Name: Rho1介导的肌动肌蛋白收缩力的光遗传学抑制与 果蝇 胚胎上皮张力的测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: 了解利用光遗传学技术抑制果蝇胚胎中Rho1介导的肌动肌蛋白收缩力的方法，并测量上皮张力的变化。该技术为发育生物学研究提供了精确调控组织力学的新工具。

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作者感谢Ann Lavanway提供的成像支持。作者感谢Wieschaus实验室和De Renzis实验室分享试剂，以及Bloomington果蝇品系中心提供果蝇品系。本研究由NIGMS ESI-MIRA R35GM128745基金和美国癌症协会机构研究资助#IRG-82-003-33（资助给BH）支持。

1. 设置遗传杂交并准备收卵杯
<ol>
	<li>在立体显微镜下，从光遗传学品系 UASp-CIBNpm (I)；UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) 中选取雌性果蝇（处女蝇），置于 CO2 垫上，并与母源 GAL4 驱动品系 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP 的雄性果蝇进行杂交。 
	注意：67 和 15 分别代表插入第二 (II) 和第三 (III) 染色体的母源 Tubulin-GAL452。本实验方案所用的 GAL4 品系还表达带有 mCherry 标签的肌球蛋白调节轻链 Sqh（Spaghetti squash）37 以及带有 GFP 标签的 E-cadherin53。光遗传学品系的果蝇可能仍携带 FM7 和 TM6 平衡染色体。母源 GAL4 驱动品系的果蝇可能仍携带 CyO 和 TM3 平衡染色体。</li>
	<li>约 10 天后，选取具有以下基因型的 F1 代雌性果蝇：UASp-CIBNpm/+; 67 Sqh-mCherry/+; 15 E-cadherin-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry。将这些雌蝇与雄蝇一起设置卵收集杯。
	<ol>
		<li>确保所选 F1 代雌蝇不携带任何平衡染色体（即不应具有卷翅 [Cy]、短刚毛 [Sb]、棒状或肾形眼 [B] 或额外肩胛刚毛 [Hu] 等表型），这些表型分别是用于构建品系的 CyO、TM3、FM7 和 TM6 平衡染色体的标记。用表面涂抹少量新鲜酵母糊的苹果汁培养基覆盖收集杯。 
		注意：在 F1 雌蝇中，光遗传学元件由母源表达。因此，用于设置收集杯的 F1 雌蝇无需为处女蝇。为方便起见，建议使用来自同一 F1 群体的雄蝇进行配对。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将收集杯置于用铝箔包裹的纸箱中，以避免环境中任何可能的光线泄漏。在室温（约 21–23 °C）下保存的收集杯需每天更换一次苹果汁培养基，若在 18 °C 下保存则每两天更换一次。
	<ol>
		<li>更换培养基前，立即将收集杯轻敲于平坦表面（如实验台面），使果蝇停留在杯底，防止其逃逸。在暗室中更换苹果汁培养基，并使用红光头灯提供照明（参见 材料表）。 
		注意：为增强由母源 Tubulin-GAL4 和 UASp 驱动的构建体的表达水平，建议在收集胚胎前至少将收集杯在 18 °C 下维持 3 天。此孵育期也有助于果蝇适应收集杯环境，并通过摄食酵母糊充分营养，从而实现最佳产卵量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在目标时期收集胚胎并准备进行光遗传学刺激
注意：所有样品采集和制备步骤均需在暗室中进行，并使用&#34;安全光源&#34;（例如红光）照明。光遗传学组件对环境光极为敏感，即使轻微暴露于环境光也会导致样本过早激活。通常，绿色至红色波长范围（&#62;532 nm）的光不会引起非预期的激活。
<ol>
	<li>为收集早期胚胎发生阶段的胚胎，在收集胚胎前 8 至 16 小时（于 18 °C 条件下）将新的苹果汁培养基平板放置于培养杯上。</li>
	<li>在收集胚胎时，更换苹果汁培养基平板。标记从培养杯上取下的平板，并在其表面覆盖一层薄薄的卤碳油 27（见材料表）。等待 30–60 秒，使卵壳变得透明。</li>
	<li>将橙红色塑料遮光板（见材料表）放置在直立式体视显微镜的载物台上。该橙红色遮光板可阻挡透射光中的蓝绿色波长，从而防止样品照明过程中产生不必要的刺激。 
	注意：本实验方案中使用直立式体视显微镜进行胚胎收集（见材料表）。</li>
	<li>将苹果汁培养基平板置于橙红色遮光板上方。打开体视显微镜的透射光源以照亮样品。使用一对镊子从苹果汁培养基平板上收集 5–15 个处于合适发育阶段的胚胎。切勿用镊子挤压胚胎。 
	注意：本实验方案中，合适的胚胎应处于细胞化早期至中期。此阶段的胚胎应具有一个深色不透明的卵黄，周围环绕着一层清晰、均匀的周质层，其中包含正在形成的囊胚层细胞。分裂沟的前沿（&#34;细胞化前沿&#34;）表现为一条与胚胎表面平行的连续线条，且不应超过周质层深度的一半。</li>
	<li>使用镊子将胚胎轻轻在一张纸巾（约 1.5 cm × 1.5 cm）上轻压，以去除胚胎表面多余的油。</li>
	<li>使用塑料移液管将数滴新配制的 40% 次氯酸钠溶液（约 3% 次氯酸钠；见材料表）滴加到一张新的小方块纸巾（约 1.5 cm × 1.5 cm）上，使纸巾表面覆盖一层薄薄的漂白液。用镊子将胚胎从干燥的纸巾转移至浸有漂白液的纸巾上，并确保胚胎完全浸入漂白液中。等待 2–4 分钟，使胚胎完成去壳处理。</li>
	<li>去壳完成后，用镊子将浸有胚胎的小方块纸巾在一大张吸水纸上轻压，以去除多余的漂白液。确保带有胚胎的一面朝上。</li>
