Name: 昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫、芥菜蚜虫、 Lipaphis erysimi （Kalt.） 的蚜虫作用评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 了解利用昆虫病原真菌防治芥菜蚜虫Lipaphis erysimi的离体叶片生物测定方法。该优化方案可稳定评估真菌毒力，为开发生态友好型农业害虫管理策略提供可靠技术支持。

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本研究由台湾科技事务主管部门（MOST）资助，项目编号为109-2313-B-005 -048 -MY3。

注意：完整流程图见图1。
1. 芥菜蚜虫的采集与保种
<ol>
	<li>芥菜蚜虫的采集
	<ol>
		<li>翻转叶片，目视检查田间十字花科作物上芥菜蚜虫的侵染情况。</li>
		<li>记录采样地点信息（即，GPS坐标）及寄主植物，并向农户确认杀虫剂使用历史。</li>
		<li>使用昆虫吸虫器或细毛笔（见材料表），从田间十字花科作物上采集约50头芥菜蚜虫至50 mL离心管中，并在3小时内将样本带回实验室。</li>
		<li>准备一个临时饲养用培养皿，底部放置经切割的十字花科叶片和吸有水分的滤纸。</li>
		<li>将5头蚜虫置于临时饲养培养皿中，在室温（25 ± 2 °C）、相对湿度70%、光周期12:12 h（光照:黑暗）条件下饲养14天，以确认蚜虫未受天敌感染后再进行后续扩繁。 
		注：为确保野外采集的蚜虫不携带寄生蜂或昆虫病原真菌等天敌，必须在继续饲养前确认这些生物不存在。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>芥菜蚜虫的维持饲养 
	注：维持芥菜蚜虫饲养时，应使用无农药（包括生物农药）处理的十字花科叶片。
	<ol>
		<li>提供稳定且充足的十字花科叶片（约25 cm2）。 
		注：十字花科叶片可从市场获取或自行种植。在进行长期大规模饲养前，可测试多种不同十字花科植物以筛选适宜种类。一旦确定所用十字花科叶片种类，不应更换。本研究中采用6-7叶期的小松菜（Brassica rapa var. perviridis）（见材料表）。此外，需清除最老的2-3片叶。</li>
		<li>在底部滤纸完全干燥前及时补充水分。</li>
		<li>每日观察芥菜蚜虫的种群密度。通常7天后种群数量应增长至原来的2-3倍。</li>
		<li>当蚜虫数量增加时，将原有带蚜虫的切叶分割为4-6个小片，每片带蚜虫的小叶转移至一个新的培养皿中，并加入新鲜切叶和吸有水分的滤纸。</li>
		<li>将培养皿置于25 °C、光周期12:12 h（光照:黑暗）的培养箱中，每日观察芥菜蚜虫的种群密度。</li>
		<li>在原有切叶腐烂前，待大部分蚜虫迁移至新鲜切叶后，移除原有切叶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 芥菜蚜虫的分子鉴定
注意：为了确认田间采集的芥菜蚜虫的物种，使用了两个分子标记进行分子鉴定：基于 Lu 等人设计的 A05Le 的序列特征扩增区域（SCAR）21，以及芥菜蚜虫细胞色素氧化酶亚基 1（COI）区域。
<ol>
	<li>芥菜蚜虫基因组DNA的提取
	<ol>
		<li>将约50只蚜虫收集至1.5 mL离心管中。 
		注意：用于分子鉴定的蚜虫应为单个蚜虫的后代，不同发育阶段的个体也可混合于同一管中进行DNA提取。</li>
		<li>使用研磨杵将蚜虫组织匀浆，并按照Gene-Spin基因组DNA提取试剂盒的说明书操作提取DNA（见材料表）。</li>
		<li>用50 µL预热的无核酸酶水洗脱基因组DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR扩增与DNA测序
	<ol>
		<li>使用PCR Master Mix（2×）及引物对A05LeF/A05LeR和LeCO1F/LeCO1R，对蚜虫基因组DNA中的目标DNA序列进行PCR扩增（表1），采用不同的PCR程序21。 
		注意：总体积为20 µL的PCR反应体系包含2 µL蚜虫基因组DNA模板、1 µL正向引物、1 µL反向引物、10 µL PCR Master Mix（见材料表）以及6 µL ddH2O。</li>
		<li>在PCR仪（见材料表）中按以下程序进行PCR扩增：94 °C预变性5 min；随后进行25个循环，每个循环包括94 °C变性45 s、61 °C（A05LeF/A05LeR）或58 °C（LeCO1F/LeCO1R）退火45 s、72 °C延伸1 min；最后72 °C终延伸5 min。</li>
		<li>通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以确认芥菜蚜虫的身份（图2）。 
		&#8203;注意：若引物对A05LeF/A05LeR成功扩增出正确大小的DNA片段，则可明确鉴定野外采集的蚜虫为芥菜蚜虫21。引物对列于表2中。</li>
