DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测
2023年4月21日
本方案重点介绍了一种改进的方法，用于检测和定量由拓扑异构酶抑制剂和甲醛诱导的DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTM），包括泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化，从而能够研究DPC及其翻译后修饰的形成与修复过程。
我的研究主要集中在DNA损伤修复，特别是由拓扑异构酶抑制剂、PARP抑制剂以及醛类物质所诱导的DNA损伤的修复。我致力于阐明细胞修复这些药物所引发的DNA-蛋白质交联的分子机制。近年来，在DNA-蛋白质交联修复方面的研究进展包括新修复通路的发现，以及调控这些修复通路的翻译后修饰机制。
体内酶活性测定法以及快速DNA加合物回收测定法是目前最常用的检测DNA-蛋白质交联的方法。某些特定的DNA-蛋白质交联，例如拓扑异构酶I介导的DNA-蛋白质交联，可通过特异性抗体进行免疫荧光检测。该领域最大的挑战之一是研究翻译后修饰在DNA-蛋白质交联修复过程中的作用。
由于翻译后修饰的DNA-蛋白质交联物丰度极低，对其进行富集和检测一直具有很大挑战性。本实验方案详细介绍了泛素化、SUMO化以及ADP-核糖基化DNA-蛋白质交联物的检测与定量方法，使研究人员能够研究这些修饰在不同来源的DNA-蛋白质交联修复过程中的形成动力学。现有的其他DNA-蛋白质交联检测方法并未包含对其翻译后修饰的检测步骤，而本方案则提供了诱导这些修饰所需的药物浓度和作用时间等具体参数，以及分离、检测和稳定这些修饰的实验方法。
目前已鉴定出多种参与DNA-蛋白质交联修复的翻译后修饰，但这些修饰如何协调修复过程在很大程度上仍不清楚。因此，这些修饰之间的相互作用有待进一步研究。
开始细胞培养时，配制细胞培养所需的 DMEM 培养基及相关溶液。每种处理条件及对照组，分别在 60 毫米培养皿或六孔板中接种 1 × 10⁶ 个 HEK-293 细胞。次日，使用选定的 DNA-蛋白质交联（DPCs）诱导剂处理细胞，以诱导 DPCs 及其泛素化和 SUMO 化修饰。
在20、60和180分钟时收集细胞，若为非酶促DNA-蛋白质交联（DPC），则在两小时时收集。为诱导TOP1 DPC的PAR化修饰，在与20微摩尔喜树碱共处理前1小时，先用10微摩尔聚ADP-核糖水解酶（PARG）抑制剂PDD 00017273预处理细胞，共处理时间分别为20、60和180分钟。开始分离和标准化含交联蛋白的DNA时，在完成泛素化和SUMO化药物处理后，使用抽吸移液器吸除培养基。
加入600微升DNAzol试剂前，用预冷的PBS冲洗细胞。将培养板置于振荡平台上，在4°C下缓慢振荡10分钟，然后直接向培养板中加入0.3毫升100%冷乙醇。继续振荡，直至可见不透明的核酸絮状沉淀。
接下来，将细胞裂解液转移至1.5毫升微量离心管中，在4°C、20,000G条件下离心15分钟。吸除上清液后，用1毫升75%乙醇洗涤核酸与交联蛋白沉淀物，随后在20,000G及4°C条件下离心2分钟。再次吸除上清液，以相同转速离心后，使用P20移液器去除残留液体。
将沉淀物空气中干燥5分钟。用移液器反复吹打数次，将干燥的核酸沉淀溶解于0.1毫升双蒸水中。然后将悬液置于37°C水浴中孵育30分钟，直至沉淀物膨胀至至少原来的三倍。
使用超声波处理器探头以30%的振幅对样品进行10秒超声处理。然后使用紫外-可见分光光度计测定DNA浓度。加入重蒸水，将DNA浓度调整至每微升400至500纳克，总体积为120微升。
然后取20微升样品转移至新的微量离心管中，作为未消化DNA上样对照。向溶于剩余100微升双蒸水中的DNA加入2,000个凝胶单位的微球菌核酸酶和11微升10倍浓度的微球菌核酸酶钙缓冲液。在37摄氏度孵育30分钟。
开始对已定量的消化后DNA样品进行Western印迹时，加入4倍浓度的Laemmli上样缓冲液，将样品煮沸5分钟。取5至6微克消化后的样品，上样至4%～20%的聚丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE，以分离未修饰的DNA、翻译后修饰产物或PMT偶联的DNA-蛋白质交联复合物（DPCs）。将凝胶在室温下用考马斯亮蓝染色液孵育过夜。
在成像前，用双蒸水洗涤凝胶两小时。为检测泛素化、SUMO 1 或 SUMO 2 和 3 修饰、ADP 核糖基化、总TOP1、TOP2α或TOP2β DNA-蛋白质交联复合物（DPCs），按表格中所示稀释相应的抗体。接着，将凝胶转移至含有适当稀释度一抗和封闭缓冲液的溶液中，于4°C下孵育膜过夜。
完成后，将经 PBST 洗涤的膜在封闭缓冲液中以 1:5,000 稀释的二抗室温孵育 60 分钟，随后用增强型化学发光试剂显色，并使用成像系统采集图像。喜树碱处理可诱导 TOP1 DNA-蛋白质交联物（DPC）的形成。
TOP1 共价交联蛋白复合物（DPC）的形成在喜树碱处理20分钟后达到峰值，与抗SUMO2和SUMO3修饰的峰值时间相似。同时观察到SUMO1修饰和泛素化修饰的累积。DPC及其TOP1的SUMO2和SUMO3修饰随喜树碱剂量增加而减少。
依托泊苷诱导的TOP 2 DNA-蛋白质交联（DPC）以及SUMO 2和SUMO 3修饰在20分钟时达到峰值，随后下降。相比之下，SUMO 1和泛素化修饰在60分钟时达到峰值。甲醛诱导的DPC及其SUMO 2和SUMO 3、SUMO 1以及泛素化修饰则以剂量依赖的方式形成并累积。