	<li>为清洗胚胎，使用镊子将小方块纸巾轻轻浸入一滴去离子水中，随后迅速在一大张吸水纸上轻压。重复此过程八次，以确保彻底去除残留的漂白液。</li>
	<li>使用睫毛工具将胚胎从纸巾转移至一个 35 mm 玻璃底培养皿（见材料表）中。向培养皿中加入去离子水，完全覆盖胚胎。使用睫毛工具微调胚胎的位置和方向。 
	注意：去壳后的胚胎容易粘附在玻璃表面，在无外界扰动的情况下保持静止，因此无需额外处理（如使用胶水）即可在玻璃底培养皿中固定胚胎。</li>
	<li>将装有胚胎的 35 mm 玻璃底培养皿放入一个避光的黑色盒子中（见材料表），以在转移过程中保护样品免受光照。将盒子转移至配备多光子显微镜的实验室内。</li>
</ol>
3. 胚胎的光遗传学刺激、激光消融和成像
注意：本实验所用的多光子系统（参见材料表）具备同时进行双波长成像的能力。系统还配备了一个光刺激单元，包含458 nm激光器和独立的检流计扫描仪，可在定义的兴趣区域（ROI）内实现光激活/刺激。值得注意的是，用于激发绿色-黄色荧光蛋白的920 nm激光器也可刺激Opto-Rho1DN，但其刺激效率较蓝光激光介导的刺激更慢。
<ol>
	<li>使用遮光黑布覆盖多光子显微镜（参见材料表），以避免在样品设置和成像过程中对胚胎产生不必要的刺激。 
	注意：在常规多光子成像过程中也采用相同方法，以保护显微镜上配备的对光敏感的探测器。</li>
	<li>关闭房间照明和计算机屏幕。在软件中点击“触摸面板控制器背光”下的关闭按钮，关闭触摸面板控制器。确保房间内无其他环境光源。
	<ol>
		<li>打开显微镜上遮光黑布的前侧。从黑色盒子中取出35 mm玻璃底培养皿，并将其放置在显微镜载物台上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用通常用于落射荧光激发的绿光&#160;照射&#160;胚胎。具体操作为：打开荧光照明单元，在软件的“目镜”面板中选择“目镜”模式，并将“滤光片转轮”切换至4:TRITC。通过目镜识别目标胚胎并将其调至清晰对焦。 
	注意：绿光可视化是通过让荧光照明单元产生的白光穿过内置的标准TRITC滤光片立方体实现的，该滤光片包含528–553 nm激发滤光片、565 nm二向色镜和590–650 nm发射滤光片。其他非蓝光也可用于样品照明。此步骤无需佩戴眼部防护，因为激发光强度较低且不会直接射向目镜。由于自发荧光，胚胎将呈现均匀的红色。</li>
	<li>盖上遮光黑布，使样品完全避光。打开计算机屏幕以访问控制显微镜的软件。在软件中将“目镜”模式更改为LSM，以进行图像采集。</li>
	<li>在对照组未受刺激的胚胎中使用25倍水浸物镜进行激光消融。
	<ol>
		<li>在软件的“工具窗口”中点击明亮Z、序列管理器和LSM刺激。将扫描类型设置为检流计，扫描尺寸设置为512 × 512。在“PMT设置”面板下打开CH1和CH3，以启用1,040 nm激光，并点击实时×4以观察胚胎。</li>
		<li>使用软件中的旋转功能旋转胚胎，使胚胎的前后轴垂直取向。将缩放倍数设置为3。在“扫描设置”下的形状工具中绘制感兴趣区域（ROI），并在“参考”面板中设置ROI大小。将ROI设为宽512像素、高100像素（171 × 33 µm2）。</li>
		<li>设置消融前Z栈的采集参数。
		<ol>
			<li>在“Z切片”中将胚胎表面注册为0。将起始位置设为0，结束位置设为100 µm。步长设为2 µm。在“序列”选项卡下勾选Z，以激活Z轴采集模式。</li>
			<li>使用明亮Z功能将1,040 nm激光强度从3%线性增加至7%。</li>
			<li>通过在“序列管理器”中点击LSM，将当前成像设置保存为流程中的第一个任务。 
			注意：获取消融前Z栈是为了确认胚胎的发育阶段。在本实验中，CRY2-Rho1DN-mCherry和Sqh-mCherry将被1,040 nm激光激发。在顶膜收缩过程中，腹侧中胚层细胞的中顶区域Sqh-mCherry信号增强，而CRY2-Rho1DN-mCherry在刺激前位于细胞质中。用于消融前和消融后成像的激光强度是根据信噪比最优化与避免光漂白之间的平衡经验确定的。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置消融前视频的采集参数。
		<ol>
			<li>删除任何&#160;已存在的ROI，以便对胚胎腹侧表面附近整个512 × 512像素区域（171 × 171 µm2，3倍缩放）进行成像，如步骤3.5.2所述。将1,040 nm激光强度设为3%。</li>
			<li>在“序列”面板下勾选时间，取消勾选Z。在“时间间隔”面板下保持“间隔”为自由运行。设置循环次数为10。</li>
			<li>通过在“序列管理器”中点击LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。 
			注意：此任务的目的是使用1,040 nm激光获取10帧单Z平面消融前视频用于图像采集。图像采集速度约为每帧1秒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置激光消融参数。
		<ol>
			<li>定义一个从卵黄膜正下方至约20 µm深度的三维区域用于激光消融（图1A）。将Z栈的起始平面设为卵黄膜正下方的平面，结束平面设为比起始平面深20 µm。步长设为1.5 µm。 
			注意：消融区域的ROI宽度约为30像素，高度约为10像素（沿中侧轴约10 µm，沿前后轴约3.3 µm）。在多个Z平面进行消融的目的是确保腹侧细胞的顶膜表面被完全消融。这对于受刺激的胚胎尤为重要，因为在Rho1抑制后腹侧细胞会迅速发生顶膜松弛。</li>
			<li>在“PMT设置”面板下打开CH2和CH4，以启用920 nm激光。将920 nm激光强度设为30%。在步骤3.5.5.1定义的三维区域内&#160;，使用920 nm激光对单个Z栈进行图像采集，用于激光消融。 
