Name: DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测方法，用于研究DNA损伤修复机制。该方案通过细胞培养、DNA分离和蛋白质印迹技术，帮助科研人员深入分析泛素化、SUMO化等修饰动态。

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本工作部分得到了美国国家癌症研究所癌症研究中心博士后研究卓越转型奖的支持。

1. 人胚胎肾293（HEK293）细胞系的细胞培养与药物处理
<ol>
	<li>准备培养基，即添加了10%胎牛血清、1% 2 mM L-谷氨酰胺和100单位/mL青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
	<li>每种处理条件及对照组，在60 mm培养皿或6孔板中接种1 × 106个细胞。</li>
	<li>次日，用选定的DPC诱导剂处理细胞。
	<ol>
		<li>为诱导TOP1-DPC及其泛素化和SUMO化，向细胞中加入20 µM的TOP1抑制剂喜树碱，并在处理后20、60和180分钟收集细胞。</li>
		<li>为诱导TOP2α和β-DPC及其泛素化和SUMO化，向细胞中加入200 µM的TOP2抑制剂依托泊苷，并在处理后20、60和180分钟收集细胞。</li>
		<li>为诱导非酶促DPC及其泛素化和SUMO化，加入1 mM的甲醛（FA），并在暴露2小时后收集细胞。</li>
		<li>为诱导TOP1-DPC的PAR化，先用10 µM的聚（ADP-核糖）糖水解酶（PARG）抑制剂PDD00017273预处理细胞1小时以阻断去PAR化，随后与20 µM喜树碱共处理20、60和180分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 含交联蛋白质的DNA的分离与归一化
<ol>
	<li>处理后立即使用吸液枪吸除培养基，并用预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞。随即在600 µL DNAzol试剂中裂解细胞，该试剂含有1×蛋白酶抑制剂混合物、1 mM二硫苏糖醇（DTT）和20 mM N-乙基马来酰亚胺（去SUMO化和去泛素化酶的抑制剂）。</li>
	<li>将培养板置于振荡平台上，4 °C缓慢振荡10分钟。</li>
	<li>向培养板中直接加入等体积（0.3 mL）的预冷100%乙醇，重复步骤2.2，直至出现不透明的核酸沉淀物。将细胞裂解液转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C以最大转速（20,000 × g）离心15分钟，以沉淀核酸及其交联的蛋白质。</li>
	<li>用吸液枪吸除上清液，用1 mL 75%乙醇洗涤核酸沉淀，随后在4 °C以20,000 × g离心2分钟。</li>
	<li>吸除上清液，以相同转速短暂离心，用P20移液器吸除残留液体，将沉淀在空气中干燥5分钟。</li>
	<li>迅速将核酸沉淀溶解于0.1 mL ddH2O中，通过反复吹打重悬沉淀，然后置于37 °C水浴中孵育，直至沉淀膨胀至原体积的三倍以上（约30分钟）。</li>
	<li>使用超声波处理器探头以30%振幅超声处理样品10秒，以彻底溶解沉淀。</li>
	<li>可选步骤：用RNase A/T1混合液（含10 µg RNase A和25 U RNase T1）处理样品，在37 °C孵育15分钟。向管中加入1/10体积的3 M醋酸钠和两倍体积的预冷100%乙醇，随后在20,000 × g离心10分钟以回收DNA。弃去上清液，将沉淀的DNA溶解于0.1 mL ddH2O中。</li>
	<li>可选步骤：在20,000 × g下离心样品5分钟，将上清液转移至新管中。</li>
	<li>使用紫外-可见光（UV-Vis）分光光度计测定DNA浓度。典型的DNA得率约为600–800 ng/µL。去除RNA后，A260/A280比值应从2.0–2.1降低至1.8–1.9。</li>
	<li>将DNA浓度调整为400–500 ng/µL，溶于0.12 mL ddH2O中。取20 µL样品转移至新的微量离心管中作为未消化DNA上样对照（参见步骤2.4）。</li>
	<li>对剩余100 µL ddH2O中溶解的DNA进行消化，向样品中加入2,000凝胶单位的微球菌核酸酶及1/10体积（约11 µL）的10×钙依赖性微球菌核酸酶反应缓冲液，在37 °C孵育30分钟。</li>
</ol>
3. 消化后DNA样本的蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>加入4倍体积的Laemmli上样缓冲液，然后将样品在沸水浴中加热5分钟。</li>
	<li>将约5–6 µg的消化后样品（约15 µL）上样至4%–20%聚丙烯酰胺凝胶，随后进行SDS-PAGE42，以分离未修饰及发生翻译后修饰（PTM）共价交联的DNA-蛋白质复合物（DPC）。</li>
	<li>为检测甲醛（FA）诱导的非酶促DPC种类，将凝胶在室温下用考马斯亮蓝染色液孵育过夜。用ddH2O洗涤凝胶2小时，并使用成像系统获取图像。</li>
	<li>将凝胶中的蛋白质转印至膜上，并在4 °C下用封闭缓冲液按适当比例稀释的一抗溶液孵育膜过夜。
	<ol>
		<li>为检测泛素化修饰，将抗泛素抗体按1:100比例稀释。</li>
		<li>为检测SUMO-1或SUMO-2/3修饰，将抗SUMO-1或抗SUMO-2/3抗体按1:250比例稀释。</li>
		<li>为检测ADP-核糖基化修饰，将抗PAR抗体按1:500比例稀释。</li>
		<li>为检测总TOP1、TOP2α或TOP2β-DPC，将抗TOP1、抗TOP2α或抗TOP2β抗体按1:500比例稀释。 
		注：有关抗体稀释的具体信息，请参见材料表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将膜用1× PBS-T（含0.1% Tween 20）洗涤后，在室温下用封闭缓冲液按5,000倍稀释的二抗溶液孵育60分钟。</li>
	<li>使用增强型化学发光（ECL）试剂显色，并利用成像系统获取图像。</li>
</ol>
4. 未消化DNA样品的槽点印迹
<ol>
	<li>将20 µL未消化的DNA样品加入180 µL磷酸钠缓冲液（25 mM，pH 6.6）中稀释。</li>
	<li>裁剪硝酸纤维素膜（0.45 µm），并在磷酸钠缓冲液中平衡5分钟。</li>
	<li>根据制造商说明组装点印迹装置，并将其连接至真空系统。</li>
	<li>通过施加真空用磷酸钠缓冲液清洗各孔，确保各孔无泄漏。</li>
	<li>关闭真空，每份样品加入200 µL DNA（1 µg），空孔中加入200 µL磷酸钠缓冲液。</li>
	<li>施加真空。</li>
	<li>当所有孔完全排空后，关闭真空，每孔加入200 µL磷酸钠缓冲液，重复步骤4.6。</li>
