Name: 天然细胞中的功能性定点荧光测定法，用于研究骨骼肌兴奋性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 了解功能性定点荧光测定法在小鼠骨骼肌Kv1.1电压门控钙通道研究中的应用。该方法可实时追踪电压感受器构象变化，揭示兴奋收缩耦联机制，为肌肉生理与相关疾病研究提供新见解。

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我们感谢加州大学洛杉矶分校的 J. Vergara 博士分享 EGFP-CaV1.1（兔）野生型质粒。我们感谢耶鲁大学生理学系电子实验室，特别是 Henrik Abildgaard，在带采样保持电路的光电二极管设计与构建方面提供的支持。本研究得到了美国国立卫生研究院基金 R01-AR075726 和 R01-NS103777 的资助

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Skeletal Muscle Cells

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种在肌肉纤维中进行荧光停流检测（FSDF）的分步实验方案，用于研究来自CaV1.1通道的单个电压感受器的运动。尽管该技术结合了多个步骤和多种方法，看似复杂，但其中大多数技术在生物物理学家或细胞生物学家的实验室中通常都是常规使用的。因此，这种复杂性主要源于将各种方法整合为一种综合技术的过程。在执行多步骤实验方法时，初始阶段所做的微小改动往往要到后续步骤中才能显现其影响。只要在每一步操作中保持严谨，并制定明确的纳入与排除标准，就有可能从同一样本甚至同一根肌纤维中获得多次记录数据。
本文所述方法可适用于其他细胞类型，包括心肌细胞和神经元。此外，也可采用不同的检测系统，例如高速相机。目前，由于膜片钳（如膜片钳或双电极电压钳）技术本身具有较高的复杂性，其应用受到一定限制44。随着本方法的进一步改进（例如更明亮且光稳定性更强的探针），将有助于FSDF与电压钳技术的联合使用。
在原代分离的骨骼肌纤维中进行场刺激的优势在于，其通量高于电压钳技术，并且可用于研究其...