			注意：此步骤选择的激光强度足以消融组织（激光处理后立即出现组织回缩为标志），但同时不会明显损伤质膜（细胞膜上无灼伤痕迹为标志）（图1B,C）。</li>
			<li>通过在“序列管理器”中点击LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置消融后视频的采集参数。
		<ol>
			<li>使用1,040 nm和920 nm激光，对100帧单Z平面消融后视频进行图像采集。将1,040 nm激光和920 nm激光的强度分别设为3%和0.3%。将对步骤3.5.4中指定的区域以相同的图像采集速度进行成像。</li>
			<li>通过在“序列管理器”中点击LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。 
			注意：在实际采集前，将步骤3.5.3–3.5.6中描述的参数作为顺序任务存储在“序列管理器”中的目的是确保捕获激光消融后的即时组织反应。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在“采集”下选择序列。根据需要更改数据保存路径和文件名。点击准备，等待软件初始化流程。然后点击开始执行流程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在受刺激胚胎中进行激光消融。
	<ol>
		<li>按照步骤3.5.1–3.5.3所述设置消融前Z栈的采集参数。通过在“序列管理器”中点击LSM，将当前设置保存为流程中的第一个任务。</li>
		<li>在定义的ROI内设置光遗传刺激参数。
		<ol>
			<li>将缩放倍数改为1，选择覆盖胚胎腹侧表面的ROI（约512 × 300 µm2）。关闭CH1-CH4探测器。</li>
			<li>点击LSM刺激。在持续时间内取消勾选连续，并输入&#160;12 s。勾选458 nm激光，强度设为0.3%。</li>
			<li>通过在“序列管理器”中点击刺激，将当前设置保存为流程中的下一个任务。 
			注意：通过提高458 nm激光强度可实现更快的刺激。然而，当使用更高激光强度时，散射的激光可能刺激ROI邻近区域，若需要空间受限的刺激，则此情况不理想。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>刺激后设置3分钟等待时间，以确保肌球蛋白完全失活、顶膜F-肌动蛋白解聚，并在激光消融前达到稳定的组织形态。此操作可通过在“序列管理器”中点击等待/暂停并设置所需“等待”时间实现。 
		注意：单次刺激（0.3% 458 nm激光持续12秒）引起的CRY2-Rho1DN-mCherry向膜的募集在刺激后10–15分钟内可明显检测到，这与已发表的解离半衰期约9分钟相符47。</li>
		<li>按照步骤3.5.4所述设置单Z平面消融前视频的采集参数，但使用1,040 nm和920 nm激光进行图像采集。打开CH1-CH4探测器。将1,040 nm激光和920 nm激光的强度分别设为3%和0.3%。通过在“序列管理器”中点击LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。</li>
		<li>按照步骤3.5.5所述设置激光消融参数。通过在“序列管理器”中点击LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。</li>
		<li>按照步骤3.5.6所述设置单Z平面消融后视频的采集参数。通过在“序列管理器”中点击LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。</li>
		<li>在“采集”下选择序列。根据需要更改数据保存路径和文件名。点击准备，等待软件初始化流程。然后点击开始执行流程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 激光消融后组织回缩速率的定量分析
<ol>
	<li>在 ImageJ 中打开消融后视频。</li>
	<li>沿腹侧中线绘制一个小的感兴趣区域（ROI），覆盖消融区域，使用 矩形选择 工具。ROI的宽度为9像素。ROI的高度设置为足以覆盖激光消融后组织回缩的整个范围。
	<ol>
		<li>点击 重复 在“图像”选项卡下。在弹出窗口中，勾选 复制堆栈 然后点击 好的 在选定的 ROI 内复制该堆栈。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过复制的图像序列生成一个拼接图 图像 &#62; 堆叠 &#62; 制作蒙太奇图像. 在弹出窗口中，将行数设置为 1 以及列数与图像栈中总帧数的对应关系（100 在此情况下）。</li>
	<li>从生成的拼接图像中随时间测量消融区域的前后宽度。
	<ol>
		<li>使用 多点 使用 ImageJ 中的工具在时间序列拼接图上标记每个时间点消融区域的前后（A-P）边界。</li>
		<li>使用以下方法保存标记点的坐标 文件 &#62; 保存为 &#62; XY 坐标.</li>
		<li>将测量得到的XY坐标导入MATLAB。通过用下边界Y坐标减去上边界Y坐标，计算每个时间点消融区域的前后（A-P）宽度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过拟合前20秒的组织回缩数据来确定组织回缩速率 &#34;随时间变化的宽度&#34; 使用 MATLAB 中的 'polyfit' 函数将曲线拟合为直线。将拟合直线的斜率报告为组织回缩速率。</li>
	<li>对刺激样本与非刺激样本之间的组织回缩速率进行统计学检验。 
	注意：建议每种条件下至少获取五个胚胎的数据。可使用双侧 Wilcoxon 秩和检验或双侧学生 t 检验进行统计学比较。</li>
</ol>