	<li>取出膜，用5%封闭缓冲液在室温下封闭0.5小时。</li>
	<li>加入抗双链DNA（dsDNA）抗体，按1:5,000稀释，4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用1× PBS-T洗涤3次，加入按1:5,000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠二抗孵育。</li>
	<li>使用增强型化学发光（ECL）试剂显影，并用成像系统采集图像。</li>
</ol>
5. 密度测定分析
<ol>
	<li>使用 ImageJ，计算每条条带/弥散信号的强度与未消化 DNA 加样孔强度的比值，并将该比值相对于未加/处理前药物的细胞进行归一化。</li>
</ol>

Measuring Ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Klages-Mundt, N. L., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+repair+of+DNA-protein+crosslink+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China.+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Formation and repair of DNA-protein crosslink damage.</a> Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).</li>
<li>Weickert, P., Stingele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+crosslinks+and+their+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA-protein crosslinks and their resolution.</a> Annual Review of Biochemistry. 91, 157-181 (2022).</li>
<li>Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Protein+cross-links%3A+formation%2C+structural+identities%2C+and+biological+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes.</a> Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).</li>
<li>Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+topoisomerases+and+their+roles+in+genome+stability+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).</li>
<li>Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+eukaryotic+topoisomerases+in+transcription%2C+replication+and+genomic+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).</li>
<li>Ruggiano, A., Ramadan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+crosslink+proteases+in+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA-protein crosslink proteases in genome stability.</a> Communications Biology. 4 (1), 11(2021).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
<li>Moretton, A., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+cellular+metabolism+and+the+DNA+damage+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer.</a> Cancers. 12 (8), 2051(2020).</li>
<li>Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-dependent+protease+involved+in+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair.</a> Cell. 158 (2), 327-338 (2014).</li>
<li>Maskey, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spartan+deficiency+causes+accumulation+of+topoisomerase+1+cleavage+complexes+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).</li>
<li>Stingele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+DNA-protein+crosslink+repair+by+the+DNA-dependent+metalloprotease+SPRTN%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN.</a> Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).</li>
<li>Vaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloprotease+SPRTN%2FDVC1+orchestrates+replication-coupled+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair.</a> Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).</li>
