Name: 从活大鼠中分离神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞的脑挤奶方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 学习从活体大鼠脑中分离神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞的"脑挤奶"方法。该技术可在不损害动物福利的前提下实现重复细胞采集，支持纵向研究并消除死后分离带来的实验偏差。

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本工作获得了 Action Medical Research（英国）基金（项目编号：GN2291）对 R.J.M.F. 和 I.K. 的资助。该项研究还部分得到了希腊研究与创新基金会（H.F.R.I.）的资助（用于动物费用及对 D.D. 的支持），资助项目为 &#34;支持高校教职员工与研究人员及采购高成本科研设备的 H.F.R.I. 首轮研究项目资助计划&#34;（项目编号：3395）。

动物的繁殖、饲养及实验操作均依照英国《1986年动物（科学实验）法案》以及希腊共和国总统令第56/2013号的规定进行，并经剑桥大学和帕特雷大学的动物福利与伦理审查机构审查批准，同时获得当地州级动物护理与使用委员会的批准和监督（方案编号：5675/39/18-01-2021）。实验所用动物为雄性和雌性Sprague-Dawley、Wistar和Long-Evans大鼠，年龄在2至4个月之间，体重范围为150 g至250 g。该实验方案在图1中以图示形式进行了总结。
1. 裂解液的配制
注意：在操作当天新鲜配制，并置于冰上保存。每2 µL用于单侧脑室注射，按此量配制。每预定注射一次，额外准备1 µL。
<ol>
	<li>准备 0.5 µL 来自产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）（旧称 Clostridium welchii）的 500 mU 神经氨酸酶。 
	注意：将该酶以 1 U/µL 的浓度溶于无菌水中，配制成储存液，于 -20 °C 保存。其他类型的神经氨酸酶尚未经过测试。</li>
	<li>准备含 1 µg 整合素 β1 阻断抗体的 1 µL 溶液。 
	注意：于 4 °C 保存。</li>
	<li>准备含 0.5 µg 碱性成纤维细胞生长因子（重组人 FGF-basic）的 0.5 µL 溶液。 
	&#8203;注意：将该因子以 1 µg/µL 的浓度溶于无菌水中，配制成储存液，于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
2. 释放鸡尾酒的注射
注意：整个过程可在20分钟内完成。手术操作需在无菌条件下进行。使用消毒剂（如3%或6%过氧化氢）清洁所有表面。使用经高压灭菌或预灭菌的器械、手套、手术衣和铺巾。
<ol>
	<li>通过吸入异氟烷（诱导剂量为2.5%，维持剂量为2%）对实验动物进行麻醉。通过检查角膜反射、对刺激的反应（后肢和尾部夹捏试验）以及呼吸模式来确认麻醉深度。 
	注意：手术可在腹腔注射麻醉剂（如氯胺酮[40 mg/kg]和赛拉嗪[10 mg/kg]）诱导的全身麻醉下进行。通过检查角膜反射、对刺激的反应（后肢和尾部夹捏试验）以及呼吸模式确认深度麻醉。</li>
	<li>在麻醉诱导时皮下注射镇痛药（如0.3 mg/mL丁丙诺啡）。</li>
	<li>将大鼠固定在立体定位仪上。</li>
	<li>使用剃刀剃除头部毛发，并用消毒剂（如10%聚维酮碘溶液）清洁皮肤，随后用酒精擦拭。使用无菌棉签重复消毒三次&#160;，每次以环形方式擦拭3-5秒。涂抹眼膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>使用无菌手术刀沿头部中线做一条长约2 cm的切口。</li>
	<li>使用无菌棉签和无菌生理盐水仔细清理颅骨表面。</li>
	<li>使用安装在立体定位仪上的10 µL Hamilton注射器针头边缘定位前囟。将前囟设为&#34;0,0点&#34;。 
	注意：前囟定义为矢状缝与冠状缝交汇的点。更多细节可参考Paxinos和Watson的大鼠脑图谱5。</li>
	<li>将装置移动至以下坐标：前后向（AP）= 0.3 mm，外侧向（L）= +1.2 mm（靶向SEZ），或AP = 1.5 mm，L = +2.0 mm（靶向CC）。</li>
	<li>使用牙科钻头钻出直径1 mm的钻孔。 
	注意：手动钻孔时需注意避免损伤皮层表面。出血量通常不大。如有出血，使用生理盐水清除，并施加压力以控制持续性出血。</li>
	<li>将4 µL释放混合液装入10 µL Hamilton注射器中。</li>
	<li>降低Hamilton注射器的针头（建议使用钝头或锥形针尖），使其接触硬脑膜。</li>
	<li>将针头插入至目标深度（D = 3.5 mm）。 
	注意：在硬脑膜表面滴加生理盐水以保持组织湿润。</li>
	<li>以1 µL/min的速度注入2 µL释放混合液。</li>
	<li>注液完成后，将针头留置原位2分钟，再缓慢拔出，以防止释放混合液回流。</li>
	<li>在对侧半球重复步骤2.8–2.14，靶向坐标为AP = 0.3 mm，L = -1.2 mm（靶向SEZ），或AP = 1.5 mm，L = -2.0 mm（靶向CC）。</li>
	<li>使用5-0尼龙线（直径0.1 mm）缝合切口，并用消毒剂清洁缝合区域。</li>
	<li>移除麻醉面罩，将动物转移至术后监测区域。 
	注意：动物应在5–10分钟内从麻醉中恢复并维持卧姿，25分钟内完全恢复（行为正常）。
	<ol>
		<li>在温暖（24–25 °C）、安静、无细颗粒垫料（以防阻塞气道）的环境中密切监测恢复情况（包括活跃且持续的运动、频繁饮水）。仅在确认完全恢复后，将动物归还至原笼伴鼠（不得与新动物合笼）。</li>
		<li>术后至少在饲养设施中监测动物48小时。若出现疼痛迹象（如藏头、异常头位或体位、触碰时过度敏感或兴奋），应给予镇痛处理（如皮下注射0.3 mg/mL丁丙诺啡）。如发现动物毛发变色或竖立，应转交负责兽医处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脑脊液（CSF）液体活检