		<li>使用市售的凝胶/PCR产物纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化芥菜蚜虫COI扩增产物（见材料表），并送商业测序服务机构进行测序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>序列分析 
	注意：根据Lu等21的研究，A05Le的DNA弯曲区是芥菜蚜虫特有的DNA片段；因此，A05Le的PCR产物无需进一步测序。
	<ol>
		<li>获得LeCO1序列后，使用Chromas软件（见材料表）检查测序读段质量。</li>
		<li>打开fasta（或txt）文件，直接切除上下游低质量读段。</li>
		<li>将修剪后的序列提交至NCBI在线BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），使用默认参数进行比对。&#160; 
		&#8203;注意：若A05Le和LeCO1引物组扩增的产物大小正确，则理论上该序列在NCBI标准数据库中的BLAST比对结果必须与芥菜蚜虫匹配。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 昆虫病原真菌的制备
注意：本研究中使用的EPF见表1。
<ol>
	<li>从真菌文库中复苏EPF
	<ol>
		<li>从-80 °C冰箱中取出保存的真菌菌种（孢子悬浮于30%甘油中），解冻。</li>
		<li>在超净工作台中，用接种环取少量（约10 µL）孢子悬液转移至6 cm的¼沙氏葡萄糖琼脂（SDA）平板（每100 mL ddH2O中含0.75 g沙氏葡萄糖肉汤和1.5 g琼脂），并用涂布棒均匀涂布。</li>
		<li>用封口膜密封培养皿，于25 °C黑暗条件下培养10–14天。</li>
		<li>将真菌菌落通过划线法转接至新的¼ SDA平板，于25 °C黑暗条件下培养10–14天后收集孢子22。 
		注意：真菌培养物应在接种蚜虫前约10天使用。不建议使用培养超过14天的EPF菌株进行毒力测定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孢子悬液的制备
	<ol>
		<li>在¼ SDA平板上培养10–14天的真菌培养物中，加入2–3 mL 0.03% Tween 80（见材料表），用接种环刮取孢子。</li>
		<li>将真菌悬液收集至离心管中。</li>
		<li>在最高转速下涡旋振荡，使用血细胞计数板在光学显微镜下计数孢子数量，并将孢子悬液浓度调整至108 个孢子/mL。</li>
		<li>将孢子悬液转移至经紫外灭菌的微型喷雾器中。 
		&#8203;注意：转移前需再次涡旋振荡孢子悬液，因孢子易发生沉淀。微型喷雾器在使用前应在超净工作台中接受紫外线照射30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 针对芥菜蚜虫的毒力筛选
<ol>
	<li>新羽化成虫的准备
	<ol>
		<li>将无翅型（无翅）和有翅型（具翅）成虫从饲养用培养皿转移到新鲜切取的叶片上，以繁殖同龄后代。24小时后移除成虫，以避免过度拥挤，并减少有翅型后代的产生23,24。后续实验仅使用无翅型成虫。</li>
		<li>将后代饲养至成虫阶段，并在48小时后移除未能发育至成虫阶段的个体（图3），以防止实验中蚜虫之间出现龄期差异。此外，移除所有有翅型成虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种室的制备 
	注意：建议先准备好直径为9 cm的十字花科叶片，以便在琼脂凝固前将叶盘嵌入水琼脂中。
	<ol>
		<li>用自来水清洗十字花科叶片，去除污垢、残留物以及可能存在的其他节肢动物。</li>
		<li>用纸巾擦去多余水分，并在体视显微镜下检查十字花科叶片表面是否存在其他节肢动物。如发现，应立即清除。</li>
		<li>使用底部培养皿作为模具直接按压叶片，或使用剪刀切割出直径为9 cm的叶盘。 
		注意：若叶片直径小于9 cm，可将数片切下的叶片拼接使用。</li>
		<li>通过微波加热，将450 mg琼脂（见材料表）溶解于30 mL ddH2O中，为每个培养皿制备1.5%的水琼脂。 
		注意：1.5%水琼脂的用量可根据实验规模进行调整。</li>
		<li>在超净工作台中，于琼脂凝固前向9 cm培养皿中倒入30 mL 1.5%水琼脂，待其冷却至约40 °C，直至琼脂表面呈半凝固状态。 
		注意：可通过轻轻水平晃动培养皿检查表面是否已半凝固。</li>
		<li>将叶盘背面朝上放置于水琼脂表面，并将其嵌入琼脂中。 
		注意：尽量减少琼脂表面的暴露面积。</li>
		<li>待水琼脂完全凝固后，盖上培养皿盖。 
		注意：若盖子内表面迅速凝结大量水滴，应打开盖子以促进水分蒸发。</li>
		<li>在叶盘上放置20只无翅型成虫。 
		注意：建议在体视显微镜下操作，以防损伤其口器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EPF接种与观察
	<ol>
		<li>打开接种室盖子，从距叶盘约15 cm高处，将0.3 mL分生孢子悬浮液（来自步骤3.2）直接喷洒至蚜虫和叶盘表面。 