<li>Lopez-Mosqueda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPRTN+is+a+mammalian+DNA-binding+metalloprotease+that+resolves+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks.</a> eLife. 5, e21491(2016).</li>
<li>Kojima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAM111A+protects+replication+forks+from+protein+obstacles+via+its+trypsin-like+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain.</a> Nature Communications. 11 (1), 1318(2020).</li>
<li>Dokshin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCNA+interacts+with+spartan+and+topoisomerase+II+to+regulate+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability.</a> Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).</li>
<li>Borgermann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+promotes+protective+responses+to+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks.</a> The EMBO Journal. 38 (8), e101496(2019).</li>
<li>Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK7+inhibition+synergizes+with+topoisomerase+I+inhibition+in+small+cell+lung+cancer+cells+by+inducing+ubiquitin-mediated+proteolysis+of+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+MRN+endonuclease+processing+of+topoisomerase+II-mediated+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064(2022).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARylation+prevents+the+proteasomal+degradation+of+topoisomerase+I+DNA-protein+crosslinks+and+induces+their+deubiquitylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation.</a> Nature Communications. 12 (1), 5010(2021).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+repair+of+topoisomerase+DNA-protein+crosslinks+%28TOP-DPC%29%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC).</a> DNA Repair. 89, 102837(2020).</li>
<li>Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debulking+of+topoisomerase+DNA-protein+crosslinks+%28TOP-DPC%29+by+the+proteasome%2C+non-proteasomal+and+non-proteolytic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways.</a> DNA Repair. 94, 102926(2020).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+SUMO+pathway+repairs+topoisomerase+DNA-protein+cross-links+by+engaging+ubiquitin-mediated+proteasomal+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation.</a> Science Advances. 6 (46), (2020).</li>
<li>Saha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+cleavage+complexes+and+repair+pathway+for+TOP3B+RNA-+and+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks.</a> Cell Reports. 33 (13), 108569(2020).</li>
<li>Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+repair+stalled+topoisomerase+II-DNA+covalent+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes.</a> Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).</li>
<li>Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibitors+confirm+ubiquitin-dependent+removal+of+TOP2-DNA+covalent+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes.</a> Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).</li>