注意：整个过程可在10分钟内完成。此处所述的液体活检在注射释放鸡尾酒溶液后第3天进行，但可根据需要在任何所需时间以完全相同的方式进行。手术操作需在无菌条件下进行。使用消毒剂（例如3%或6%过氧化氢）清洁所有表面。使用已高压灭菌或预灭菌的器械、手套、手术服和手术单。
<ol>
	<li>通过异氟烷吸入麻醉动物（诱导浓度为2.5%，维持浓度为2%）。通过检测角膜反射确认麻醉深度 
	反射、对刺激的反应（后肢和尾部夹捏试验）以及呼吸方式。 
	注意：手术操作可在腹腔注射麻醉剂（如氯胺酮 [40 mg/kg] 和赛拉嗪 [10 mg/kg]）诱导的全身麻醉下进行。然而，由于该操作时间较短，尤其当需要在连续数天内多次取活检时，不建议采用此种麻醉方式。</li>
	<li>在麻醉诱导时皮下注射镇痛剂（例如，0.3 mg/mL 布托啡诺）。</li>
	<li>将实验动物固定于立体定位仪上，使用耳杆固定头部，确保头部可自由前后旋转而不受阻碍。</li>
	<li>将头部稳定在向下40°角，以充分伸展颈部后侧。 
	注意：一种实现方法是使用该设备的口部挡板6.</li>
	<li>用剃刀剃除颈部区域的毛发，并使用消毒剂（如10%聚维酮碘溶液）清洁皮肤，然后使用酒精。重复应用消毒剂三次。&#160;使用无菌棉签，每次以环形动作擦拭3-5秒。</li>
	<li>用指尖寻找位于枕外隆凸与寰椎棘突之间呈菱形的可凹陷区域6.</li>
	<li>画一个点标记（例如，使用记号笔）。</li>
	<li>在立体定位仪上安装1 mL或0.5 mL注射器。 
	注意：建议使用针头不可拆卸的注射器，因为其吸力更强且死体积更小。</li>
	<li>将针头置于皮肤标记点处接触。</li>
	<li>用镊子提起皮肤，同时将注射器穿过皮肤各层向下推进。</li>
	<li>稍微回抽活塞，以在注射器内产生负压。</li>
	<li>重新开始，非常缓慢地插入针头，直到有液体（脑脊液）出现在注射器中。</li>
	<li>将针头固定在此位置，使脑脊液缓慢流出。 
	注意：如果脑脊液流动非常缓慢，可略微降低或升高针头。</li>
	<li>以每分钟40 µL的速率逐步缓慢移除脑脊液，总量达120 µL。</li>
	<li>缓慢取出注射器。</li>
	<li>腹腔注射1 mL正常血清，以支持实验动物的液体补充。</li>
	<li>将液体活检样本（脑脊液）与400 µL NSC培养基混合，将微量离心管置于4 °C保存，待后续使用。 
	注意：若未冷冻，液体活检样本应在3小时内处理。</li>
	<li>移除提供麻醉的面罩，并将动物转移至术后监护区域。 
	注意：动物应在5-10分钟内从麻醉中恢复并维持卧姿，25分钟内应完全恢复（行为正常）。
	<ol>
		<li>密切监测动物恢复情况（活动生动且不间断，频繁饮水），恢复环境应保持温暖（24–25 °C）、安静，且不使用细颗粒垫料，以免阻塞气道。确认动物完全恢复后，方可将其归还至原笼位同伴中（不可与新动物合笼）。</li>
		<li>术后至少在维持饲养设施中观察动物48小时。若观察到疼痛迹象（如头部躲藏、头或身体姿势异常、触碰时过敏或过度兴奋），应给予镇痛处理（例如，皮下注射0.3 mg/mL丁丙诺啡）。如动物出现毛发变色或竖立现象，应转交负责兽医处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 免疫荧光组织处理
<ol>
	<li>通过心内灌注 20 mL 冰冷生理盐水，随后灌注 50 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA；溶于 pH = 7.4 的磷酸盐缓冲液 [PBS] 中），处死动物。</li>
	<li>解剖脑组织。
	<ol>
		<li>使用剪刀在颈椎区域剪切断头，将头部与身体分离。用剪刀去除皮肤，然后沿矢状中线剪开颅骨，剪刀尖端朝上，以避免损伤脑组织。尽量继续剪切，越过冠状中线。</li>
		<li>使用镊子去除颅骨，从枕上骨和顶骨开始，最后去除额骨。</li>
		<li>暴露脑组织后，使用镊子或刮匙将其从颅腔中取出。为便于操作，可剪断脑底部的神经以及（如不需要）嗅球。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织在 4 °C 条件下，用 2% PFA 固定过夜。</li>
	<li>将组织在 30% 蔗糖（溶于 PBS）中于 4 °C 冰冻保护至少 48 小时，直至组织沉至底部。</li>
	<li>将组织在 -80 °C 下冷冻。</li>
	<li>使用冷冻切片机将脑组织切成 14 μm 厚的冠状切片。</li>
	<li>采用标准方案进行免疫荧光染色 3,7
	<ol>
		<li>将切片在封闭缓冲液（含 3% 牛血清白蛋白 [BSA] 和 0.1% Triton X-100 的 PBS）中室温孵育 2 小时。</li>
		<li>进行抗原修复（将切片置于玻璃瓶中，在 10 mM 柠檬酸缓冲液（pH = 6.0）中煮沸 15 分钟）。 
		&#8203;注意：此步骤为可选，但对核抗原检测是必需的。</li>
		<li>恢复至室温后，在封闭缓冲液中加入针对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、双皮质素（Dcx）、S100β 和 β-连环蛋白（β-catenin）的一抗（参见材料表），4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>在含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 PBS 中加入二抗，室温孵育 2 小时，用于细胞核复染（参见材料表）。</li>
		<li>封片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 免疫荧光染色用分离细胞的处理
<ol>
	<li>将细胞接种至适用于显微镜观察的96孔板中，孔板需预先用多聚赖氨酸（100 µg/mL）包被。</li>
