评估昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫芥菜蚜虫 Lipaphis erysimi (Kalt.) 的杀蚜效果

如今，环境友好的害虫管理方法广受青睐。然而，在实施之前，必须对昆虫病原真菌进行充分测试。本研究展示了昆虫病原真菌库在防治芥菜蚜虫方面的有效性，充分体现了其应用潜力。

降低昆虫病原真菌预处理的高死亡率以及防止在储存悬浮液中发生病原暴发具有挑战性。我们已成功开发出一种稳定的系统，并取得了预期结果。该系统涉及使用适当的装置或生物测定室，以在测试过程中有效维持这种微小病原体的活性。

本方案成功展示了一种无需测量琼脂温度即可建立脱离方法的可行途径，从而简化了实验腔室的构建过程。此外，我们强调了尽量减少琼脂表面暴露的重要性，以防止蚜虫在腔室内活动时被粘住。我们对芥菜蚜虫在因昆虫病原真菌感染而死亡之前所表现出的免疫反应深感兴趣。

通过研究基因表达数据，我们可以鉴定出关键基因，这些基因可作为潜在靶点，与昆虫病原真菌应用联合用于基因敲降。首先，准备一个临时饲养用的培养皿，在底部放置切除的十字花科植物叶片和吸有水的滤纸。然后，将五只蚜虫放入已准备好的培养皿中。

当蚜虫数量增加时，将最初切下的叶片切成四到六个较小的片段。将每片带有蚜虫的小叶片分别转移至含有新鲜叶片和湿润滤纸的独立培养皿中。为收集蚜虫基因组DNA，首先使用 pellet 研杵对蚜虫进行匀浆处理。

接下来，按照 GENESpin 基因组 DNA 分离试剂盒的制造商说明书提取 DNA。使用 50 µL 预热的无核酸酶水洗脱基因组 DNA，完成提取过程。将 DNA 样品加入含有引物对的 PCR 混合液中，进行 PCR 扩增和 DNA 测序。

使用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以确认芥菜蚜虫的种类。通过分子标记（包括PCR扩增片段大小和Lipaphis erysimi CO1测序）确认田间采集的蚜虫为芥菜蚜虫。从真菌文库中回收EPF时，首先将真菌分离物涂布于四分之一强度的SDA平板上。

在25摄氏度避光条件下培养10至14天，然后进行分生孢子收获。之后，用移液器将2至3毫升0.03%吐温80加入培养皿中，再用接种环刮取分生孢子。接着，将真菌悬液转移至离心管中。

将悬浮液在最高转速下剧烈涡旋振荡，然后用移液器吸取样品至血细胞计数板中，对分生孢子数量进行计数。使用0.03%吐温80将悬浮液中的分生孢子稀释至所需浓度。准备接种室时，首先以底部培养皿为模具或使用剪刀切割出直径为9厘米的叶片圆片。

接下来，使用微波炉为每个培养皿制备1.5%的水琼脂。将30毫升冷却后的水琼脂倒入培养皿中，并在超净工作台中使其凝固。当琼脂表面呈半固态时，将叶圆片背面朝上放置，然后轻轻按压，使其嵌入琼脂中。

现在，将20只无翅成虫放置于叶盘上。打开接种室的盖子，将0.3毫升的分生孢子悬浮液直接喷洒到蚜虫和叶盘上。待悬浮液干燥后，盖上盖子，以防止芥菜蚜虫受潮死亡。

随后，用石蜡膜密封接种室以保持较高的湿度，将接种室置于温度设定为25°C、光照与黑暗周期各12小时的培养箱中。使用体视显微镜每12小时统计一次死亡率，持续五天。致病性筛选结果显示芥菜蚜虫的存活率较为稳定，对照组的存活率为85%。

蛹虫草（Cordyceps cateniannulata）表现出最快的杀蚜虫能力，在接种后3天和4.5天分别达到50%和90%的死亡率（DPI）。白僵菌菌株141、143和153的杀蚜虫能力较慢，在接种后3天（3 DPI）仅导致5%的死亡率。除紫红曲霉（Purpureocillium）外，大多数虫生真菌分离株在接种后5天内校正死亡率均超过70%。

在EPF分离物中，球孢白僵菌表现出最高的致死率，达到100%。在毒力筛选过程中，观察到感染绿僵菌属、白僵菌属、淡紫紫孢菌和链孢虫草菌的芥菜蚜虫尸体上出现EPF真菌病症状。首先启动SPSS软件平台。

创建名为处理和校正死亡率的变量，然后输入在同一时间点以相同浓度接种的不同菌株的计算结果。在SPSS中进行独立样本T检验分析时，依次导航至分析、比较均值和比例，然后选择独立样本T检验。接下来，将处理输入到分组变量框中，将校正死亡率输入到检验变量框中。

根据不同的真菌分离株对组别进行分类，然后点击确定以开始分析。为计算中位致死时间与中位致死浓度，需创建定义为总数、反应值以及持续时间或浓度的变量。接下来，将记录的结果输入电子表格中。

最后，选择“分析”，然后选择“回归”，再选择“探针”以计算半数致死时间和半数致死浓度。每毫升10的7次方分生孢子的接种量在接种后第3天和第4天导致金龟子绿僵菌菌株197与虫草菌株213的校正死亡率存在显著差异。虫草菌株213表现出的致死持续时间显著短于其他处理组。

其致死剂量值也低于金龟子绿僵菌213菌株。