<li>Sciascia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressing+proteasome+mediated+processing+of+topoisomerase+II+DNA-protein+complexes+preserves+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity.</a> eLife. 9, e53447(2020).</li>
<li>Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+topoisomerase+covalent+complexes+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).</li>
<li>Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICE+bioassay.+Isolating+in+vivo+complexes+of+enzyme+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA.</a> Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).</li>
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<li>Kiianitsa, K., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+assay+for+DNA-protein+covalent+complexes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), e104(2013).</li>
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<li>Leng, X., Duxin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA-protein+crosslinks+via+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775(2022).</li>
<li>Kuhbacher, U., Duxin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+fix+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">How to fix DNA-protein crosslinks.</a> DNA Repair. 94, 102924(2020).</li>
<li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 563-573 (2017).</li>
<li>Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+A+Swiss+army+knife+for+eukaryotic+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161(2022).</li>
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</ol>

作者声明无竞争利益。

该方法可用于检测哺乳动物细胞中的酶促和非酶促DNA-蛋白质交联（DPC），并且是研究其泛素化、SUMO化以及ADP-核糖基化的唯一合适方法。在ICE或RADAR检测之后进行槽印迹（slot-blotting），可利用特异性抗体快速检测特定的酶促DPC（如TOP-DPC）。然而，该方法的一个局限性在于无法按分子量大小分离蛋白质，因此不能确定发生翻译后修饰（PTM）的DPC的分子大小。本文所述方法通过使用微球菌核酸酶释放交联的蛋白质，解决了这一问题；该酶可将DNA降解为带有3'-磷酸末端的寡核苷酸片段，从而使与寡核苷酸共价连接的蛋白质能够在SDS-PAGE中实现完全分离。因此，可通过针对泛素、SUMO或不同大小的ADP-核糖单体及多聚体的抗体，对这些翻译后修饰的DPC进行可视化和定量分析，进而深入研究其形成过程及动力学特征。为确保实验的可重复性并进行统计学显著性分析，必须设置生物学重复实验。
该实验最常见的问题之一是乙醇沉淀后DNA得率较低。一方面，可通过增加起始材料（细胞）的用量来提高DNA产量；另一方面，将细胞裂解液在平底培养板中而非离心管（Eppendorf管）中与乙醇孵育，可显著促进DNA分子的聚集，从而更利于其沉淀。未进行药物处理的样本中若出现非特异性信号，可能提示存在非共价结合的蛋白质污染。若存在此情况，可在超声处理前用高盐缓冲液洗涤DNA沉淀以去除污染物。此外，建议在超声处理和微球菌核酸酶消化后对DNA样本进行离心，并弃去任何不溶物。当信号微弱或无信号时，可尝试多种潜在解决方案。首先，可增加用于SDS-PAGE和免疫印迹的DNA上样量。为使SUMO化和泛素化DNA-蛋白质交联（DPC）产物可被检测到，建议至少上样4 µg DNA。其次，可提高药物浓度以诱导更高水平的DPC及其相关翻译后修饰（PTMs）。第三，若条带或弥散信号较弱，建议将印迹膜与一抗再孵育一天；延长至两天的孵育可显著增强信号，从而降低独立实验间的生物学变异23。膜的剥离再染色不可避免地会导致本就丰度较低的PTM修饰DPC物种部分丢失。因此，强烈建议分别运行不同的凝胶用于泛素和SUMO的检测，而不是在同一张印迹膜上重复探针检测。此外，DNA沉淀必须用75%乙醇洗涤，以去除残留的含盐胍盐的DNAzol，否则在加入Laemmli上样缓冲液后会导致样品结晶。
与繁琐的ICE实验相比，所述方法的工作流程在时间效率上显著提高，因为它依赖快速的乙醇沉淀法而非耗时的氯化铯超速离心法来分离基因组DNA。然而，基于乙醇的纯化方法会引入少量蛋白质污染物，尽管这些污染物在免疫检测中通常可忽略不计。但在需要高准确性和精确度的分析研究中，例如基于质谱的蛋白质组学分析或下一代测序，氯化铯密度梯度离心法仍是分离高纯度、高丰度DNA的更可靠方法。该方法还可结合适当的基于质谱的分析技术，用于分析交联蛋白质上的修饰位点，以及确定多聚泛素化和多聚SUMO化修饰的连接类型。
值得注意的是，该检测方法可用于鉴定和表征调控DPC修复相关翻译后修饰（PTMs）的因子。例如，无偏倚的高通量筛选方法（如RNA干扰和CRISPR）是发现能够缓解DPC诱导剂细胞毒性的泛素E3连接酶、SUMO E3连接酶及其相关辅助因子的有力工具。本方法可通过检测这些蛋白是否通过修复DPC帮助细胞耐受DPC诱导剂，从而在分子水平上验证其功能。此外，针对这些蛋白新发现的小分子抑制剂（例如通过虚拟筛选获得）也可利用本方案进行验证。鉴于拓扑异构酶抑制剂是临床上最常用的化疗药物之一，该稳定可靠的检测方法有望被开发为用于研发与临床拓扑异构酶抑制剂具有协同作用药物的工具。