		注意：喷洒前需再次涡旋混匀分生孢子悬浮液。不同喷雾器的喷洒范围可能存在差异，建议在实验前测试喷洒区域。本实验推荐使用0.3 mL体积、距离15 cm。喷洒范围应覆盖整个叶盘，且叶盘表面应形成一层薄薄的分生孢子悬浮液。若液滴聚集成积水，则应减少接种量。接种前及使用不同菌株之间，需用70%乙醇清洁操作台面。</li>
		<li>等待分生孢子悬浮液干燥后，盖上盖子，以防芥菜蚜虫溺亡。 
		注意：蚜虫在实验过程中通常活动较少，但仍需确保其不会逃逸。</li>
		<li>用石蜡膜密封接种室以维持高相对湿度，并将接种室置于25 °C、12:12 h（光:暗）光周期的培养箱中。</li>
		<li>每隔12小时打开接种室盖子，在体视显微镜下统计死亡率，持续5天。</li>
		<li>用纸巾擦拭附着在盖子上的蜜露，并用细毛笔移除新羽化的蚜虫。每24小时用自来水清洗盖子一次。 
		注意：不同蚜虫种类的成虫寿命不同，观察周期可能需相应调整。</li>
		<li>将死亡虫体保留在叶盘上，以便观察真菌定殖（mycosis），确认接种成功。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分生孢子萌发率的确认 
	注意：此步骤为可选步骤。在进行毒力筛选时，可成对检测分生孢子萌发率，以确保孢子活性。
	<ol>
		<li>将5 µL分生孢子悬浮液滴加至¼ SDA培养基上，设三个重复。</li>
		<li>18小时后，使用光学显微镜计算萌发率。在单个液滴中随机计数至少100个孢子，以确认真菌的萌发率。 
		&#8203;注意：通常实验所用菌株的分生孢子萌发率应高于90%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 所选昆虫病原真菌分离物的生物测定
注意：从第4步中筛选出的高毒力EPF菌株，需采用4种不同浓度的分生孢子悬浮液（浓度范围为104至107个分生孢子/mL），对芥菜蚜虫进行生物测定。
<ol>
	<li>分生孢子悬液的制备
	<ol>
		<li>重复步骤 3.1，以复苏所选的虫生真菌分离株。</li>
		<li>重复步骤 3.2，制备四种浓度的分生孢子悬液，分别为 104、105、106, 和 107 个分生孢子/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>新羽化成虫的制备
	<ol>
		<li>重复步骤 4.1，以制备新羽化成虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种室的制备
	<ol>
		<li>重复步骤 4.1，以制备接种室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>虫生真菌接种与观察
	<ol>
		<li>重复步骤 4.3，分别使用四种浓度的分生孢子悬液进行虫生真菌接种与观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>校正死亡率的计算
	<ol>
		<li>使用Abbott公式计算校正死亡率25，如下所示： 
		校正死亡率（%）= [(MT− MC) × 100%] / (100− MC) 
		MT 表示处理组的死亡率，而 MC 表示对照组的死亡率。 
		&#8203;注意：对照组的死亡率不应高于20%。</li>
		<li>打开SPSS软件平台（参见 材料表），创建变量，包括 &#34;治疗&#34; 和 &#34;cor_mor&#34; （表示校正死亡率），并输入在相同时间点以相同接种浓度接种不同分离株的计算结果。</li>
		<li>选择 分析、比较均值与比例、独立样本T检验 在 SPSS 中用于独立样本 t检验 分析。</li>
		<li>在 SPSS 中输入 治疗 进入 &#34;分组变量&#34; 盒，和 cor_mor 到……中 &#34;测试变量&#34;. 根据不同真菌分离株定义分组。按压 好的 进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中位致死时间（LT）的计算50）和半数致死浓度（LC50)
	<ol>
		<li>打开 SPSS，创建变量 &#34;总计&#34;, &#34;反应&#34; 和 &#34;持续时间&#34;/&#34;浓度&#34;，并将记录的结果输入电子表格中。</li>
		<li>选择 分析，回归，概率单位 在 SPSS 中计算 LT50 和/或液相色谱50. 
		注意：如果累积死亡率最终未超过50%，则LT50 和/或液相色谱50 无法估计。</li>
		<li>输入 总计 到……中 &#34;总观察数&#34; 盒 反应 进入 &#34;反应频率&#34; 盒 持续时间/浓度 进入 &#34;协变量&#34; 盒。按压 好的 进行分析。 
		注意：通常情况下，按压 选项 并设置 &#34;异质性因子应用的显著性水平&#34; 到 0.05.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimized Bioassay for Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphid

<ol><li>Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+regional+wind+circulation+and+meteorological+factors+on+long-range+migration+of+mustard+aphids+over+indo-gangetic+plain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain.</a> Scientific Reports. 9, 5626(2019).</li>
<li>Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventable+yield+losses+and+management+of+mustard+aphid%2C+Lipaphis+erysimi+%28Kaltenbach%29+in+different+cultivars+of+Brassica+juncea%28L.%29+Czern+%26+Coss%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss.</a> Crop Protection. 161, 106070(2022).</li>
<li>Huang, F., Hao, Z., Yan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+oilseed+rape+seed+treatment+with+imidacloprid+on+survival%2C+feeding+behavior%2C+and+detoxifying+enzymes+of+mustard+aphid%2C+lipaphis+erysimi%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi.</a> Insects. 10 (5), 144(2019).</li>
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</ol>

作者声明本工作中不存在利益冲突。

芸薹属蔬菜是一类常受多种蚜虫侵扰的植物，其中包括芥菜蚜（L. erysimi）和甘蓝蚜（Brevicoryne brassicae）26。这两种蚜虫均已有在中国台湾的报道27，且有可能在同一采集地点共存。为了区分这些亲缘关系较近的蚜虫种类，本研究采用了一种基于多重引物组的分子鉴定技术21。通过针对芥菜蚜COI基因片段设计分子标记，我们成功鉴定了芥菜蚜，从而证实了分子标记A05Le在此用途中的可靠性21。
观察结果表明，仅凭体型或形态特征来区分无翅的四龄若虫与成年芥菜蚜虫，在缺乏经验的情况下具有挑战性。然而，一个关键的鉴别特征是后足胫节：四龄若虫的后足胫节呈白色，而成虫则不呈现白色（图3）。以往关于L. attenuatum、B. bassiana对抗棉蚜以及<em...