使用抗PAR抗体对TOP1-DPC的PAR化进行定量检测。除非向细胞中添加PARG抑制剂，否则无法检测到TOP1-DPC的PAR化，这表明PAR化过程迅速发生且具有高度动态性。
概述
本方案概述了一种用于检测和定量DNA-蛋白质交联（DPCs）及其翻译后修饰（PTMs）的改进方法。该方法重点研究拓扑异构酶抑制剂和甲醛对DPC形成与修复的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- DNA损伤修复
- 翻译后修饰
- 细胞对拓扑异构酶抑制剂的响应
背景
- DNA-蛋白质交联（DPC）对细胞修复机制构成重大挑战。
- 近年来的研究进展已鉴定出调控DPC修复的新型通路和机制。
- 翻译后修饰在DPC修复过程中发挥关键作用。
- 现有实验方案常常忽视对这些修饰的检测。
研究目的
- 提供一种检测和定量DPC及其翻译后修饰的详细方案。
- 阐明泛素化和SUMO化等修饰的形成动力学过程。
- 增进对DPC修复过程中不同翻译后修饰之间相互作用的理解。
使用的方法
- 细胞培养及使用 DPC 诱导剂处理。
- 含交联蛋白 DNA 的分离与归一化。
- 通过蛋白质印迹检测特定修饰及 DNA-蛋白交联物（DPCs）。
- DNA 浓度的定量与修饰分析。
主要结果
- TOP1-DNA加合物（DPC）的形成在喜树碱处理20分钟后达到峰值。
- 在DPC诱导剂作用下，观察到SUMO1修饰和泛素化修饰的发生。
- 随着喜树碱剂量增加，修饰水平呈剂量依赖性降低。
- 获得了关于DPC修复机制动态过程的新见解。
结论
- 该方案可实现对DNA-蛋白质交联物（DPCs）及其翻译后修饰的详细研究。
- 理解这些过程对于阐明DNA修复通路至关重要。
- 有必要进一步研究不同修饰之间的协调机制。
常见问题
行业重要性概要
对DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTM）进行定量检测，有助于解决理解与药物发现相关的DNA损伤修复机制中的关键瓶颈问题。该能力可为靶向DNA修复通路的化合物提供机制层面的风险评估和预测信心，特别是在化疗药物和交联剂暴露的背景下。对携带翻译后修饰的DPC进行可靠检测与定量，有助于早期靶点验证，并为基于风险调整的研发管线决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够验证涉及DNA修复与翻译后修饰协调作用的治疗假说。
- 通过阐明泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化在DNA-蛋白质交联（DPC）修复中的相互作用，支持生物学层面的风险评估。
- 有助于对调控DPC清除的酶类及通路进行功能性靶点验证。
- 提供定量结果，用于评估DNA修复靶点的预测可信度并进行优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 为小分子DPC修复调节剂的下游筛选制备经过验证的生物系统。
- 通过PTM的定量免疫检测实现检测方法的标准化和可重复性。
- 支持针对影响DPC形成、修饰或修复动力学的化合物进行筛选前准备。
- 为DNA损伤应答通路中化合物的评估提供可靠且定量的检测结果。
转化与临床前研究
- 与疾病相关模型一致，在这些模型中，DPC 的积累或修复与治疗反应有关。
- 通过实现对修复通路调控的机制研究，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 为靶向 DNA 修复的治疗药物提供基于风险评估的推进决策支持。
- 通过量化候选药物诱导的动态 PTM 变化，提供具有预测价值的去风险化评估。
流程与工作流整合
该免疫分析法可融入从发现到临床前的研究连续过程，能够在药物或试剂暴露后，实现对DPC修复机制和PTM动态的定量分析。
- Discovery Biology：支持对翻译后修饰（PTMs）在DNA-蛋白质交联（DPC）修复中的作用进行假设验证，并有助于阐明相关通路。
- Screening：提供可重复、定量的免疫印迹结果，用于检测方法开发和化合物筛选。
- Analytics：提供DPC及翻译后修饰丰度的定量测量，支持不同实验条件间的比较分析。
- Translational Research：可与疾病模型对接，适用于以DPC修复为治疗靶点的转化医学研究。
- Enterprise Reuse：可作为可重复使用的平台，用于研究多种DPC诱导剂及修复调控因子。
运营与企业影响
- 科学价值：提高DNA修复靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化检测DPC上丰度低且动态变化的翻译后修饰，以获得可重复的结果。
- 战略价值：通过明确修复通路的参与情况，为决策提供依据，指导项目推进或终止以及资金分配。
- 项目组合影响：实现对DNA修复靶点及候选治疗药物的风险调整后优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备DNA损伤生物学和免疫检测技术方面的专业知识。
- 需要具备细胞培养、DNA提取和免疫印迹仪器的使用条件。
- 要求跨团队标准化操作，以确保定量结果的可重复性。
- 针对不同细胞类型或DPC诱导剂可能需要进行方法调整。
- 由于PTM修饰的DPC丰度低且具有动态性，其检测灵敏度受限。