基因组DNA损伤可由自发衰变、内部损伤以及环境因素引起1。由此产生的DNA损伤包括受损碱基、错配、单链和双链断裂、链间与链内交联，以及DNA-蛋白质交联（DPCs）。当染色质结合蛋白通过共价连接被固定在DNA上时，即形成DPC。DPC可由内源性DNA损伤和活性代谢产物，以及外源性物质（如化疗药物和双功能交联剂）诱导产生。在某些情况下，酶功能障碍也可导致DPC的形成2。DPC诱导因素的广泛差异，导致了共价结合蛋白的种类、DPC形成所在的染色体区域、与蛋白质交联的DNA结构类型，以及蛋白质与DNA之间共价连接的化学性质均存在差异2,3,4。
根据其化学性质，DNA-蛋白质交联物（DPCs）通常分为两类：酶促DPCs和非酶促DPCs。某些酶（如拓扑异构酶、糖基化酶以及甲基/酰基转移酶）在正常催化反应过程中会形成可逆的酶-DNA共价中间体。这些酶-DNA中间体寿命较短，但可被内源性或外源性试剂（尤其是化疗药物）捕获，从而转化为长寿命的酶促DPCs3。在真核细胞中，拓扑异构酶相关的DPCs是最常见的酶促DPCs之一，临床上有效的拓扑异构酶抑制剂（如作用于拓扑异构酶I [TOP1] 的拓扑替康和伊立替康，以及作用于拓扑异构酶II [TOP2] 的依托泊苷和多柔比星）可诱导此类DPCs的形成，这也是这些抑制剂主要的治疗机制5,6。DNA甲基转移酶（DNMT）1、3A和3B是5-氮杂-2'-脱氧胞苷（又称地西他滨）的作用靶点，药物暴露后可导致其形成DPCs7。活性试剂、紫外线以及电离辐射可通过非特异性地将蛋白质与DNA交联而诱导产生非酶促DPCs。活性醛类物质（如乙醛和甲醛（FA））通常是细胞代谢的副产物，其中FA在甲醇代谢、脂质过氧化和组蛋白去甲基化过程中以微摩尔浓度生成。此外，FA是一种全球大量生产的化学品，许多人在环境和职业环境中均可能接触到该物质8,9。
交联的蛋白质-DNA复合物（DPCs）无论是否依赖酶促形成，均对细胞具有高度毒性，因其体积较大的蛋白质组分可有效阻碍几乎所有基于染色质的生物学过程，包括DNA复制和转录，若未得到及时修复，将导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。在过去的二十年中，DPC修复机制受到广泛研究，已鉴定出多个蛋白质或信号通路，它们或直接参与DPC的修复，或调控其修复过程。例如，已有充分证据表明，DPC中蛋白质部分的蛋白水解是DPC修复的关键步骤，该过程可由蛋白酶SPRTN催化完成。10,11,12,13,14FAM111A15，GCNA16,17，或26S蛋白酶体复合物18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 以细胞类型或细胞环境依赖性的方式。这些蛋白酶的鉴定和表征在很大程度上依赖于 在体内 酶（ICE）检测复合物28,29 以及DNA加合物回收的快速检测方法（RADAR检测）30,31，这两种方法均可将DNA分子及其共价结合的蛋白质与游离的细胞蛋白质分离，从而利用靶向交联蛋白的抗体通过槽印迹法检测DNA-蛋白质交联物（DPCs）。此外，还采用了琼脂糖包埋DNA免疫染色法（TARDIS）作为在单细胞水平上检测和定量DPCs的方法32目前，研究人员更倾向于选择RADAR检测法而非ICE检测法来测定DNA-蛋白质交联（DPCs），因为ICE检测法依赖于使用氯化铯梯度超速离心法纯化核酸，该过程极为耗时，而RADAR检测法可在更短时间内通过乙醇沉淀核酸。
近年来，越来越多的证据表明，多种翻译后修饰（PTMs）参与了DPC靶向蛋白酶的信号传导与招募过程3,33,34,35例如，TOP1和TOP2-DPC均被SUMO E3连接酶PIAS4独立于DNA复制和转录过程，先后共价连接小泛素样修饰物（SUMO）-2/3和SUMO-1。这种顺序性的SUMO修饰成为泛素的靶标，由一种称为RNF4的SUMO靶向泛素连接酶将泛素沉积至发生SUMO化的TOP-DPC上，并通过泛素的赖氨酸48残基形成多聚泛素链。随后，该泛素多聚链向26S蛋白酶体发出信号并将其招募至TOP-DPC处23,36同样的SUMO-泛素通路最近也被发现可作用于DNMT1-DPCs以及PARP-DNA复合物，以介导其修复37,38此外，已有报道称，泛素E3连接酶TRAIP介导的不依赖SUMO的泛素化能够以复制偶联的方式启动DNA-蛋白质交联复合物（DPCs）的蛋白酶体降解39类似于TOP-DPCs的蛋白酶体降解，复制偶联的金属蛋白酶SPRTN对酶性和非酶性DPCs的蛋白水解也需要DPC底物的泛素化，以此作为招募SPRTN的机制。40,41. 明确SUMO化和泛素化的作用需要检测带有这些PTM标记的DPC。由于原始的ICE实验和RADAR实验依赖槽式印迹/点式印迹装置来检测未消化的DNA样本，这两种实验均无法分辨和可视化具有不同分子量的PTM偶联DPC种类。为解决这一问题，我们在乙醇沉淀纯化DNA样本并进行样本标准化后，使用微球菌核酸酶（一种DNA和RNA内切-外切核酸酶）对DNA样本进行消化，以释放交联的蛋白质，从而能够通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质及其共价PTM修饰形式。该电泳技术使我们能够利用特异性靶向PTM的抗体来检测和定量PTM偶联的DPC。我们最初将这一改进的方法命名为DUST实验，以突出其在检测泛素化和SUMO化TOP-DPC方面的稳健性23随后，我们将该检测方法的应用扩展至对TOP1-DPC的ADP-核糖基化进行定量评估 体内，使用针对聚ADP-核糖聚合物的抗体20.
本文介绍了一种检测和定量泛素化、SUMO化以及ADP-核糖基化DNA-蛋白质交联物（DPC）的详细实验方案，该方法已针对由抑制剂诱导的修饰型TOP-DPC以及由甲醛（FA）诱导的非特异性/非酶促DPC进行了优化。本实验通过变性剂裂解细胞、乙醇沉淀DNA，并利用微球菌核酸酶释放原本交联的蛋白质及其修饰基团，从而分离出携带翻译后修饰（PTM）的DPC。随后使用特异性抗体通过免疫印迹对原本与DNA结合的蛋白质及其PTM进行定量分析。该方法为阐明细胞修复酶促和非酶促DPC的分子机制提供了新途径。具体而言，它能够深入研究调控TOP-DPC降解与修复过程中关键的PTM的诱导过程及其动力学特征，从而有助于发现调控这些PTM的新因子（如E3泛素连接酶）以及靶向这些因子的抑制剂。由于参与TOP-DPC修复的部分PTM可能也参与其他化疗药物（如铂类药物）所诱导DPC的修复过程22，因此该实验方法还有望应用于新药开发，并用于在患者细胞中合理优化拓扑异构酶抑制剂或铂类抗肿瘤药物的联合治疗方案，以指导临床治疗策略。