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

本方案描述了结合光遗传学与激光消融技术，用于探测肌动球蛋白收缩力失活后组织张力的即时变化。此处所述的光遗传学工具利用Rho1的显性负性形式（Rho1DN），以急性抑制内源性Rho1及其依赖的肌动球蛋白收缩力。先前在果蝇（Drosophila）腹沟形成背景下对Opto-Rho1DN的研究表明，该工具可通过同时抑制肌球蛋白活性并促进肌动蛋白解聚，高效介导顶端肌动球蛋白收缩力的快速失活41。特别是，在顶端收缩发生时刺激胚胎，可在60秒内显著降低正在进行顶端收缩的细胞中顶端肌球蛋白信号强度41。Rho1抑制后皮层肌球蛋白的快速消失，可能是由于Rho1及其下游肌球蛋白轻链磷酸酶分别受到GTP酶激活蛋白（GAPs）调控，导致Rho1和肌球蛋白在活性与非活性状态之间快速循环所致19,54。与对肌动球蛋白影响一致的是，将光遗传学与激光消融相结合的研究显示，在顶端收缩期间激活Opto-Rho1DN会导致胚胎腹区上皮张力立即丧失...

肌动球蛋白收缩力是指非肌肉肌球蛋白II（下文简称“肌球蛋白”）作用于F-肌动蛋白网络所产生的收缩力，是调控细胞形态变化和驱动组织水平形态发生过程的最重要力量之一1,2。例如，上皮细胞顶区肌动球蛋白收缩力的激活会导致顶面收缩，从而促进多种形态发生过程，包括上皮折叠、细胞挤出、去层化以及伤口愈合3,4,5,6,7。肌球蛋白的激活需要其调节轻链的磷酸化修饰。该修饰可解除肌球蛋白分子的抑制性构象，使其能够形成两端均具有多个头部结构域的双极性肌球蛋白丝束。双极性肌球蛋白丝可驱动肌动蛋白丝的反向平行运动，从而产生收缩力1,8,9。
进化上保守的Rho家族&#160;小GTP酶RhoA（在Drosophila中为Rho1）&#160;在多种细胞环境中激活肌动球蛋白收缩性方面发挥核心作用10,11。Rho1作为一种双分子开关，可结合GTP（活性形式）或GDP（非活性形式）12。GTP或GDP结合态Rho1之间的循环由其GTP酶激活蛋白（GAPs）和鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）调控13。GEFs通过促进GDP与GTP的交换来激活Rho1活性；而GAPs则增强Rho1的GTP酶活性，从而使其失活。活化的Rho1通过与下游效应因子Rho相关激酶（Rok）和Diaphanous相互作用并激活它们，进而促进肌动球蛋白的收缩性14。Rok通过磷酸化肌球蛋白的调节轻链来诱导肌球蛋白活化和肌动球蛋白收缩15。此外，Rok还能抑制肌球蛋白调节轻链磷酸酶，从而进一步促进肌球蛋白丝的组装16。Rok还可磷酸化LIM激酶，后者在被激活后通过磷酸化并抑制肌动蛋白解聚因子cofilin，阻止肌动蛋白解聚17,18。Diaphanous属于formin家族的肌动蛋白成核因子，可促进肌动蛋白聚合，为肌球蛋白的结合提供基础19,20,21。
尽管激活肌动球蛋白收缩力的细胞机制已得到充分阐明，但其在调控动态组织重塑中的功能仍不完全清楚。填补这一知识空白需要能够快速在特定组织区域失活肌动球蛋白的实验方法。 体内 并记录对组织行为和特性的即时影响。本方案描述了利用光遗传学方法在急性抑制肌动球蛋白收缩力期间的应用。 果蝇 中胚层内陷，随后通过激光消融测量上皮张力。在 果蝇 原肠胚形成过程中，位于腹侧的中胚层前体细胞通过形成一条前后走向的沟槽，发生顶膜收缩并从胚胎表面内陷22,23腹沟的形成长期以来被用作研究上皮折叠机制的模型。