在活细胞中，通过已知的电刺激来追踪离子通道构象重排的能力，为分子生理学提供了宝贵的信息1。电压门控离子通道是一类膜蛋白，能够感知跨膜电压的变化，其功能也受到电压变化的影响2。上个世纪电压钳技术的发展，使生理学家得以实时研究电压门控离子通道在膜去极化过程中所介导的离子电流3。电压钳技术的应用对于理解神经元和肌肉等可兴奋细胞的电学特性至关重要。20世纪70年代，电压钳技术的改进使得研究人员能够在电压门控钙（CaV）通道和钠（NaV）通道中检测到门控行电流（或称电荷移动）4,5。门控行电流是由细胞膜电场变化引起电压传感器移动所产生的非线性电容性电流6。门控行电流被认为是离子通道开放之前或伴随开放过程发生的分子构象重排的电学表现7。尽管这些电流测量为通道功能提供了重要信息，但离子电流和门控行电流均为电压门控通道分子间和分子内构象重排的间接读数7。
功能位点特异性荧光测定法（FSDF；也称为电压钳位荧光测定法，VCF）于20世纪90年代初期开发8，首次实现了实时直接观察通道蛋白的局部构象变化及其功能。结合通道蛋白的定点诱变、电生理学技术以及异源表达系统，可对特定通道或受体在激活刺激下发生运动的结构域进行荧光标记并追踪其动态过程9,10。该方法已被广泛应用于研究电压门控离子通道中的电压感应机制8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。有关权威综述，请参见10,20,21,22,23。
CaV 和 NaV 通道对于电信号的起始与传导至关重要，它们由一个主要的 α1 亚基组成，该亚基具有一个中央孔道和四个非相同的电压感应结构域2。除了各自独特的初级结构外，CaV 和 NaV 通道还以多亚基复合物的形式表达，并包含辅助亚基24。电压门控钾通道（KV）由四个亚基组成，每个亚基类似于 NaV 或 CaV 的单个结构域25。CaV 和 NaV 通道中形成孔道和感知电压的 α1 亚基由一条单一多肽链编码，该多肽链包含四个独立的结构域，每个结构域含有六个独特的跨膜节段（S1–S6；图 1A）24,26。S1 至 S4 跨膜节段组成的区域形成电压感应结构域（VSD），而 S5 和 S6 跨膜节段则构成孔道结构域26。在每个 VSD 中，S4 α-螺旋含有带正电荷的精氨酸或赖氨酸（图 1A、B），这些残基会响应膜去极化而发生移动7。数十年的研究以及来自多种不同实验方法的结果均支持以下观点：在膜去极化时，S4 节段向外移动，从而产生门控电流6。
FSDF 测量的是与离子通道或其他蛋白质上特定半胱氨酸残基（即 S4 α-螺旋）结合的巯基反应性染料的荧光变化，该蛋白经过基因工程改造 通过 定点突变，因为该通道在膜去极化或其他刺激下发挥功能10事实上，FSDF最初是为了研究K通道中的S4片段是否V 通道中被提议作为通道主要电压感受器的部分，会在门控电荷随膜电位变化而移动时发生运动8,10对于电压门控离子通道，FSDF 能够在测量通道功能的同时，解析四个电压感应结构域（VSD）各自独立的构象重排（在任意给定时间追踪一个 VSD）。事实上，利用该方法已发现，各个 VSD 在通道激活与失活的特定过程中似乎发挥着不同的作用。12,27,28,29,30明确每个电压感应结构域（VSD）对通道功能的贡献具有重要意义，可用于进一步阐明通道的工作机制，并可能为药物开发提供新的靶点。
在异源表达系统中使用FSDF对于从还原论的角度进一步理解通道功能极为有益10,23。与许多还原论方法一样，该方法具有优势，但也存在局限性。例如，其中一个主要局限在于异源系统中通道纳米微环境的重建仅是部分实现。通常情况下，离子通道会与多种辅助亚基及其他多种蛋白质相互作用，从而调节其功能31。原则上，可通过使用多个蛋白编码载体或双顺反子质粒在异源系统中共同表达不同的通道及其辅助亚基，但其天然微环境无法被完全重建30,32。
我们课题组近期发表了一种在原代分离的骨骼肌纤维中应用的FSDF变体，用于研究兴奋-收缩耦联（ECC）的早期步骤33,34肌肉纤维电去极化与肌肉收缩激活相偶联的过程35,36首次利用该方法实现了对电压门控L型Ca通道中单个S4电压传感器的运动追踪2+ 通道（CaV1.1，也称为二氢吡啶受体（DHPR），在成年分化肌纤维的天然环境中37。这是通过考虑该细胞类型的多种特性实现的，包括细胞的电活动性，使其能够快速响应刺激并产生自传播的去极化，以及表达cDNA质粒的能力 在体 电穿孔、通道在细胞内的天然高表达和区室化分布，以及其与高速成像和电生理记录设备的兼容性。此前，我们采用高速线扫描共聚焦显微镜作为检测设备37现在介绍一种采用光电二极管进行信号采集的技术变体。这种基于光电二极管的检测系统有助于在其他实验室中推广应用该技术。
本文介绍了一种在天然细胞中利用FSDF技术研究CaV1.1电压感受器单个运动的逐步实验方案。尽管本文通篇以CaV1.1通道为例进行说明，但该技术也可应用于其他离子通道、受体或膜表面蛋白的细胞外可及结构域的研究。