	<li>用预冷的2%多聚甲醛（PFA）固定细胞10分钟，随后用PBS洗涤3次。</li>
	<li>按照标准流程进行免疫荧光染色3,7，检测PDGFRα、GFAP、Dcx、SOX2和ID3（参见材料表）。</li>
	<li>将细胞置于含叠氮化钠（NaN3，0.1%）的PBS中，4 °C避光保存。</li>
</ol>
6. 显微镜观察与图像分析
<ol>
	<li>使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜拍摄图像，并利用标准图像分析软件工具（如细胞计数器）进行细胞计数。</li>
</ol>

Rat "Brain Milking" for Neural Stem and Oligodendrocyte Progenitor Cell Isolation

<ol><li>Visvader, J. E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+designs+of+stem+cell+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific designs of stem cell hierarchies.</a> Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).</li>
<li>Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+quiescent+and+active+neural+stem+cells+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain.</a> The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).</li>
<li>Kazanis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subependymal+zone-derived+oligodendroblasts+respond+to+focal+demyelination+but+fail+to+generate+myelin+in+young+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).</li>
<li>Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+CNS+myelin-from+mechanisms+to+experimental+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6">https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6</a> (2013).</li>
<li>Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).</li>
<li>McClenahan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+and+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+brain+of+live+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats.</a> Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).</li>
<li>Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+germinal+layer+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).</li>
<li>Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+converts+transit-amplifying+neurogenic+precursors+in+the+adult+brain+into+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells.</a> Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).</li>
<li>Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+proliferation+on+the+surface+of+the+adult+rat+striatal+wall+after+focal+ependymal+loss+by+intracerebroventricular+injection+of+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).</li>
<li>Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone-mediated+ependyma+repair+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).</li>
<li>Kazanis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescence+and+activation+of+stem+and+precursor+cell+populations+in+the+subependymal+zone+of+the+mammalian+brain+are+associated+with+distinct+cellular+and+extracellular+matrix+signals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).</li>