腹沟形成由背腹模式形成系统调控 果蝇24,25,26,27位于胚胎腹侧的两种转录因子 Twist 和 Snail 的表达调控腹沟的形成，并决定中胚层细胞的命运28Twist 和 Snail 激活 Rho1 鸟苷酸交换因子 RhoGEF2 向中胚层前体细胞顶区的募集 通过 G蛋白偶联受体通路和RhoGEF2衔接蛋白T4829,30,31,32,33接着，RhoGEF2通过Rho-Rho激酶通路在潜在中胚层的整个顶面激活肌球蛋白34,35,36,37,38,39激活的肌球蛋白在整个中胚层原基的顶面形成一种跨细胞的肌动球蛋白网络，该网络的收缩作用驱动顶面收缩，并导致顶面组织张力迅速增加14,37,40.
本方案中描述的光遗传学工具 Opto-Rho1DN 通过蓝光依赖性的细胞质膜募集 Rho1 显性负性突变体（Rho1DN），从而抑制肌动蛋白-肌球蛋白收缩力41。Rho1DN 中的 T19N 突变消除了该突变蛋白将 GDP 交换为 GTP 的能力，使其持续处于失活状态34。Rho1DN 中的另一个突变 C189Y 消除了其天然的膜定位信号42,43。当 Rho1DN 被募集至细胞质膜时，它会结合并捕获 Rho1 鸟苷酸交换因子（GEFs），从而阻断 Rho1 的活化以及 Rho1 介导的肌球蛋白和肌动蛋白的活化34,44。Rho1DN 的细胞质膜募集是通过来源于隐花色素 2（Cryptochrome 2）及其结合伴侣 CIB1 的光依赖性二聚化模块实现的。隐花色素 2 是拟南芥（Arabidopsis thaliana）中一种蓝光激活的光感受器45。隐花色素 2 仅在其光激发状态下与碱性螺旋-环-螺旋蛋白 CIB1 结合45。后续研究发现，隐花色素 2 的保守 N 端光解酶同源区（PHR）（CRY2PHR，下文简称 CRY2）以及 CIB1 的 N 端结构域（氨基酸 1-170，下文简称 CIBN）对光诱导二聚化至关重要46。Opto-Rho1DN 包含两个组分：第一个组分是与 CAAX 锚定序列融合的 CIBN 蛋白，可将该蛋白定位于细胞质膜47；第二个组分是与 mCherry 标签融合的 CRY2 与 Rho1DN41。在无蓝光照射时，CRY2-Rho1DN 保留在细胞质中；而在蓝光刺激下，CRY2-Rho1DN 通过与膜锚定的 CIBN 与激发态 CRY2 之间的相互作用被靶向至细胞质膜。Opto-Rho1DN 可被长波紫外线（UVA）和蓝光（400–500 nm，峰值激活波长为 450–488 nm）激活，或在进行双光子刺激时由 830–980 nm 脉冲激光激活41,46,47,48。因此，Opto-Rho1DN 可被通常用于激发绿色荧光蛋白（GFP）的波长所激活（单光子成像使用 488 nm，双光子成像使用 920 nm）。相比之下，常用于激发 mCherry 的波长（单光子成像使用 561 nm，双光子成像使用 1,040 nm）不会激活该光遗传模块，因此可用于刺激前的成像。本方案描述了在样本操作过程中尽量减少非预期激活风险的方法。
激光消融已被广泛用于检测和测量细胞及组织中的张力49。先前的研究表明，当激光强度得到适当控制时，使用飞秒近红外激光的双光子激光消融可在不引起质膜破裂的情况下，物理性损伤某些亚细胞结构（例如皮层肌动球蛋白网络）50,51。如果组织处于张力状态，对组织内特定区域进行激光消融将导致邻近消融区域的细胞立即向外回缩。回缩速度取决于张力的大小以及发生回缩结构周围介质（细胞质）的黏度49。由于近红外激光具有优异的穿透深度，并且能够实现高度局限的焦点消融，双光子激光消融特别适用于在活体（in vivo）条件下检测组织张力。如本实验方案所示，该方法可轻松结合Opto-Rho1DN介导的肌动球蛋白收缩力失活，以研究Rho1依赖性细胞收缩力在动态组织重塑过程中对组织力学的直接影响。