芥菜蚜虫（L. erysimi）是一种臭名昭著的害虫，可侵袭多种十字花科作物，造成严重的经济损失1。尽管已推荐使用多种系统性杀虫剂来防治蚜虫侵害，但频繁使用这些杀虫剂引发了对农药抗药性的担忧2,3。因此，从环境友好型害虫管理的角度来看，昆虫病原真菌（EPF）可作为一种合适的替代防控策略。EPF 是一类能够通过穿透寄主表皮感染昆虫的病原体，因而对控制蚜虫及其他刺吸式口器害虫具有较强效力4。此外，EPF 已被证明是一种可行且可持续的害虫管理技术，具有拮抗植物病原菌和促进植物生长等多重优势5。
EPF 可通过昆虫-土壤诱捕法获得，或从田间昆虫尸体中分离得到6,7。然而，在进一步使用真菌分离物之前，必须进行致病性筛选。已有许多研究探讨了EPF对蚜虫的防治效果，蚜虫是重要的农作物害虫，可造成严重危害8,9。在多种蚜虫中，芥菜蚜虫已被用于测试对多种Beauveria spp.、Metarhizium spp.、Lecanicillium spp.、Paecilomyces spp.菌株的敏感性，甚至包括Alternaria——该真菌主要被视为腐生性及植物病原真菌，但也显示出对芥菜蚜虫一定的致死作用10,11,12。
为了在实验室条件下评估杀虫真菌（EPF）对蚜虫的防治效果，生物测定可分为两个主要部分：接种室的建立和真菌接种。本方案描述了接种室的构建方法，其中可通过多种方式维持蚜虫的存活，例如使用叶柄包裹湿润棉絮的离体叶片、置于铺有湿润滤纸的培养皿中的离体叶盘、直接在盆栽植株上饲养，或在培养皿或容器中将离体叶盘嵌入水琼脂中10,11,13。常见的真菌接种方法包括分生孢子喷雾法、将蚜虫浸入分生孢子悬浮液、将叶片浸入分生孢子悬浮液以及植物内生菌接种法11,14,15,16。尽管存在多种接种方法，生物测定应尽可能模拟田间施用条件。例如，在叶片浸渍法12,17中，虽可评估EPF的效力，但由于蚜虫取食带有真菌的叶片，其背部（真菌优先侵入部位）通常无法充分接触真菌。
为了在实验室条件下评估虫生真菌（EPF）对蚜虫的杀虫效果，本方案建议采用Yokomi和Gottwald18描述的离体叶片法并进行部分修改，随后使用微型喷雾器进行分生孢子接种。该方法可在生物测定培养皿中维持约100%的湿度，至少持续七天，无需额外补充水分18,19。此外，将蚜虫限制在单一表面可确保其充分接触分生孢子喷雾，并便于后续观察20。然而，蚜虫在接种培养皿内活动时，可能会粘附在暴露的琼脂表面。另外，由于芥菜蚜虫属于孤雌生殖昆虫，发育和繁殖迅速，在培养皿实验中记录数据可能存在困难。若不进行移除，很难区分接种的成虫与其后代。关于如何执行该步骤的具体操作细节在文献中鲜有提及，一些不一致的因素（如叶片取食面积）仍需进一步优化。
本方案展示了一种稳定的系统，用于筛选球孢白僵菌（EPF）分离株对芥菜蚜虫的毒力，从而能够从大量的EPF菌株库中选择出对多种蚜虫具有潜力的分离株。通过该方法，可对田间采集的蚜虫进行鉴定，并在实验室建立足够数量的芥菜蚜虫种群，以采用简便且可行的技术评估不同真菌分离株的杀蚜效果，并获得一致的结果。在农业生态系统中，蚜虫因长期且反复受到人为干预的压力，已进化出多种适应机制，这对粮食安全构成了挑战9。因此，本研究所描述的方法可进一步推广应用于评估潜在EPF分离株对多种蚜虫物种的防治效果。