<li>Calzolari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+clonal+expansion+and+limited+neural+stem+cell+self-renewal+in+the+adult+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone.</a> Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).</li>
<li>Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractone-heparan+sulphates+mediate+FGF-2+stimulation+of+cell+proliferation+in+the+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone.</a> Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Obernier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+is+sustained+by+symmetric+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).</li>
<li>Delgado, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+stem+cells+from+quiescence+reveals+gliogenic+domains+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain.</a> Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).</li>
<li>Kalamakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescence+modulates+stem+cell+maintenance+and+regenerative+capacity+in+the+aging+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain.</a> Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).</li>
<li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+a+population+of+dormant+neural+stem+cells+that+become+activated+upon+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li>
<li>Gajera, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP2+in+ependymal+cells+regulates+BMP+signaling+in+the+adult+neurogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche.</a> Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

干细胞与祖细胞在哺乳动物脑组织中相对稀少，且神经干细胞（NSCs）位于难以进行安全、便捷活检的区域（如脑室壁、海马体）。因此，迄今为止，实验研究这类细胞的唯一途径是通过死后组织分离。本文逐步介绍一种名为“挤取”（milking）的技术，可用于从活体大鼠中单次或重复采集神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）。该方法基于两个关键特征：i）NSCs或OPCs被室管膜细胞单层与脑室系统内的脑脊液（CSF）分隔；ii）室管膜细胞与神经前体细胞之间，以及它们与其他邻近细胞类型之间保持细胞连接。 通过 整合素。因此，注射到脑室特定区域以促使神经干细胞（NSCs）或少突胶质前体细胞（OPCs）从脑实质中分离的释放混合液中含有神经氨酸酶，一种可特异性靶向并杀死室管膜细胞的毒素。10,11，以及整合素-β1阻断抗体。此外还含有FGF2，因为该生长因子对于神经干细胞在微环境及体外培养中的存活与维持至关重要15,16此前已证实7 该方案对动物具有良好的耐受性；本报告进一步证实，为释放脑脊液中的神经干细胞/少突胶质前体细胞（NSCs/OPCs）而使用的释放鸡尾酒所导致的室管膜细胞损伤，仅局限于注射部位的头尾水平范围内。这一点至关重要，因为该方案应维持脑内稳态功能，包括干细胞微环境本身，并且不应影响动物的长期健康状况。释放鸡尾酒的立体定位注射属于轻度损伤操作，从未导致动物死亡。此外，从小脑延髓池进行液体活检是一种快速且微创程度极低的操作，可连续多次重复实施。
重要的是，分离得到的NSC样品 通过 挤奶法获得的细胞群能较好地反映内源性神经干细胞库的特征。侧脑室内注射 FGF2 可影响脑室下区前体细胞的特征，此时，挤奶法所获得细胞的特征也会发生相应改变。此外，既往实验研究表明，分离得到的神经干细胞 通过 SEZ的挤奶细胞自我更新能力有限，这一行为与内源性NSCs相似，这一点已被揭示 体内，转基因，细胞命运策略14,17出生后脑内的神经干细胞保持在静息状态，极少向有丝分裂活化转变以产生具有神经源性和胶质源性的子代细胞18,19,20在此，提供了乳汁来源细胞中表达GFAP且预计包含该细胞群体比例的证据 真正 NSCs 共表达 ID3（静息 NSCs 的标志物）21静息态NSCs经富集后，通常被接种于死后分离的NSCs培养所用的NSC培养基中，但这似乎限制了所获取NSCs的扩增潜能（例如，若细胞将用于自体移植，则扩增是一个关键过程）。原因是这类培养基专为活化态NSCs的存活和有丝分裂扩增而设计；因此，建立能够高效、快速激活静息态NSCs进入有丝分裂的实验方案，将提升“挤取”技术的应用价值与使用范围。