<table><tbody><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>用于样品制备</td></tr><tr><td>60 mm &amp;times; 15 mm 带盖培养皿</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td>用于样品制备</td></tr><tr><td>用于遮盖显微镜的黑色布料</td><td>Online</td><td>NA</td><td>用于避免不必要的光照刺激</td></tr><tr><td>Clorox Ultra Germicidal 漂白剂（8.25% 次氯酸钠）</td><td>VWR</td><td>10028-048</td><td>用于胚胎去壳</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 垫片</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>用于杂交设置</td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于样品制备</td></tr><tr><td>Dumont 5 号镊子</td><td>VWR</td><td>102091-654</td><td>用于样品制备</td></tr><tr><td>睫毛工具（由纯红色貂毛圆头画笔 #2 制成）</td><td>VWR</td><td>22940-834</td><td>用于样品制备</td></tr><tr><td>FluoView（软件）</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>用于图像采集和光遗传学刺激</td></tr><tr><td>Halocarbon 油 27</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td>用于胚胎发育阶段的观察</td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>用于图像分析</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>NA</td><td>用于图像分析</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-745 体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>用于样品制备</td></tr><tr><td>Olympus FVMPE-RS 多光子显微镜，配备 InSight DS 双线超快激光器，用于同时进行双波长多光子成像，配备 25x/NA1.05 水浸物镜（XLPLN25XWMP2）以及用于光激活/刺激的红外/可见光刺激单元。该系统还配备 TRITC 滤光片（39005-BX3；AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M）和发出白光的荧光照明单元。</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>用于图像采集和光遗传学刺激</td></tr><tr><td>SP Bel-Art 100 孔聚丙烯冷冻储存盒（黑色避光盒，用于样品转移）</td><td>VWR</td><td>30621-392</td><td>用于避免不必要的光照刺激</td></tr><tr><td>FM1403 Fluores 紫外滤光罩（橙红色塑料罩）</td><td>Bolioptics</td><td>FM14036151</td><td>用于避免不必要的光照刺激</td></tr><tr><td>VITCHELO V800 头灯，带白色和红色 LED 灯</td><td>Amazon</td><td>NA</td><td>用于避免不必要的光照刺激</td></tr></tbody></table>

光遗传学抑制rho1介导的肌动球蛋白收缩力并结合上皮张力测量 黑腹果蝇 胚胎

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

由肌动蛋白和非肌肉肌球蛋白II（“肌动蛋白-肌球蛋白收缩性”）产生的收缩力在多个尺度上对细胞和组织的形态变化至关重要，例如细胞分裂、细胞迁移、上皮折叠以及分支形态发生。要深入理解肌动蛋白-肌球蛋白收缩性在形态发生中的作用，需要能够快速失活该收缩力的技术手段，而传统的遗传学或药理学方法难以实现这一目标。本方案展示了利用基于CRY2-CIBN的光遗传二聚化系统Opto-Rho1DN来抑制肌动蛋白-肌球蛋白收缩性的方法 果蝇 通过精确的时间和空间控制在胚胎中实现操作。在该系统中，CRY2 与 Rho1 的显性负性形式（Rho1DN）融合，而 CIBN 被锚定在质膜上。蓝光介导的 CRY2 与 CIBN 二聚化导致 Rho1DN 从细胞质快速转位至质膜，在此处通过抑制内源性 Rho1 使肌动球蛋白失活。此外，本文还提供了一项详细方案，介绍如何将 Opto-Rho1DN 介导的肌动球蛋白失活与激光消融技术相结合，以研究肌动球蛋白在上皮张力生成过程中的作用 果蝇 腹沟形成。该方案可应用于许多其他涉及肌动球蛋白收缩性的形态发生过程 果蝇 经过 minimal modifications 的胚胎。总体而言，这种光遗传学工具是解析肌动球蛋白收缩性在动态组织重塑过程中调控组织力学功能的有力方法。

在未受刺激且正在进行顶端收缩的胚胎中，Sqh-mCherry 在腹侧中胚层细胞的中顶端区域富集，而 CRY2-Rho1DN-mCherry 则位于细胞质中（图 1A）。在收缩区域内进行激光消融导致组织沿前后轴（A-P轴）迅速回缩（图 1B、C）。在受刺激的胚胎中，CRY2-Rho1DN-mCherry 信号定位于质膜，而 Sqh-mCherry 的中顶端信号则完全消失（图 1A）。在受刺激胚胎中进行激光消融未引起明显的组织回缩，如 图 1B、C 所示，并在 图 1D 中进行了量化。这些结果表明，组织张力的产生依赖于顶端肌动球蛋白的主动收缩力；当 Rho1 被抑制导致肌动球蛋白失活时，顶端组织张力也随之减弱41。这些观察结果与先前...

肌球蛋白收缩力在细胞和组织形态发生中起着重要作用。然而，调控肌动球蛋白收缩力具有挑战性 体内 急性地。本方案描述了一种光遗传学系统，可快速抑制由 Rho1 介导的肌动球蛋白收缩力 果蝇 胚胎，揭示肌动球蛋白失活后上皮张力的立即丧失 体内.

