组织接触。每个伤口测量五次，首先在中心位置，然后依次测量四个角。随后将所有读数导出至电子表格中。

通过超声探头从猪体中线或脊柱开始，对伤口进行扫描，从正常皮肤区域向猪体侧方移动，越过伤口区域，直至再次到达正常皮肤，从而完成谐波超声或HUSD成像。对每个伤口均需在B模式和组织弹性成像模式下分别按照规定的扫描路径进行。每个伤口在B模式和弹性模式下各完成一次成像后（即每个伤口共进行两次记录），需更换标注信息。

所有成像完成后，分别用透明薄膜敷料或试验敷料覆盖烧伤创面，然后在整個傷口區域上方覆蓋一塊較大的透明薄膜敷料。再將第二層捲繞紗布鬆散地包覆於豬的整個軀幹，以吸收傷口滲出的任何液體。

用一层弹力绷带 loosely 覆盖纱布。再用一层四英寸弹性胶带覆盖弹力绷带。包扎完成后停止麻醉气体，让猪继续吸入氧气至少五分钟。

在烧伤后第三天对烧伤创面进行接种时，使用移液管将接种物均匀分散于暴露创面表面，并用一次性涂布器涂布均匀。成像后，为采集组织活检样本，先在创周浸润0.5%布比卡因。使用带10号刀片的一次性手术刀，从创面一侧边缘至另一侧切取一条3至4毫米宽的组织条，两侧保留少量正常皮肤边缘。随后从创面（创基或创缘）切取一个6毫米的环钻活检样本。样本采集后，用无菌纱布轻压创面以实现止血，然后按先前示范的方法用非粘附性敷料覆盖创面并进行包扎。

通过苏木精和新伊红染色对活检样本进行分析，结果显示皮肤所有组织学层均出现结构扭曲和坏死。接种后第7天通过菌落形成单位进一步验证了生物膜的形成。进行扫描电镜成像和免疫荧光染色分析。

接种后第7天，烧伤创面表面出现一层厚厚的生物源性膜，证实已发生感染并形成了生物膜。创面面积从第14天开始缩小，但至第56天时仅愈合约原始创面大小的25%，表明创面呈现慢性化特征。通过经表皮水分流失（TEWL）检测进一步证实了创面慢性化及愈合受损，结果显示在所有检测时间点均存在较高的经表皮水分流失。

紧密连接蛋白 ZO-1 和 ZO-2 的表达受到抑制，且皮肤屏障功能的修复受损，也证实了这一点。