<table><tbody><tr><td>透明质酸酶</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>H3884-50mg</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Eppendorf 管</td><td>Millipore Sigma</td><td>EP022363719-500EA</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z683531-100EA</td><td>结核菌素滑动针头</td></tr><tr><td>1/2&amp;rdquo; 长 29 号无菌胰岛素针头和注射器</td><td>Becton Dikinson</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 未包被塑料培养皿</td><td>Falcon, Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 未包被塑料培养皿</td><td>Falcon, Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉签</td><td>PDI</td><td>B60307</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-533 长通滤光片组</td><td>Chroma</td><td>49907</td><td>激发：530/30x；分光镜：532；发射：550lp</td></tr><tr><td>弧光灯</td><td>Sutter Instrumets</td><td>LB-LS 672</td><td></td></tr><tr><td>人工泪液软膏</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管 5 3/4&quot;</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>BTS（N-苄基-对甲苯磺酰胺）</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>203895</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>VWR</td><td>VWR-76048-960-BG</td><td></td></tr><tr><td>双电极阵列&amp;nbsp;（用于电穿孔）</td><td>BTX harvard apparatus</td><td>45-0120</td><td>10 mm 2 针阵列尖端</td></tr><tr><td>EGFP 滤光片组</td><td>Chroma</td><td>39002AT</td><td>激发：480/30x；分光镜：505；发射：535/40m</td></tr><tr><td>电穿孔装置</td><td>BTX harvard apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>EPC10</td><td>HEKA Elektronik GmbH&amp;nbsp; (Harvard Bioscience)</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biotechne,&amp;nbsp; R&amp;D Systems</td><td>RND-S11150H</td><td>胎牛血清 - 优质，热灭活</td></tr><tr><td>35 mm 玻璃盖玻片培养皿</td><td>MatTek Life Science</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Fluriso（异氟烷）吸入用液体</td><td>502017-250ml</td><td></td></tr><tr><td>恒温加热垫</td><td>Braintree scientific inc</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Thermo Fisher</td><td>INV-23017015</td><td>小鼠天然层粘连蛋白</td></tr><tr><td>橡胶吸头</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>530 nm LED</td><td>Sutter Instrumets</td><td>5A-530</td><td></td></tr><tr><td>低蛋白吸附 0.2 &amp;mu;m 无菌滤器</td><td>Pall</td><td>FG4579</td><td>Acrodisk&amp;nbsp; 注射器滤器 0.2 μm Supor 膜，低蛋白吸附，无热原</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>INV-11380037</td><td></td></tr><tr><td>MTS-5-TAMRA</td><td>Biotium</td><td>89410-784</td><td>MTS-5-TAMRA</td></tr><tr><td>OriginPro 分析软件</td><td>OriginLab Corporation</td><td>OriginPro 2022 (64-bit) SR1</td><td></td></tr><tr><td>光电二极管</td><td>定制</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PlanApo 60x 油镜&amp;nbsp; 1.4 数值孔径/&amp;infin;/0.17</td><td>Olympus</td><td>BFPC2</td><td></td></tr><tr><td>铂丝 0.5 mm，99.9% 金属纯度</td><td>SIGMA</td><td>267228-1G</td><td>用于制造场刺激电极</td></tr><tr><td>脉冲发生器</td><td>WPI</td><td>Pulsemaster A300</td><td></td></tr><tr><td>快门驱动控制器</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>快门</td><td>Uniblitz</td><td>VS2582T0-100</td><td></td></tr><tr><td>S-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>INV-11380037</td><td></td></tr><tr><td>无菌操作台垫</td><td>VWR</td><td>DSI-B1623</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>1419447-1198</td><td></td></tr><tr><td>麻醉用挥发器</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td></td></tr><tr><td>电压发生器</td><td>定制</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

利用功能性定点荧光测定法在原代细胞中研究骨骼肌兴奋性

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

功能位点定向荧光测定法一直是研究多种膜蛋白（包括电压门控离子通道）结构与功能关系的首选技术。该方法主要应用于异源表达系统，可同时测量膜电流（通道活性的电学表现）和荧光信号（报告局部结构域的构象变化）。功能位点定向荧光测定法将电生理学、分子生物学、化学与荧光技术结合为一种综合性技术，分别通过荧光和电生理手段实现对实时结构变化与功能的检测。通常，该方法需要构建含有可被巯基反应性荧光染料标记的半胱氨酸残基的工程化电压门控膜通道。直至最近，用于蛋白质位点特异性荧光标记的巯基反应化学仅在 非洲爪蟾 卵母细胞和细胞系，限制了该方法在原代非兴奋性细胞中的应用。本报告描述了功能位点定向荧光测定法在成年骨骼肌细胞中研究兴奋-收缩耦联早期步骤的适用性，兴奋-收缩耦联是指肌纤维电去极化与肌肉收缩激活相联系的过程。本实验方案详细介绍了设计和转染半胱氨酸定点突变的电压门控Ca2+ 通道（CaV1.1）利用成年小鼠趾短屈肌的肌纤维 体内 电穿孔及后续功能位点定向荧光测量所需步骤。该方法可适用于研究其他离子通道和蛋白质。对哺乳动物肌肉进行功能位点定向荧光测量在研究兴奋性基本机制方面具有重要意义。