光遗传学抑制Rho1介导的肌动球蛋白收缩力并结合上皮张力测量 黑腹果蝇 胚胎

由肌动蛋白和非肌肉肌球蛋白II（“肌动蛋白-肌球蛋白收缩力”）产生的收缩力对于细胞和组织的形态变化至关重要，涉及……

我们的研究聚焦于组织形态发生，即发育过程中复杂三维组织结构的形成。我们关注调控形态发生的基因与分子，并致力于理解形态发生的物理机制，例如机械力的产生方式及其如何驱动组织重塑。由丝状肌动蛋白和非肌球蛋白II（也称为肌动蛋白-肌球蛋白收缩性）产生的收缩力，是驱动组织形态发生的最重要力量之一。当前研究探讨了肌动球蛋白收缩性如何介导血液上皮细胞层的折叠，这是发育过程中一种基本的组织构建机制。要深入理解肌动球蛋白收缩性在上皮折叠中的作用及其与遗传过程的关系，需要采用能够快速、在特定时间和空间范围内失活肌动球蛋白，并记录其对组织行为和特性即时影响的研究方法。然而，使用传统的遗传学方法难以实现这一目标。本方案所述方法旨在研究细胞和组织如何响应通常驱动组织重塑的机械力的突然变化。这是一个重要的科学问题，但由于目前缺乏能够快速改变机械力或完整组织的方法，该问题一直难以解决。在本研究中，我们开发了一种光遗传学工具，可在果蝇胚胎的特定组织区域快速失活肌动球蛋白。我们发现，他们将这两种技术与激光消融相结合，以研究肌动球蛋白收缩性对上皮折叠过程中组织力学的直接影响。我们的研究结果为上皮折叠的力学机制提供了新的见解，并揭示了一种新的收缩介质。通过适当修改，该方案可轻松适用于研究肌动球蛋白收缩性在多种形态发生过程中的功能。开始收集黑腹果蝇（Drosophila）胚胎时，将杯子上的苹果汁培养基更换为培养皿，并对培养皿进行标记。在培养皿表面覆盖一层薄薄的卤代烷油 27。接着，将一块橙红色塑料遮光板放置在正置体视显微镜的载物台上。将苹果汁培养皿放置在橙红色遮光板上。打开体视显微镜的透射光源以照亮样品。使用一对镊子从苹果汁培养皿中收集5到15个胚胎。用尺寸约为 1.5 × 1.5 厘米的纸巾轻轻吸干胚胎。然后使用塑料移液管将数滴新配制的 40% 次氯酸钠溶液滴加到一张新的纸巾上，使其表面覆盖一层薄薄的漂白液。将胚胎从干燥的纸巾转移至浸有漂白液的纸巾上，并确保胚胎完全浸入漂白液中。等待两分钟，使胚胎完成去壳。去壳后，用镊子夹取胚胎并在一张较大的纸巾上轻压，以去除多余的漂白液。用去离子水冲洗胚胎八次，以彻底清除残留的漂白液。使用睫毛工具将胚胎从纸巾转移至35毫米玻璃底培养皿中，然后向培养皿中加入去离子水，完全覆盖胚胎。最后，使用睫毛工具微调胚胎的位置和方向。将盛有胚胎的培养皿放入避光黑盒中，以在转移过程中保护样品免受光照。首先，关闭房间内的照明灯。在 FlowView 软件的目镜面板中选择“ocular”。将滤光片转轮切换至 4TRTC 位置，然后在软件中点击触摸面板控制器背光的“off”按钮以关闭触摸面板控制器，最后关闭计算机屏幕。打开显微镜上黑色布罩的前侧。从黑色盒子中取出装有胚胎的35毫米玻璃底培养皿，放置在显微镜载物台上。然后打开荧光照明装置，通过目镜识别目标胚胎。调整至清晰对焦。关闭黑色布罩以保护样品免受光照。打开计算机屏幕，以访问控制显微镜的软件。在软件中将目镜切换至LSM以进行图像采集。使用25倍水浸物镜对未受刺激的对照胚胎进行激光消融。在工具窗口中依次点击Bright Z、序列管理器和LSM刺激选项。将扫描仪类型设置为振镜式，扫描尺寸设置为 512 × 512。在 PMT 设置面板中打开通道一和通道三，以启用 1040 纳米激光器，并点击“实时”四倍速以观察胚胎。使用旋转功能调整胚胎，使其前后轴呈垂直方向，并将缩放倍数设置为 3。使用扫描设置下的形状工具绘制感兴趣区域（ROI），并在参考面板中设置 ROI 的大小。接着，将 ROI 设置为宽度 512 像素、高度 100 像素。为了设置消融前 Z 层叠的采集参数，需在 Z 切片中将胚胎表面注册为零。将起始位置设为0，终止位置设为100微米。将步长设为2微米，并在序列选项卡下勾选Z，以激活Z轴采集模式。使用Bright Z功能，将1040纳米激光强度设置为从3%线性增加至7%。在序列管理器中点击LSM，将当前成像设置保存为流程的第一项任务。为设置消融前录像的采集参数，需在胚胎腹侧表面附近设置一个 512×512 像素的感兴趣区域（ROI），方法如前所述。将 1014 纳米激光强度设为 3%，并在序列面板中取消勾选 Z。在延时成像面板中，将采集模式保持为自由运行（free run），循环次数设为 10。通过依次点击序列管理器中的 LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。为设置激光消融参数，需在卵膜正下方定义一个三维区域。将 Z 轴堆栈的起始位置设为该平面，终止位置设为比该平面深 20 微米处。将步进尺寸设置为 1.5 微米。在 PMT 设置面板中打开通道二和通道四，以启用 920 纳米激光器。将激光强度设置为 30%，并在定义的三维区域内，使用激光对单个 Z 层叠进行图像采集。通过在序列管理器中点击LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。为设置消融后录像的采集参数，使用1040和920纳米激光，对消融后100帧的单Z平面图像进行采集设置。将激光强度分别设置为3%和0.3%。通过在序列管理器中点击LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。在“采集”下选择序列。根据需要更改数据保存路径和文件名。单击“准备”，等待软件初始化流程，然后单击“开始”以执行流程。对刺激后的胚胎进行激光消融时，按照未刺激胚胎的操作方法设置消融前Z轴扫描的采集参数。在序列管理器中点击LSM，将当前设置保存为流程中的第一个任务。若需在特定ROI内设置光遗传学刺激参数，请将缩放倍数调整为1，并选择覆盖胚胎腹侧表面的ROI区域。关闭通道一至通道四的检测器，点击 LSM 刺激，取消勾选“持续时间内连续”，并输入 12 秒。通过在序列管理器中点击刺激，将当前设置保存为流程的下一个任务。在刺激后设置三分钟的等待时间，以确保肌球蛋白完全失活和顶端 F-肌动蛋白解聚，并在激光消融前获得稳定的组织形态。接下来，为单个Z平面的消融前成像设置采集参数，操作方法与未刺激胚胎的设置相同，但图像采集时使用1040纳米和920纳米激光。打开通道一至通道四的探测器。将激光强度分别设置为3%和0.3%。在序列管理器中点击LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。按照未刺激胚胎的操作方法设置激光消融参数。在序列管理器中点击LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。按照未刺激胚胎的操作方法，为消融后单Z平面时间序列成像设置采集参数。通过依次点击序列管理器中的 LSM，将当前设置保存为流程中的下一个任务。在采集下选择序列。根据需要更改数据保存路径和文件名。单击“准备”并等待软件初始化流程，然后单击“开始”以执行流程。在未受刺激而发生顶膜收缩的胚胎中，spaghetti squash mCherry 蛋白富集于顶面中央区域，而 CRY2 row one 显性负性 mCherry 则位于细胞质中。在受刺激的胚胎中，CRY2 row one 显性负性 mCherry 信号转而定位于质膜，而 spaghetti squash mCherry 的顶面中央信号则完全消失。对未受刺激胚胎的缩窄区域进行激光消融，导致沿前后轴方向的组织快速回缩；而对受刺激胚胎进行激光消融则未引起明显的组织回缩。此处展示了消融的量化结果。