<table><tbody><tr><td>10倍磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% 预制聚丙烯酰胺凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli 样品缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>AcquaStain（考马斯亮蓝）</td><td>Bulldog Bio</td><td>AS001000</td><td></td></tr><tr><td>抗-dsDNA 抗体（小鼠单克隆）</td><td>Abcam</td><td>27156</td><td>推荐稀释比例为 1:5,000</td></tr><tr><td>抗-PAR 抗体（小鼠单克隆）</td><td>R&amp;D systems</td><td>4335-MC-100</td><td>推荐稀释比例为 1:500</td></tr><tr><td>抗-SUMO-1 抗体（兔单克隆）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4940</td><td>推荐稀释比例为 1:250</td></tr><tr><td>抗-SUMO-2/3 抗体（兔单克隆）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4971</td><td>推荐稀释比例为 1:250</td></tr><tr><td>抗-TOP1 抗体（小鼠单克隆）</td><td>BD Biosciences</td><td>556597</td><td>推荐稀释比例为 1:500</td></tr><tr><td>抗-TOP2&amp;alpha; 抗体（小鼠单克隆）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-365799</td><td>推荐稀释比例为 1:250</td></tr><tr><td>抗-TOP2&amp;beta; 抗体（小鼠单克隆）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-25330</td><td>推荐稀释比例为 1:250</td></tr><tr><td>抗-泛素抗体（小鼠单克隆）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8017</td><td>推荐稀释比例为 1:100</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td>用于微球菌核酸酶消化</td></tr><tr><td>喜树碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHL89593</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDo MP 成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5438380100</td><td>用于配制磷酸钠缓冲液</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Thermo Fisher</td><td>10503027</td><td></td></tr><tr><td>DTT（二硫苏糖醇）</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200 证明</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>依托泊苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1268808</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 软件</td><td>GraphStats</td><td>Prism 9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的小鼠 IgG</td><td>Cytiva</td><td>NA931</td><td>推荐稀释比例为 1:5,000</td></tr><tr><td>HRP 标记的兔 IgG</td><td>Cytiva</td><td>NA934</td><td>推荐稀释比例为 1:5,000</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH, 美国</td><td>ImageJ 1.53e</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度 ECL 底物</td><td>Thermo Fisher</td><td>34095</td><td></td></tr><tr><td>微球菌核酸酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>用于配制磷酸钠缓冲液</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>N-乙基马来酰亚胺</td><td>Thermo Fisher</td><td>23030</td><td>去SUMO化/去泛素化抑制剂</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜，0.45 &amp;micro;m</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td></td></tr><tr><td>PDD00017273</td><td>Selleckchem</td><td>S8862</td><td>聚（ADP-核糖）糖水解酶抑制剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Thermo Fisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Q700 超声破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q700-110</td><td></td></tr><tr><td>即用型 PVDF 转膜试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>1704274</td><td></td></tr><tr><td>槽印迹装置</td><td>Bio-Rad</td><td>1706542</td><td></td></tr><tr><td>槽印迹滤纸</td><td>Bio-Rad</td><td>1620161</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 转膜系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Tris/甘氨酸/SDS 电泳缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3179</td><td></td></tr><tr><td>垂直电泳槽</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-蛋白质交联（DPCs）是一类频繁发生、普遍存在且具有危害性的DNA损伤，可由内源性DNA损伤、酶（如拓扑异构酶、甲基转移酶等）功能异常或外源性因素（如化疗药物和交联剂）引发。