总体而言，这些数据表明，通过向活体大鼠脑室内注射释放混合物，可根据注射部位的前后位置差异，实现对出生后脑内神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）的挤取采样。本研究证明了在同一动物个体中连续进行液体活检的可行性，即使在注射释放混合物后较长时间（因此可用于设计和实施纵向实验研究）仍可实现，因为神经母细胞在注射后8个月仍聚集于脑室壁。此类方法具有重要意义，因其允许在同一个体内部开展事件追踪，从而减少由生理变异引起的生物学噪声，进而提高实验准确性，并促进“3R原则” &#34;3Rs&#34; （替代、减少和优化）。未来改进该方法的关键步骤将包括确定单次释放程序后液体活检可进行的最大次数和时间范围，尽管在必要时，执行额外的释放程序应是可行的。

组织特异性干细胞是部分定向分化的细胞，能够产生构成相应组织的所有细胞群体。除了具有多向分化潜能外，它们还具有自我更新能力，对维持组织的稳态和再生能力至关重要1。某些组织特异性干细胞处于活跃且高度增殖的状态，例如肠道干细胞或造血干细胞；而另一些，如脑内的干细胞，则大多处于静息或休眠状态2。在成年大脑中，神经干细胞（NSCs）存在于特定的微环境区域，通常称为“干细胞微环境”（niche）。其中两个被充分描述的区域位于侧脑室的室下区（SEZ）以及海马的齿状回。SEZ微环境产生的细胞数量最多，主要是神经前体细胞（神经母细胞），它们迁移至嗅球，并贡献于局部中间神经元群体；相比之下，所生成的少突胶质前体细胞则迁移至邻近的胼胝体（CC）3。少突胶质前体细胞（OPCs）是广泛分布于中枢神经系统中的有丝分裂活跃细胞，具有以下特性：i）定向于少突胶质细胞谱系；ii）可迁移至脱髓鞘病灶部位；iii）可分化为具有髓鞘形成能力的少突胶质细胞。OPCs还表现出自我更新潜能和静息特性4。
迄今为止，神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）的分离与研究均需依赖于解剖后脑和脊髓组织的死后解离。为克服这一实验局限，我们建立了一种方法，首次实现了从活体动物中分离脑内NSCs和OPCs。我们将该方法称为 &#34;挤奶&#34;，因为它能够在细胞池不被耗尽的情况下实现多次细胞收集。该方案最初在大鼠中建立，主要得益于其较大的脑容量，靶向区域主要为SEZ或CC，包含两个主要步骤。首先，获取NSCs或OPCs &#34;已移除&#34; 从组织中 通过 脑室内注射 a &#34;释放剂混合物&#34; 含有神经氨酸酶（可诱导心室壁剥脱）、整合素-β1阻断抗体以及成纤维细胞生长因子2（FGF2）。该混合液通过立体定位双侧注射至侧脑室。若目标是分离神经干细胞（NSCs），则靶向侧脑室的吻侧区域；若旨在更纯化地分离少突胶质前体细胞（OPCs），则将混合液注射至海马伞的尾侧区域。在第二次 &#34;收集&#34; 步骤：对麻醉大鼠进行枕大池脑脊液（CSF）液态活检，无需切口。将液态活检样本与NSC培养基混合，可在4 °C保存至接种。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;释放混合液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;1-整合素阻断抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>#555002</td><td>纯化NA/LE仓鼠抗大鼠CD29克隆Ha2/5，1 mg/mL。任何具有阻断活性的抗体均可适用。</td></tr><tr><td>来自&lt;em&gt;Clostridium perfringens&lt;/em&gt;（&lt;em&gt;Clostridium welchii&lt;/em&gt;）的神经氨酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#N2876</td><td>其他来源（例如霍乱弧菌）的神经氨酸酶尚未经过测试。</td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子（154个氨基酸）</td><td>Peprotech</td><td>#100-18B</td><td>以1 &amp;mu;g/&amp;mu;L储存液形式保存，溶于无菌水，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术操作&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L注射器</td><td>Hamilton</td><td>#80330</td><td>型号701 RN，可拆卸小针头，26s规格，2英寸，2型针尖</td></tr><tr><td>BD Micro-fine 1 mL胰岛素注射器</td><td>BD biosciences</td><td>04085-00</td><td>29 G × 12.7 mm</td></tr><tr><td>BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML</td><td>LAVIPHARM-CASTALIA</td><td>SKU: 5201048131168</td><td></td></tr><tr><td>Bupaq</td><td>RICHTERPHARMA</td><td>1021854AF</td><td>10 mL（布托啡诺0.3 mg/mL）</td></tr><tr><td>数字标准型大鼠和小鼠立体定位仪</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>恒温监测系统</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>ISOFLURIN 1,000 mg/g 吸入用蒸气，液体</td><td>Vetpharma Animal Health</td><td>32509/4031</td><td></td></tr><tr><td>Ketamidor</td><td>RICHTER PHARMA</td><td>SKU: 9004114002531</td><td>氯胺酮100 mg/mL</td></tr><tr><td>尼龙缝合线，Ethilon</td><td>Ethicon</td><td>D9635</td><td>透明，5-0规格</td></tr><tr><td>可充电无线外科修剪器</td><td>Stoelting</td><td>Item:51472</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，无菌</td><td>Swann Morton</td><td>AW050</td><td></td></tr><tr><td>Scopettes Jr.