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发育生物学

Rho1介导的肌动肌蛋白收缩力的光遗传学抑制与 果蝇 胚胎上皮张力的测量

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利用无微珠光镊技术探测细胞力学特性 果蝇 胚胎

在此，我们描述了一种使用收缩力测定法 果蝇 S2R+ 细胞。外源性配体折叠胃形成蛋白（folded gastrulation, Fog）的应用可激活 Fog 信号通路并诱导细胞收缩力。该实验可用于研究 Fog...

一种基于细胞的检测非肌球蛋白II收缩力的实验方法 通过 折叠原肠形成信号通路 果蝇 S2R+ 细胞

本方案提供了一种基于Fiji的、用户友好的方法，并附有简明的说明，解释如何可靠地分析单个细胞和弯曲上皮组织中的肌动球蛋白行为。遵循本教程无需编程技能；所有步骤均通过Fiji的图形用户界面及其相关插件以半交互方式进行。...

利用培养细胞延时成像分析局部细胞与组织尺度下的肌动球蛋白动力学 黑腹果蝇 卵室

本文介绍了一种以非侵入性且注重细节的方式记录黑腹果蝇（Drosophila）胚胎肌肉收缩的方法。...

活体成像与肌肉收缩的分析 果蝇 胚胎

本实验方案的目的是将罗丹明标记的球状肌动蛋白注射到Drosophila胚胎中，并在热应激后观察细胞核内肌动蛋白棒状结构的组装过程。...

活细胞热应激下核内肌动蛋白杆状结构的成像 果蝇 胚胎

本文描述了一种建立共培养体系的方案，该体系包含由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的神经元、原代皮层神经元以及星形胶质细胞。该共培养系统可用于检测新生成的、由iPSCs衍生的神经元与已存在的表达光敏通道蛋白-2（channelrhodopsin-2）的皮层神经元之间突触连接和神经回路的形成。...

一种用于评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法

为了研究鸟类胚胎发育后期卵黄囊膜中脂质利用的机制，我们建立了一种日本鹌鹑胚胎内胚层上皮细胞的原代培养体系。...

日本鹌鹑胚胎卵黄囊膜原代内胚层上皮细胞培养

我们描述了一种多靶点显色整体原位杂交 原位 杂交（MC-WISH）过程在完整样本中 果蝇...

多靶标显色整体原位杂交 原位 杂交法用于比较基因表达区域 果蝇 胚胎

一种改良的倍性操作方案利用热激在早期胚胎的胞质分裂过程中诱导一个细胞周期的停滞。该方案以斑马鱼为例进行演示，但可能适用于其他物种。...

通过热休克2处理对斑马鱼胚胎进行倍性操作

了解利用光遗传学技术抑制果蝇胚胎中Rho1介导的肌动肌蛋白收缩力的方法，并测量上皮张力的变化。该技术为发育生物学研究提供了精确调控组织力学的新工具。

光遗传学抑制Rho1介导的肌动球蛋白收缩力并结合上皮张力测量黑腹果蝇胚胎

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