基于荧光的活体成像法定量检测HeLa细胞线粒体膜电位和超氧水平

本研究聚焦于神经退行性疾病中的线粒体功能失调。我们认为，该研究有助于理解疾病发生的潜在原因，从而为治疗帕金森病和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病提供新的治疗策略。诸如受激辐射损耗显微技术（STED）和结构光照明显微技术（SIM）等超分辨率显微技术，以及扩展显微技术，已显著提升了准确解析单个细胞器内蛋白质分布以及细胞内线粒体整体分布的能力。

该技术的结果可作为研究帕金森病相关突变对线粒体更新影响的起点，并有助于初步理解调控活性氧水平和线粒体膜电位以维持神经元健康的重要性。我们实验室的目标是从机制上表征各个线粒体质量控制通路，以阐明这些通路之间的相互作用。通过深入了解通路的动力学特征，可以明确线粒体如何被维持，以及线粒体失调如何导致神经退行性疾病的发病。

首先，在无菌的微量离心管1中，将200微升低血清培养基与2微克的任意一种质粒DNA分别混合。对另外两种质粒在各自的试管中重复此步骤。然后，在新的试管2中，将200微升低血清培养基与6微升转染试剂混合，并通过移液器吹打混合内容物。

将试管在室温下孵育5分钟，然后将2号管中的内容物加入1号管中。在另外的试管中，重复将其他两种质粒与转染试剂混合的操作。将混合物在室温下孵育20分钟。

接下来，逐滴将转染复合物加入已接种HeLa细胞的成像培养皿中，确保在整个培养皿内均匀分布。成像前一小时，打开二氧化碳气罐阀门，并启动显微镜的环境控制器。使用触摸板上的上下箭头，将温度调节至37摄氏度，二氧化碳浓度调节至5%，设置完成后按“Press Set”确认。

调整激光设置时，单击“采集”选项卡并选择“打开激光概览”，以开启白光激光器。在弹出的对话框中，将白光激光器切换为“开启”状态。将激光功率设置为85%。单击“激发控制”按钮，并从下拉菜单中选择“最大功率”。开始进行四甲基罗丹明乙酯（TMRE）实验时，将激发激光设置为514纳米，发射光谱窗口设置为524至545纳米，用于YFP检测。

接下来，对于 MitoTracker Deep Red，将激发激光设置为 641，发射光谱窗口设置为 650 至 750 纳米。同样，对于 TMRE，将激发激光设置为 555 纳米，发射光谱窗口设置为 557 至 643 纳米。开始图像采集设置时，选择“采集”选项卡，并将格式调整为 1024 × 1024。

在下拉菜单中将速度调整为600。然后，点击“Line Average”按钮，并从下拉菜单中选择3。开启双向扫描，并将相位和缩放系数分别设置为22.61和1.50。

完成后，通过点击YFP设定1并按下快速预览，根据YFP荧光信号选择细胞。然后调整YFP的增益和强度，再根据YFP荧光信号选择细胞。在TMRE实验中对DMSO对照孔板进行成像时，调整TMRE信号设定2的增益和强度，使线粒体网络信号强度略低于饱和水平。

保持TMRE的增益和强度不变。然后调节MitoTracker设置1的增益和强度，使线粒体网络可见但较暗。增益和强度设置完成后，单击“开始”以获取图像。

每种实验条件下获取20个细胞的图像。在ImageJ软件中测量转染的HeLa细胞的荧光强度时，单击“文件”并选择“打开”。在对话框中选择实验的成像文件，然后单击“确定”。当出现Bio-Formats导入选项窗口时，选择“拆分通道”并单击“确定”。在四甲基罗丹明乙酯（tetramethylrhodamine, ethyl ester percolate）或TMRE实验中，YFP为第一通道。

MitoTracker 为第二通道，TMRE 为第三通道。选择图像，然后调整，再选择亮度，以调节亮度。接下来，通过点击分析，然后工具，再选择 ROI 管理器，加载已保存的兴趣区域（ROI）。

在 ROI 管理器中，单击“更多”，然后从列表中选择“打开”并选中已保存的 ROI。接着，通过从 ROI 管理器中选择已保存的 ROI，并将其移动到细胞内的随机位置，测量单个细胞中五个随机区域的荧光强度。要测量荧光强度，请按键盘上的 M 键，并对另外四个不重叠的区域重复此操作。

当显示包含面积和平均灰度值的对话框时，将数值复制并粘贴到电子表格中进行分析。TMRE 和 MitoSOX 荧光强度的实验结果表明，与对照条件相比，已知解偶联剂 CCCP 处理降低了 TMRE 荧光强度。此外，20 µM CCCP 处理诱导了超氧化物的产生，并增加了 MitoSOX 荧光强度。

在轻度或5微摩尔CCCP应激条件下，表达Parkin野生型和Parkin T240R的细胞其TMRE荧光强度高于空载YFP对照载体。与表达YFP对照载体的细胞相比，表达Parkin野生型和Parkin T240R的细胞中MitoSOX荧光强度较低，表明Parkin的表达有助于维持线粒体网络的健康，保持较高的线粒体膜电位并降低超氧化物水平。