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;L 接种环</td><td>NEST Scientific</td><td>718201</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder III</td><td>Geneaid</td><td>DL007</td><td></td></tr><tr><td>2x SuperRed PCR Master Mix</td><td>Biotools</td><td>TE-SR01</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Bioman Scientific</td><td>ET5050-12</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 培养皿</td><td>Alpha Plus Scientific</td><td>16021</td><td></td></tr><tr><td>6 mm 昆虫吸虫器</td><td>MegaView Science</td><td>BA6001</td><td></td></tr><tr><td>70 mm 滤纸 NO.1</td><td>Toyo Roshi Kaisha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9 cm 培养皿</td><td>Alpha Plus Scientific</td><td>16001</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Bioman Scientific</td><td>AGR001.1</td><td>微生物学级</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Bioman Scientific</td><td>PB1200</td><td></td></tr><tr><td>BioGreen Safe DNA Gel Buffer</td><td>Bioman Scientific</td><td>SDB001T</td><td></td></tr><tr><td>Chromas</td><td>Technelysium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneDoc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenepHlow Gel/PCR Kit</td><td>Geneaid</td><td>DFH300</td><td>https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf</td></tr><tr><td>Gene-Spin 基因组 DNA 提取试剂盒</td><td>Protech Technology</td><td>PT-GD112-V3</td><td>http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Paul Marienfeld</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>小松菜叶片（&lt;em&gt;Brassica rapa&lt;/em&gt; var. &lt;em&gt;perviridis&lt;/em&gt;）</td><td>泰成农场</td><td>1-010-300410</td><td></td></tr><tr><td>微型喷雾器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp 热循环仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>芥菜蚜虫（&lt;em&gt;Lipaphis erysimi&lt;/em&gt;）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td>天成刷业公司</td><td>4716608400352</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>研磨杵</td><td>Bioman Scientific</td><td>GT100R</td><td></td></tr><tr><td>沙氏葡萄糖肉汤</td><td>HiMedia</td><td>MH033-500G</td><td></td></tr><tr><td>SPSS Statistics</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液 50x</td><td>Bioman Scientific</td><td>TAE501000</td><td></td></tr><tr><td>吐温 80</td><td>PanReac AppliChem</td><td>142050.1661</td><td></td></tr></tbody></table>

评估昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫芥菜蚜虫 lipaphis erysimi (kalt.) 的杀蚜效果

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

芥菜蚜虫（L. erysimi）是一种危害多种十字花科作物并传播植物病毒的害虫。为实现环境友好的害虫治理，昆虫病原真菌（EPF）可作为潜在的微生物防治制剂用于控制该害虫。因此，在田间应用前，有必要在培养皿条件下对EPF菌株进行毒力筛选。然而，芥菜蚜虫为孤雌生殖昆虫，这使得在培养皿实验中记录数据较为困难。为此，本研究开发了一种改良的离体叶片生物测定系统，采用微型喷雾器将分生孢子接种至蚜虫体表，并通过促进孢子悬浮液的空气干燥以防止蚜虫溺亡。该系统在整个观察期间维持了较高的相对湿度，且叶片圆片在十天以上仍保持新鲜，支持蚜虫的孤雌生殖繁殖。为防止后代积累，采用画笔每日清除子代蚜虫。本方案展示了一种稳定评估EPF菌株对芥菜蚜虫或其他蚜虫毒力的系统，可用于筛选具有应用潜力的菌株以实现蚜虫防控。

图示流程展示了从田间采集到毒力筛选过程中芥菜蚜虫的稳定状态。通过田间采集并维持蚜虫种群，确保了在充足食物供应下蚜虫群体的稳定增长。利用分子标记（包括PCR扩增片段大小和LeCO1基因测序）对田间采集的蚜虫进行鉴定，确认其为芥菜蚜虫。采用离体叶片法进行的毒力筛选结果显示，芥菜蚜虫具有稳定的存活率，其中对照组的存活率达到85%（图4）。
在毒力筛选过程中，Cc-NCHU-213 表现出最快的杀蚜能力，接种后 3 天和 4.5 天的致死率分别达到 50% 和 90%（图 4）。然而，五株 B. bassiana 分离株之间的杀蚜能力存在差异。Bb-NCHU-141、-143 和 -153 的杀蚜能力较弱，在接种后 3 天时致死率仅为 5%，即使排除了 0.03% Tween 80 喷雾或其他致死因素的影响亦如此（图 4）。因此，采用校正死亡率公式对对照组死亡率进行标准化处理。大多数虫生真菌分离...