&amp;nbsp; 8英寸棉签</td><td>Birchwood Laboratories</td><td>34-7021-12P</td><td></td></tr><tr><td>立体定位高速钻</td><td>Foredom</td><td>1474w/o1464</td><td></td></tr><tr><td>Stoelting&amp;rsquo;s立体定位仪套件</td><td>Stoelting</td><td>Item: 52189</td><td></td></tr><tr><td>Xylan 2%</td><td>Chanelle Pharmaceuticals</td><td>13764/03/19-5-2004</td><td>赛拉嗪，25 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织与细胞处理及免疫染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>适用于显微镜观察的96孔板</td><td>Greiner</td><td>#655866</td><td>Screen star微孔板</td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1486701</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Merck</td><td>P06-1391100</td><td>第五组分，热激处理</td></tr><tr><td>柠檬酸盐</td><td>Merck</td><td>71497</td><td>一水合柠檬酸钠</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1510S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck, Calbiochem</td><td>28718-90-3</td><td>细胞核染色，稀释比例：1/1,000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td>高糖，含丙酮酸钠</td></tr><tr><td>驴抗山羊</td><td>Biotium</td><td>20016 或 20106 或 20048</td><td>稀释比例：1/1,000</td></tr><tr><td>驴抗小鼠</td><td>Biotium</td><td>20014 或 20105 或 20046</td><td>稀释比例：1/1,000</td></tr><tr><td>驴抗兔</td><td>Biotium</td><td>20015 或 20098 或 20047</td><td>稀释比例：1/1,000</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2（或bFGF）</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗GFAP</td><td>Abcam</td><td>ab53554</td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>山羊抗SOX2</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-17320</td><td>稀释比例：1/200</td></tr><tr><td>小鼠抗ID3</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-56712</td><td>稀释比例：1/200</td></tr><tr><td>小鼠抗S100&amp;beta;</td><td>Sigma</td><td>S2532</td><td>稀释比例：1/200</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Merck, Calbiochem</td><td>475904</td><td>封片剂</td></tr><tr><td>N2添加剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Merck</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Merck, Millipore</td><td>A-003-E</td><td>溶液，1.0 mg/mL</td></tr><tr><td>兔抗双皮质素（DCX）</td><td>Abcam</td><td>ab18723</td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>兔抗PDGFR&amp;alpha;</td><td>Abcam</td><td>ab51875</td><td>稀释比例：1/200</td></tr><tr><td>兔抗&amp;beta;-连环蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab16051</td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Merck</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜观察与图像分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SP6 和 SP8</td><td></td></tr><tr><td>图像分析</td><td>NIH, USA</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>图像分析</td><td>Leica</td><td>LasX</td><td></td></tr></tbody></table>