一旦形成DPCs，多种翻译后修饰（PTMs）会迅速共价连接至其上，作为早期应答机制。研究表明，DPCs可被泛素、类泛素小分子修饰物（SUMO）以及聚ADP-核糖（poly-ADP-ribose）修饰，这些修饰可标记底物以招募特定的修复酶，并在某些情况下以有序的方式协调修复过程。由于PTMs发生迅速且高度可逆，通常仅维持在较低水平，因此分离和检测带有PTMs修饰的DPCs极具挑战性。本文介绍一种免疫检测方法，用于纯化并定量检测泛素化、SUMO化及ADP-核糖基化的DPCs（包括药物诱导的拓扑异构酶DPCs和醛类诱导的非特异性DPCs） 体内该实验方法源自用于通过乙醇沉淀法分离含DNA-蛋白质交联物（DPCs）的基因组DNA的RADAR（快速DNA加合物回收）法。在完成标准化和核酸酶消化后，通过相应的抗体进行免疫印迹，检测DPCs的翻译后修饰（PTMs），包括泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化。这一可靠的实验方法可用于鉴定和表征修复酶性和非酶性DPCs的新型分子机制&#160;并有望发现靶向调控DPC修复的特定因子的小分子抑制剂。

图中所示的代表性结果 图1 展示药物诱导的TOP1-DNA共价复合物（TOP1-DPCs）的形成及其动力学过程，以及其SUMO化与泛素化修饰。TOP1切割DNA双链中的一条链，形成一种酶-DNA共价中间体，称为TOP1切割复合物（TOP1cc）。使用拓扑异构酶I抑制剂喜树碱（camptothecin, CPT）处理后，CPT与TOP1cc结合并使其稳定，从而导致长寿命TOP1-DPCs的形成。实验观察到，TOP1-DPCs在CPT处理后20分钟内被诱导并达到峰值。与此同时，TOP1-DPCs被SUMO-2/3修饰，该修饰也在CPT处理后20分钟达到高峰。由于SUMO-2与SUMO-3具有95%的序列同源性，所用抗体无法区分二者。在60分钟时，TOP1-DPCs及其SUMO-2/3修饰水平下降，同时伴随其SUMO-1修饰和泛素化修饰达到高峰。在药物处理60分钟后，TOP1-DPC的SUMO-1修饰和泛素化水平开始下降。在哺乳动物中，TOP2同工酶α和β通过引入DNA双链断裂发挥作用，以及 通过 瞬时且可逆的酶-DNA 共价复合物（TOP2cc）的形成。TOP2 抑制剂（如依托泊苷，ETOP）可将 TOP2cc 转化为 TOP2-DPC，并诱导其发生 SUMO 化和泛素化修饰。与 TOP1-DPC 及其翻译后修饰的动力学相似，TOP2α 和 β-DPC 及其 SUMO-2/3 修饰在 20 分钟时达到峰值，随后开始下降；而其 SUMO-1 和泛素修饰则在 60 分钟时达到峰值。图2）。已证明TOP-DPC的清除源于蛋白酶体降解，而TOP-DPC上SUMO化和泛素化的清除则可能分别由相应的去SUMO化酶和去泛素化酶介导的去SUMO化和去泛素化过程实现循环利用。相关实验在 图3 检测了FA诱导的非酶促DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTMs）。观察到DPC及其SUMO-2/3、SUMO-1和泛素化修饰的形成与积累均呈FA剂量依赖性。最后，采用相同方法利用抗PAR抗体对TOP1-DPC的PAR化修饰进行了定量检测。图4）。除非向细胞中添加PARG抑制剂，否则无法检测到TOP1-DPC的PARylation，表明PARylation过程迅速且具有高度动态性。与先前的研究结果一致，PARG抑制剂通过抑制去PARylation，可能导致TOP1-DPC的累积，可能机制是阻断了其蛋白水解降解。
<img alt="通过Western blot进行蛋白质表达分析及CPT处理200分钟期间相对密度的图示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65315/65315fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：CPT处理HEK293细胞后TOP1-DPCs的形成及其SUMO化和泛素化修饰的动力学定量分析。（A）HEK293细胞用20 µM CPT处理指定时间段。收集细胞裂解物，进行改良RADAR检测，并用指定抗体进行Western blot分析。未消化的DNA样本使用抗dsDNA抗体进行slot-blot分析，作为上样对照。（B）使用ImageJ软件对条带强度进行定量，并用Prism软件作图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65315/65315fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质修饰的Western印迹分析；相对整合密度随时间变化的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65315/65315fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：ETOP处理HEK293细胞后TOP2-DPCs的形成及其SUMO化和泛素化动力学的定量分析。（A）HEK293细胞用200 µM ETOP处理指定时间。收集细胞裂解物，进行改良的RADAR检测，并使用指定抗体进行Western印迹分析。未消化的DNA样品使用抗dsDNA抗体进行槽印迹分析，作为上样对照。（B）条带强度使用ImageJ软件进行定量，并用Prism软件绘图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65315/65315fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通过SDS-PAGE进行蛋白质分离；SUMO化作用的免疫印迹分析；相对密度图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65315/65315fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：甲醛处理后HEK293细胞中非酶促DNA-蛋白质交联（DPC）及其SUMO化和泛素化的定量分析。 （A）HEK293细胞用指定浓度的甲醛（FA）处理2小时。收集细胞裂解物，进行改良RADAR检测，并用指定抗体进行蛋白质印迹分析。未消化的DNA样品使用抗双链DNA（dsDNA）抗体进行槽印迹分析，作为上样对照。