当重复的场刺激引发传播的动作电位时，可以追踪特定频率去极化条件下电压传感器的运动。如图6A所示，可追踪VSD-II标记螺旋在10 Hz（即间隔100 ms）连续两次去极化刺激下的运动响应。通过从信号轨迹中减去基线，可校正信号漂白效应（图6B）。对第一次和第二次响应进行进一步的时间放大（图6C），可精确观察这些快速发生的VSD-II螺旋运动。场刺激触发信号提供的时间标记，可使第一次和第二次响应实现精度达10 µs的相对时间对齐。两个信号可通过各自最小值（即最低峰值）进行归一化处理，从而实现两种响应之间的动力学比较（图6D）。从这些相对荧光强度的记录中可以观察到，对于该电压传感器，连续去极化过程中达到峰值的时间具有可比性。
该方法可用于追踪单个电压传感器在不同频率去极化和多个动作电位下的运动，以研究其激活过程以及与电荷移动、钙电流或钙瞬变之间的关系；...

功能位点定向荧光法是一种实时研究蛋白质结构域运动的方法。对该技术进行改良并应用于天然细胞后， now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ 小鼠分离骨骼肌纤维中的通道。

功能位点定向荧光测定法一直是研究多种膜蛋白结构与功能关系的首选技术，……

Kv1.1 是电压门控离子通道家族的一个成员，具有四个不同的电压感受器。有证据表明，某些电压感受器对雷诺丁受体激活或钙电流的贡献更大。我们的目标是能够明确识别每个电压感受器在兴奋、收缩耦联以及钙通道激活中的具体作用。自20世纪50年代初以来，兴奋-收缩耦联一直被研究，但该过程发生的分子机制至今仍不明确。近年来，通道蛋白的冷冻电镜结构取得进展，新型Kv1.1辅助蛋白得到表征，通道的选择性剪接变体被发现，致病突变也被鉴定，这些进展重新激发了人们对这一领域的兴趣。本领域使用多种技术，从经典电生理学和分子生物学，到更前沿的技术，如冷冻电子显微镜、分子动力学模拟、靶向蛋白质降解、功能位点导向荧光测定法，以及工程化细胞或动物模型的构建。目前，该领域面临若干实验挑战。在骨骼肌中，Kv1.1 与 RYR1 之间以及多种调节蛋白之间的正确转运和通信对于支持兴奋-收缩耦联至关重要。然而，目前尚缺乏或尚未完善用于直接研究 Kv1.1 与 RYR1 之间这些蛋白质-蛋白质相互作用的方法。马丁·施耐德博士的实验室数十年来一直致力于兴奋-收缩耦联的研究，致力于表征Kv1.1中的电压感应机制、钙释放以及定位于钙释放事件（即钙火花）的过程。最近，我们的实验室开始采用新的光学技术，以研究兴奋-收缩耦联的各个步骤以及功能性成年肌细胞中电压传感器的运动。尽管此前已在异源表达系统中实现过类似研究，但我们的新方案现在能够在天然环境中追踪传播的动作电位期间Kv1.1电压传感器的构象变化。我们的新技术将使我们能够研究兴奋-收缩耦联所需的电压感受器的精确运动。我们希望了解每个S4中的哪个电荷残基对其功能至关重要，或者每个S4如何发生易位，以及所有这些易位过程是如何与Kv1.1通道的开放或雷阿诺丁受体的激活相关联的。首先，构建一个野生型、荧光标记的CaV1.1 cDNA质粒。此处使用一种质粒，用于表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的兔源Cav1.1钙通道α亚基。该质粒含有巨细胞病毒（CMV）启动子，可在肌纤维中实现高效的转染。利用 commercially available site-directed mutagenesis kit（商品化定点突变试剂盒）在待检测的通道蛋白中引入半胱氨酸替换，以便通过荧光测定法进行追踪。此处将半胱氨酸插入到通道四个S4区之一的膜外界面位置。通过GFP观察和离子电流记录，证实插入的半胱氨酸以及巯基反应性染料的存在均不影响通道的电压依赖性和电导特性。开启所有荧光测量所需的采集装置组件。将含有分离肌纤维的35毫米玻璃底培养皿放置在显微镜载物台上。用1,000微升移液器小心吸除培养基，加入2毫升室温的任氏液。使用机械或电动操纵器，将两根铂丝垂直置于培养皿底部。确保电极触点相对于纤维的纵轴对齐，并距离纤维末端几毫米。如果电极安装在独立的显微操作器上，可通过旋转培养皿或移动每个电

