一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

利用LeTech，我们试图回答的主要问题是染色质在细胞核内如何相互作用，从而理解基因调控的一个新层面。我们已通过LeTech证明，可以探索特定样本的基因组结构，将与疾病相关的非编码突变与潜在受影响的基因联系起来，并检测染色体重排（例如在肿瘤样本中的易位）。现在，我们能够研究瘢痕细胞类型（如原代干细胞或相关临床样本）的三维染色质结构。

本方案减少了探索限制性酶切片段分辨率下基因组结构所需投入的材料、时间和成本，从而获得高质量数据。LeTech 扩展了三维染色质结构研究领域的应用范围，使我们能够分析此前无法研究的新细胞类型。得益于 LeTech，科学界可探究特定肿瘤内染色体亚群中基因表达的特殊调控机制，例如恶性转化过程中的调控。

首先，取一份冷冻的稀有细胞，加入一毫升冷裂解缓冲液以破坏细胞膜。将细胞在冰上孵育30分钟，每5分钟颠倒混匀一次。在1000 × g离心10分钟，弃去上清液，并将细胞核重悬于500微升冰冷的1.25 × 限制性缓冲液2中。

然后，加入 5.5 µL 的 10% 十二烷基硫酸钠。涡旋混匀后，在温控金属块中孵育。接着通过加入 37.5 µL 的 10% Triton X-100 终止 SDS 的作用。

按照之前演示的方法混合并孵育样品。加入7.5 µL的hint three以消化染色质，混匀溶液，并在37°C下孵育过夜。首先，取已消化的稀有细胞DNA，置于冰上。

使用所需的试剂配制主混合液，以填补并进行限制性片段突出末端的生物素标记。将样品在37摄氏度孵育75分钟，每15分钟翻转混匀一次。将样品置于冰上冷却，然后通过配制含有连接反应所需试剂的主混合液，对填补后的DNA末端进行连接。

最后，将样品在16摄氏度孵育4至6小时，然后在室温下孵育30分钟。加入30微升浓度为10毫克/毫升的蛋白酶K溶液，以解除染色质的交联。混匀溶液，并在65摄氏度下过夜孵育。

纯化DNA后，开始取稀有细胞中连接并去交联的消化染色质。将水浴超声仪设置为20%的占空因数，峰值入射功率为每脉冲50至200个循环，持续65秒，温度范围为6至10摄氏度，对连接并去交联的消化染色质进行超声处理。样品末端修复后，将每份样品150微升C1链霉亲和素磁珠转移至1.5毫升离心管中。

将它们置于1.5毫升管磁铁上，等待所有磁珠吸附至管壁。随后移除上清液，保留磁珠。接下来，加入400 µL吐温缓冲液洗涤磁珠，并通过轻柔涡旋振荡重新悬浮磁珠。

将离心管放回磁力架，直至所有磁珠吸附在管壁上。然后移除上清液，保留磁珠。将磁珠重悬于300 µL的2×无Tween缓冲液（NTB）中，随后与300 µL样品混合。

最后，在室温下旋转孵育15分钟，利用生物素沉淀含有信息的DNA片段。首先，取用生物素富集的稀有细胞DNA片段。通过加入dATP加尾所需的试剂配制主混合液，并将样品在37摄氏度下孵育30分钟。

然后将样品在65摄氏度孵育10分钟，以灭活Klenow exo-minus，随后在冰上冷却。用300微升TB缓冲液、NTB缓冲液及100微升连接缓冲液依次洗涤磁珠后，将磁珠重悬于50微升连接缓冲液中。向样品中加入4微升15微摩尔的预退火接头混合物以及1微升2000单位/微升的T4 DNA连接酶。

用400 µL TB、200 µL NTB 和100 µL 限制性缓冲液二洗涤磁珠。PCR扩增文库后，将同一样本的所有50 µL反应产物合并至一个1.5 mL DNA低吸附离心管中。将离心管置于磁力架上，静置直至所有磁珠吸附至管壁。

将含有文库的上清液转移至新的1.5毫升DNA低吸附离心管中，并用TLE缓冲液补至500微升。若要使用磁性珠纯化进行双端筛选，向文库中加入200微升储存态磁珠，涡旋混匀后于室温旋转孵育10分钟。随后将文库置于磁力架上，静置直至所有磁珠吸附至管壁。

将含有文库的上清液转移至一个新的1.5毫升DNA低吸附离心管中。取750微升磁珠储备液，放入1.5毫升离心管中，并置于磁力架上，使磁珠充分聚集。待所有磁珠吸附至管壁后，吸除上清液，再加入300微升新的磁珠储备液，通过涡旋振荡重悬磁珠。

向样品中加入 300 µL 浓缩珠。通过涡旋混合，并在室温下旋转孵育 10 分钟。置于磁铁上。

等待所有磁珠完全吸附至管壁后，移除上清液。向磁珠所在的管中加入1毫升70%乙醇进行洗涤，磁珠仍置于磁力架上。让磁珠自然风干，然后加入21微升TLE缓冲液，通过涡旋振荡重悬磁珠。

为从磁珠上洗脱文库，将样品置于恒温金属浴中，在37摄氏度孵育10分钟。将离心管置于磁力架上，转移含有文库的上清液至新的1.5毫升低吸附DNA管中。首先取500至1000纳克的稀有细胞DNA文库。

使用真空浓缩仪将DNA干燥，并用3.4 µL无核酸酶水重悬。加入阻断剂后，在65 °C的热循环仪中孵育时，将含生物素标记RNA的杂交溶液转移至已阻断的文库中。将管盖牢固闭合后，在65 °C热循环仪中孵育过夜。

然后将每份样品50 µL的T1链霉亲和素磁珠转移至一个1.5 mL DNA低吸附离心管中，并将管子置于1.5 mL管磁力架上。待所有磁珠吸附至管壁后，小心移除上清液，保留磁珠。随后用200 µL靶向富集试剂盒中的结合缓冲液对磁珠洗涤三次，并将磁珠重悬于200 µL结合缓冲液中。

将样品转移至热循环仪中的重悬珠子中，孵育30分钟。用200微升洗涤缓冲液一在室温下旋转孵育15分钟后，洗涤珠子。随后用200微升预热至65摄氏度的洗涤缓冲液二洗涤珠子三次，并在温控金属块中孵育。

最后，在通过PCR扩增文库后，向样品中加入270微升磁珠储备液，涡旋混匀，使用磁性 beads 进行DNA纯化。在捕获前对文库进行自动化电泳分析，结果显示在20微升反应体系中DNA浓度为49.7纳克/微升。然而，对构建完成的lech文库进行高灵敏度自动化电泳分析，仅获得3.06纳克/微升的DNA。