（B）使用ImageJ软件对条带强度进行定量，并用Prism软件绘图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65315/65315fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示经 CPT 和 PARGi 处理后 PAR 和 TOP1 蛋白水平的 Western 印迹图和图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65315/65315fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：CPT 处理后 HEK293 细胞中 TOP1-DPC 及其 PAR 修饰的定量分析。（A）HEK293 细胞先用 10 µM PARGi 预处理 1 小时，随后与 CPT 共同处理指定时间。收集细胞裂解液，采用改良 RADAR 检测法进行检测，并使用指定抗体进行 Western 印迹分析。未消化的 DNA 样品通过抗双链 DNA 抗体进行槽印迹分析，作为上样对照。（B）条带强度使用 ImageJ 软件进行定量，并用 Prism 软件绘图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65315/65315fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案重点介绍了一种改进的方法，用于检测和定量由拓扑异构酶抑制剂和甲醛诱导的DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTM），包括泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化，从而能够研究DPC及其翻译后修饰的形成与修复过程。

DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测

DNA-蛋白质交联（DPCs）是一类常见且普遍存在的有害DNA损伤，可由内源性DNA损伤、酶类（如拓扑异构酶等）

我的研究主要集中在DNA损伤修复，特别是由拓扑异构酶抑制剂、PARP抑制剂以及醛类物质所诱导的DNA损伤的修复。我致力于阐明细胞修复这些药物所引发的DNA-蛋白质交联的分子机制。近年来，在DNA-蛋白质交联修复方面的研究进展包括新修复通路的发现，以及调控这些修复通路的翻译后修饰机制。体内酶活性测定法以及快速DNA加合物回收测定法是目前最常用的检测DNA-蛋白质交联的方法。某些特定的DNA-蛋白质交联，例如拓扑异构酶I介导的DNA-蛋白质交联，可通过特异性抗体进行免疫荧光检测。该领域最大的挑战之一是研究翻译后修饰在DNA-蛋白质交联修复过程中的作用。由于翻译后修饰的DNA-蛋白质交联物丰度极低，对其进行富集和检测一直具有很大挑战性。本实验方案详细介绍了泛素化、SUMO化以及ADP-核糖基化DNA-蛋白质交联物的检测与定量方法，使研究人员能够研究这些修饰在不同来源的DNA-蛋白质交联修复过程中的形成动力学。现有的其他DNA-蛋白质交联检测方法并未包含对其翻译后修饰的检测步骤，而本方案则提供了诱导这些修饰所需的药物浓度和作用时间等具体参数，以及分离、检测和稳定这些修饰的实验方法。目前已鉴定出多种参与DNA-蛋白质交联修复的翻译后修饰，但这些修饰如何协调修复过程在很大程度上仍不清楚。因此，这些修饰之间的相互作用有待进一步研究。开始细胞培养时，配制细胞培养所需的 DMEM 培养基及相关溶液。每种处理条件及对照组，分别在 60 毫米培养皿或六孔板中接种 1 × 10⁶ 个 HEK-293 细胞。次日，使用选定的 DNA-蛋白质交联（DPCs）诱导剂处理细胞，以诱导 DPCs 及其泛素化和 SUMO 化修饰。在20、60和180分钟时收集细胞，若为非酶促DNA-蛋白质交联（DPC），则在两小时时收集。为诱导TOP1 DPC的PAR化修饰，在与20微摩尔喜树碱共处理前1小时，先用10微摩尔聚ADP-核糖水解酶（PARG）抑制剂PDD 00017273预处理细胞，共处理时间分别为20、60和180分钟。开始分离和标准化含交联蛋白的DNA时，在完成泛素化和SUMO化药物处理后，使用抽吸移液器吸除培养基。加入600微升DNAzol试剂前，用预冷的PBS冲洗细胞。将培养板置于振荡平台上，在4°C下缓慢振荡10分钟，然后直接向培养板中加入0.3毫升100%冷乙醇。继续振荡，直至可见不透明的核酸絮状沉淀。接下来，将细胞裂解液转移至1.5毫升微量离心管中，在4°C、20,000G条件下离心15分钟。吸除上清液后，用1毫升75%乙醇洗涤核酸与交联蛋白沉淀物，随后在20,000G及4°C条件下离心2分钟。再次吸除上清液，以相同转速离心后，使用P20移液器去除残留液体。将沉淀物空气中干燥5分钟。用移液器反复吹打数次，将干燥的核酸沉淀溶解于0.1毫升双蒸水中。然后将悬液置于37°C水浴中孵育30分钟，直至沉淀物膨胀至至少原来的三倍。使用超声波处理器探头以30%的振幅对样品进行10秒超声处理。然后使用紫外-可见分光光度计测定DNA浓度。加入重蒸水，将DNA浓度调整至每微升400至500纳克，总体积为120微升。然后取20微升样品转移至新的微量离心管中，作为未消化DNA上样对照。向溶于剩余100微升双蒸水中的DNA加入2,000个凝胶单位的微球菌核酸酶和11微升10倍浓度的微球菌核酸酶钙缓冲液。在37摄氏度孵育30分钟。开始对已定量的消化后DNA样品进行Western印迹时，加入4倍浓度的Laemmli上样缓冲液，将样品煮沸5分钟。取5至6微克消化后的样品，上样至4%～20%的聚丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE，以分离未修饰的DNA、翻译后修饰产物或PMT偶联的DNA-蛋白质交联复合物（DPCs）。将凝胶在室温下用考马斯亮蓝染色液孵育过夜。 在成像前，用双蒸水洗涤凝胶两小时。为检测泛素化、SUMO 1 或 SUMO 2 和 3 修饰、ADP 核糖基化、总TOP1、TOP2α或TOP2β DNA-蛋白质交联复合物（DPCs），按表格中所示稀释相应的抗体。接着，将凝胶转移至含有适当稀释度一抗和封闭缓冲液的溶液中，于4°C下孵育膜过夜。完成后，将经 PBST 洗涤的膜在封闭缓冲液中以 1:5,000 稀释的二抗室温孵育 60 分钟，随后用增强型化学发光试剂显色，并使用成像系统采集图像。喜树碱处理可诱导 TOP1 DNA-蛋白质交联物（DPC）的形成。TOP1 共价交联蛋白复合物（DPC）的形成在喜树碱处理20分钟后达到峰值，与抗SUMO2和SUMO3修饰的峰值时间相似。同时观察到SUMO1修饰和泛素化修饰的累积。DPC及其TOP1的SUMO2和SUMO3修饰随喜树碱剂量增加而减少。依托泊苷诱导的TOP 2 DNA-蛋白质交联（DPC）以及SUMO 2和SUMO 3修饰在20分钟时达到峰值，随后下降。相比之下，SUMO 1和泛素化修饰在60分钟时达到峰值。甲醛诱导的DPC及其SUMO 2和SUMO 3、SUMO 1以及泛素化修饰则以剂量依赖的方式形成并累积。使用抗PAR抗体对TOP1-DPC的PAR化进行定量检测。除非向细胞中添加PARG抑制剂，否则无法检测到TOP1-DPC的PAR化，这表明PAR化过程迅速发生且具有高度动态性。

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