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科研

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生物学

天然细胞中的功能性定点荧光测定法，用于研究骨骼肌兴奋性

我们详细描述了利用电穿孔技术将质粒DNA高效转染至活体小鼠足部肌肉纤维，以及随后通过荧光显微镜观察蛋白表达的实验步骤。...

使用DNA转染哺乳动物骨骼肌 体内 电穿孔

可通过荧光Ca2+指示剂来监测库容性Ca2+内流（SOCE）的程度。利用Mn2+淬灭此类指示剂的方法，可检测培养细胞和骨骼肌纤维中的SOCE。本文还描述了一种通过共聚焦成像技术对机械去膜肌纤维进行成像，以实现SOCE时空分辨率分析的技术。...

基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

本方案利用电穿孔技术将荧光标记的蛋白质导入小鼠肌纤维并使其表达。电穿孔后经恢复，分离肌纤维。随后使用高分辨率共聚焦显微镜对单根纤维进行成像，以观察肌肉结构。...

DNA电穿孔、肌纤维的分离与成像

在此，我们介绍一种从成人肌肉组织中获取纯化人成肌细胞群体的方法。这些细胞可用于研究 体外 骨骼肌分化，特别是研究参与钙离子（Ca）相关过程的蛋白质2+...

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

我们描述了一种从成年小鼠六种肌肉中获取经酶法解离的不同长度和类型的肌纤维的方案：其中三种肌肉已有报道（趾短屈肌、趾长伸肌、比目鱼肌），另外三种则是首次成功实现解离（拇长伸肌、腓骨长肌、第四趾腓骨肌）。...

通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

对完整质粒进行定点突变是创建原始质粒微小变异体的简便方法。本文中，我们展示了一种利用常规试剂在质粒中引入碱基替换的简单且经济有效的方法。...

全质粒自制定点突变

显微解剖外植体技术是一种稳健且可靠的方法，可用于从幼年、成年或胚胎期肌肉中分离出具有增殖能力的骨骼肌细胞，以获取骨骼肌干细胞。这些细胞具有独特性，可通过克隆化培养获得骨骼肌干细胞系，用于体内移植。...

成年与胚胎骨骼肌微植块培养及骨骼肌干细胞的分离

本方案描述了一种用于研究从骨骼肌中分离的线粒体呼吸作用的方法。该方法改编自 Scorrano et al.

从骨骼肌中分离线粒体

从小鼠骨骼肌中通过酶解分离、表面标记及流式细胞术纯化纤维/脂肪生成和肌源性前体细胞的方法。...

从骨骼肌中纯化前体细胞

了解功能性定点荧光测定法在小鼠骨骼肌Kv1.1电压门控钙通道研究中的应用。该方法可实时追踪电压感受器构象变化，揭示兴奋收缩耦联机制，为肌肉生理与相关疾病研究提供新见解。

利用功能性定点荧光测定法在原代细胞中研究骨骼肌兴奋性

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