从活体大鼠中分离神经干细胞和少突胶质细胞前体细胞的“脑乳法”

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

组织特异性的神经干细胞（NSCs）在哺乳动物出生后的脑中保持活性。它们位于特化的微环境中，在那里产生新的神经元和胶质细胞。其中一个微环境是脑室下区（SEZ；也称为脑室-脑室下区），位于侧脑室的外侧壁，紧邻室管膜细胞层。少突胶质前体细胞（OPCs）广泛分布于中枢神经系统中，构成一群具有增殖能力的前体细胞，能够分化为少突胶质细胞。
神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）均具有自我更新潜能以及静息/活化循环特性。由于其所在位置的特殊性，这些细胞的分离与实验研究通常在死后进行。本文中，我们详细描述 &#34;脑部按摩法&#34;，一种从活体动物中分离神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）等多种细胞的方法。该方法为两步法实验方案，专为啮齿类动物设计，并已在大鼠中验证。首先，细胞被 &#34;释放&#34; 从组织中 通过 立体定位脑室内（i.c.v.）注射 &#34;释放剂混合物&#34;主要成分为神经氨酸酶（neuraminidase），可靶向室管膜细胞并诱导脑室壁剥脱；整合素-β1阻断抗体；以及成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2）。在第二个时间点 &#34;收集&#34; 在麻醉大鼠中，通过枕大池进行脑脊液的液体活检，无需切口即可完成该步骤。
本文展示的结果表明，分离的细胞保留了其内源性特征，且脑室下区的神经干细胞保持了其静息状态。导管层的剥离仅局限于注射的解剖水平，且动物对该操作流程（释放与收集）耐受良好&#160;。这一新方法为在实验动物中开展内源性神经发生和胶质发生纵向研究奠定了基础。

神经干细胞的释放与收集 
SEZ 的神经干细胞仅由单层室管膜细胞与脑脊液相隔，但仍与脑室内容物保持直接接触 通过 插入性单纤毛突起8,9. 神经氨酸酶特异性作用于室管膜细胞 通过 唾液酸残基的裂解可导致脑室壁裸露，进而引起神经母细胞在脑室表面聚集。10,11此外，在脑室内注射整合素-β1阻断抗体后，已在脑脊液中观察到神经母细胞的流动，这可能是由于室管膜细胞间的连接松解所致。12这些观察结果促使了一种分离脑内干细胞和祖细胞的方案的建立 通过 对侧脑室壁完整性的可控性破坏。第一步，诱导神经干细胞或少突胶质前体细胞从脑实质中释放，并随后流入脑脊液中 通过 脑室内注射释放鸡尾酒。该鸡尾酒以立体定位方式按一定速率注射 1 µL/min，双侧（2 µL 每侧脑室注射）注入侧脑室（靶向SEZ NSCs的坐标：AP = 0.3 mm，L = ±1.2 mm，D = 3.5 mm；靶向CC OPCs的坐标：AP = 1.5 mm，L = ±2 mm，D = 3.5 mm）。第二步（“采集”）是从枕大池采集脑脊液（CSF）液体活检样本。大鼠需进行麻醉，使用1 mL注射器完成活检。利用立体定位仪可几乎完全成功地采集约 100 µL 脑脊液，无需切口。将液体活检样本加入预冷的培养基中，并置于冰上保存 4 °C 直至铺板前 &lt;3 小时（NSC 培养基含有达尔伯克改良伊格尔培养基 [DMEM]、B27 添加剂 [2%]、N2 添加剂 [1%]、FGF2 [20 ng/mL] 和表皮生长因子 [EGF；20 ng/mL]）。
注射释放混合液后对脑室周围区域的组织学评估 
首批实验结果显示，当注射液体体积超过 3 µL 时，脑室可能因非特异性的机械性损伤而受损（图 2B、C）。缓慢注射 2 µL 释放混合液后，在脑室表面出现 Dcx 免疫阳性神经母细胞的簇状聚集。这些细胞簇在注射后 8 个月仍清晰可见（图 2D）。由于该方法旨在用于纵向研究，以实现对动物的长期随访，因此进一步评估了释放混合液引起的组织损伤情况。对厚度为 14 µm 的冰冻脑切片进行免疫染色，检测室管膜细胞标志物（如 S100β 和 β-catenin13），并评估室管膜层的整体完整性。室管膜层剥脱现象仅出现在注射位点附近的头尾水平区域，在侧脑室下区（SEZ）更靠前和更靠后的区域，室管膜层的扰动逐渐减少（图 2E、F），在距离注射位点约 ±2 mm 处则完全消失。上述结果表明，通过脑室内（i.c.v.）注射释放混合液所导致的室管膜层部分剥脱是局灶性的，局限于注射部位附近，而脑室周围其余区域的室管膜层保持完整。
标志物谱型及 体外 收集细胞的行为 
随后， 体外 细胞的行为及其分离细胞的标记物谱型 通过 评估了挤奶方案。每次液体活检的平均细胞产量约为 300 ± 45 个细胞（每次活检） 100 µL)7. 挤压活检获得的NSC培养物平均传代潜力为3.17 ± 0.45；而来自生理盐水注射大鼠的细胞平均仅可传代1.92 ± 0.76次；相比之下，分离自 通过 挤奶甚至达到了九代传代（p = 0.038, t 测试）（图3A)7标准尸检来源的SEZ衍生神经球培养物的平均传代能力在我们实验条件下超过12代。由于 在体 SEZ NSCs 的扩增潜能，如所示 体内 细胞命运图谱实验14，已证明存在局限性，挤奶产生的细胞具有显著差异 体外 行为比标准培养条件下的细胞更接近内源性神经干细胞的行为，尽管仍存在一定差异。收集的细胞被接种于聚-D-赖氨酸包被的培养板孔中，细胞既可形成贴壁的单层细胞生长，也可较少见地形成神经球状结构（图3B）。新鲜分离的细胞（注射后3天收集，铺板后24小时固定）对星形胶质细胞标志物GFAP呈免疫阳性，同时也对静息态标志物ID3呈免疫阳性，并具有神经干细胞典型的双极形态图 3C。此外，如先前所报道的7对同一动物来源的活检细胞与死后获取细胞在注射后第3天进行更详细的免疫细胞化学比较（检测GFAP+星形胶质细胞、Dcx+成神经细胞、PDGFRa+少突胶质前体细胞以及神经谱系SOX2+细胞），结果显示所收集细胞的表型特征与内源性SEZ细胞相似图3D值得注意的是，当在不同条件下比较活检和组织来源的细胞（例如，注射含有或不含 FGF2 的释放混合物）时，发现该生长因子在两种样本中均导致 SOX2+ 细胞数量显著增加，同时 Dcx+ 神经前体细胞数量显著减少图3D这些数据证实，内源性NSC群体谱型中出现的任何变化均会在挤奶法获得的细胞样本中得到反映。