本方案介绍了一种优化的离体叶片生物测定系统，用于评估昆虫病原真菌（EPF）对孤雌生殖昆虫芥菜蚜（Lipaphis erysimi (Kalt.)）的防治效果。该方法详细说明了在培养皿实验过程中的数据采集流程，使研究人员能够持续一致地测定EPF对芥菜蚜及其他孤雌生殖昆虫的毒力。

评估昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫芥菜蚜虫 Lipaphis erysimi (Kalt.) 的杀蚜效果

芥菜蚜虫（L. erysimi）是一种危害多种十字花科作物并传播植物病毒的害虫。为实现环境友好的害虫管理，...

如今，环境友好的害虫管理方法广受青睐。然而，在实施之前，必须对昆虫病原真菌进行充分测试。本研究展示了昆虫病原真菌库在防治芥菜蚜虫方面的有效性，充分体现了其应用潜力。降低昆虫病原真菌预处理的高死亡率以及防止在储存悬浮液中发生病原暴发具有挑战性。我们已成功开发出一种稳定的系统，并取得了预期结果。该系统涉及使用适当的装置或生物测定室，以在测试过程中有效维持这种微小病原体的活性。本方案成功展示了一种无需测量琼脂温度即可建立脱离方法的可行途径，从而简化了实验腔室的构建过程。此外，我们强调了尽量减少琼脂表面暴露的重要性，以防止蚜虫在腔室内活动时被粘住。我们对芥菜蚜虫在因昆虫病原真菌感染而死亡之前所表现出的免疫反应深感兴趣。通过研究基因表达数据，我们可以鉴定出关键基因，这些基因可作为潜在靶点，与昆虫病原真菌应用联合用于基因敲降。首先，准备一个临时饲养用的培养皿，在底部放置切除的十字花科植物叶片和吸有水的滤纸。然后，将五只蚜虫放入已准备好的培养皿中。当蚜虫数量增加时，将最初切下的叶片切成四到六个较小的片段。将每片带有蚜虫的小叶片分别转移至含有新鲜叶片和湿润滤纸的独立培养皿中。为收集蚜虫基因组DNA，首先使用 pellet 研杵对蚜虫进行匀浆处理。接下来，按照 GENESpin 基因组 DNA 分离试剂盒的制造商说明书提取 DNA。使用 50 µL 预热的无核酸酶水洗脱基因组 DNA，完成提取过程。将 DNA 样品加入含有引物对的 PCR 混合液中，进行 PCR 扩增和 DNA 测序。使用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以确认芥菜蚜虫的种类。通过分子标记（包括PCR扩增片段大小和Lipaphis erysimi CO1测序）确认田间采集的蚜虫为芥菜蚜虫。从真菌文库中回收EPF时，首先将真菌分离物涂布于四分之一强度的SDA平板上。在25摄氏度避光条件下培养10至14天，然后进行分生孢子收获。之后，用移液器将2至3毫升0.03%吐温80加入培养皿中，再用接种环刮取分生孢子。接着，将真菌悬液转移至离心管中。将悬浮液在最高转速下剧烈涡旋振荡，然后用移液器吸取样品至血细胞计数板中，对分生孢子数量进行计数。使用0.03%吐温80将悬浮液中的分生孢子稀释至所需浓度。准备接种室时，首先以底部培养皿为模具或使用剪刀切割出直径为9厘米的叶片圆片。接下来，使用微波炉为每个培养皿制备1.5%的水琼脂。将30毫升冷却后的水琼脂倒入培养皿中，并在超净工作台中使其凝固。当琼脂表面呈半固态时，将叶圆片背面朝上放置，然后轻轻按压，使其嵌入琼脂中。现在，将20只无翅成虫放置于叶盘上。打开接种室的盖子，将0.3毫升的分生孢子悬浮液直接喷洒到蚜虫和叶盘上。待悬浮液干燥后，盖上盖子，以防止芥菜蚜虫受潮死亡。随后，用石蜡膜密封接种室以保持较高的湿度，将接种室置于温度设定为25°C、光照与黑暗周期各12小时的培养箱中。

assessment-aphidicidal-effect-entomopathogenic-fungi-against

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫、芥菜蚜虫、 Lipaphis erysimi （Kalt.） 的蚜虫作用评估

本实验方案展示了两种接种方法，用于将虫生真菌Beauveria bassiana作为内生菌引入普通菜豆（Phaseolus...

将真菌昆虫病原菌定殖为内生菌：迈向内生生物防治

本文报道了基于知识开发高效真菌杀虫剂所涉及的不同阶段，包括分离、鉴定、筛选和选择最适昆虫病原真菌——金龟子绿僵菌（Metarhizium...

发展 绿僵菌 作为一种真菌杀虫剂：从分离到田间表现

蚜虫Aphis nerii定殖于夹竹桃科（Apocynaceae）这类具有高度防御能力的植物上，为研究植物与昆虫之间的相互作用提供了丰富的研究机会。本文中，我们介绍了一系列用于维持植物和蚜虫培养物，以及生成和分析A.

维持 Aphis nerii 的生物培养及基因表达检测：植物-昆虫互作研究中的非模式系统

本文介绍了一种基于 黄粉虫（Tenebrio...

从土壤样品中分离与筛选昆虫病原真菌及其对害虫的致病力评估

昆虫病原真菌作为农业害虫的生物防治制剂，其重要性日益凸显。本研究利用农业谷物产品，成功实现了对两种南非分离的Metarhizium robertsii和M.

昆虫病原真菌 Metarhizium robertsii 和 Metarhizium pinghaense 的大规模生产及其在防治害虫中的商业应用

本文介绍了一种从森林钻蛀性害虫中分离昆虫病原真菌的实验方案，并提供了一种利用鞘翅目模式昆虫评估其昆虫病原活性的替代方法。该方法对于在天然林中挖掘和研究钻蛀性害虫来源的昆虫病原真菌资源具有高效性和便利性。...

从森林木蛀虫中分离、行为鉴定及昆虫病原真菌致病性评估

建立了一种用于大规模饲养辣椒蓟马的离体叶片生物测定方案，该方法采用含琼脂玻璃容器中的改良离体叶片法，可确保高存活率和发育同步化。该系统能够高效筛选昆虫病原真菌对2nd龄幼虫的毒力，并为实验室、温室及田间评价提供稳定的蓟马种源。...

建立辣椒蓟马（Scirtothrips dorsalis Hood）人工饲养系统用于昆虫病原真菌毒力筛选

本视频展示了一种在受控环境下研究好氧真菌降解木质纤维素植物组织的方法。琼脂块微环境系统能够控制营养来源和湿度，这是其主要优势，但该方法常出现结果不一致的问题。本文针对关键的实验陷阱进行探讨，以获得可重复、变异度低的实验结果。...

用于好氧真菌控制植物组织分解的琼脂块微宇宙系统

RNA-Seq 分析在揭示非模式生物适应性状分子基础方面正变得越来越重要。本文介绍了一项从蚊子饲养、RNA测序到RNA-Seq数据的生物信息学分析，用于鉴定滞育与非滞育状态的白纹伊蚊（Aedes...

一种用于亚洲虎蚊Aedes albopictus光周期滞育研究的RNA-seq实验与生物信息学分析方案

通过两种方法估算埃及伊蚊（Aedes...

生理记录与黄热病蚊子Aedes aegypti味觉附器的RNA测序

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评估昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫芥菜蚜虫 Lipaphis erysimi (Kalt.) 的杀蚜效果

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