<img alt="静态平衡示意图；神经元黏附过程；β1-int阻断抗体；液体活检装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：挤取法的图解摘要。 一个脑半球的冠状切面，显示主要解剖标志（侧脑室、其上方的胼胝体、其下方的前连合[灰质中的白质纤维束]，以及侧壁的室管膜下区[蓝色区域]）。将释放混合液注入侧脑室，导致组织完整性受损，并促使出生后脑源性神经干细胞释放至脑脊液中，随后可通过液体活检进行收集。缩写：SEZ = 室管膜下区；LV = 侧脑室；CSF = 脑脊液；pbNSCs = 出生后脑源性神经干细胞；β1-int = β1整合素。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="脑组织再生荧光显微镜图像，DCX、β-catenin、Sox2 标记物，治疗后 7-14 天。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：脑室内注射对组织学影响的评估。（A-D）侧脑室背侧半部经 Dcx 免疫染色（红色标记，用于标记成神经细胞）后的低倍镜图像。（A）仅将 Hamilton 注射器插入脑室不会破坏 SEZ 的细胞结构，而注射 10 µL 液体（输注速率为 1 µL/min）则无论内容物如何，均会导致脑室壁严重损伤。（B）生理盐水；（C）释放混合物。（D）注射 2 µL 释放混合物可导致脑室壁出现可控性损伤，该损伤即使在术后 8 个月仍可观察到。注射后第 7 天和第 14 天 SEZ 脑室壁的高倍镜细节分别显示于（E）和（F）。可见结构紊乱，Dcx+ 成神经细胞（绿色）位于脑室壁表面，而微环境中的其他细胞（Sox2+，白色）则位于更深层。在术后 2 个月时间点，注射部位的头尾水平周围脑室组织受损（见 G），而在同一动物更尾侧的水平组织则保持完整（见 H）。通过 ependymal 标记物 S100β 和 β-catenin 的免疫染色评估脑室壁。典型的脑室壁结构细节见（I）。细胞核染色使用 DAPI（蓝色显示）。比例尺 = 300 µm（A-C, G, H, 插图），150 µm（D），30 µm（E, F），50 µm（I）。本图改编自 McClenahan 等人13。缩写：SEZ = 室管膜下区；i.c.v = 脑室内；Dcx = 双皮质素；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养分析；A：传代特征的柱状图；B：干细胞标志物的免疫荧光染色；C-D：细胞形态的显微观察；E：细胞标志物表达百分比的堆叠柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3细胞分离效果的评估 通过 挤奶 (A) 图形显示了来自盐水注射动物（灰色柱，共12个样本）或经按摩后（黑色柱，共29个样本，使用含神经氨酸酶和整合素-β1阻断抗体的释放 cocktail）的液体活检样本中每样本获得的最大传代次数。B) 原代细胞的代表性共聚焦显微镜图像 通过 注射后3天，对乳汁进行GFAP和ID3免疫染色。C，D注射后3天分离的细胞，接种于多聚-D-赖氨酸包被的培养板孔中，在神经干细胞增殖培养基中培养7天后的明场图像。E) 显示分离细胞的细胞类型谱系的图表 通过 对同一实验动物的室管膜下区（SEZ）及内源性SEZ神经干细胞群体进行灌注提取。共注射FGF2后，SOX2+细胞比例显著增加，而Dcx+细胞比例显著减少。（针对每种标记物进行单因素方差分析，随后进行事后分析；每实验组n = 4–6只动物。）比例尺 = 100 µm (C，D）和 10 µm (B）。该图修改自 McClenahan 等人。13缩写：SEZ = 室管膜下区；DPI = 注射后天数；NSC = 神经干细胞；Dcx = 双皮质素；GFAP = 胶质纤维酸性蛋白 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文详细介绍了从活体大鼠脑组织中分离神经干细胞和少突胶质前体细胞的方法。该方法可在不损害动物健康状况的前提下，从同一动物多次采集这些细胞。

组织特异性的神经干细胞（NSCs）在哺乳动物出生后的脑中仍保持活性。它们位于特化的微环境中，并在其中产生新的……

我们正在研究脑神经干细胞，这是一类非常稀少的细胞，聚集在称为“生态位”的特殊微环境中。尽管它们参与嗅觉、记忆和学习功能，但在促进神经组织再生方面效率极低。因此，我们研究这些细胞的特性以及调控它们的方法，以增强神经组织的修复能力。我们已发现，脑神经干细胞对再生的贡献受到内在和外在因素的限制，例如其分化潜能受限以及对微环境因素的依赖性。同时，我们也鉴定出可用于设计策略以调控其能力的关键特性。挤奶法（milking protocol）可实现从活体实验动物中收集脑神经干细胞和少突胶质细胞前体细胞。因此，该方法可实现对细胞特性更连续的分析，并支持纵向研究的开展。目前尚无其他可从活体实验动物中分离小鼠脑源性干细胞和祖细胞的技术。当前的对照标准是死后组织中分离此类细胞，但该方法会引入多种实验不确定性及生物学偏差。我们目前正在研究脑内神经干细胞如何从静息状态被激活。我们还在比较脑内不同前体细胞群体的特性，例如成神经细胞与成少突胶质细胞前体细胞，以明确它们之间的差异特性及其对不同微环境的适应机制。

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