Name: 研究稀缺细胞群中以启动子为中心的时空基因组结构的集成工作流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 了解低输入量Capture Hi-C（liCHi-C）技术如何分析稀缺细胞类型中的染色质相互作用。该方法可识别基因启动子与远端调控元件的相互作用，有助于研究基因调控机制及肿瘤样本中的染色体重排。

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我们感谢Javierre实验室其他成员对本手稿提供的反馈意见。感谢CERCA项目、加泰罗尼亚自治区政府以及Josep Carreras基金会提供的机构支持。本研究由欧洲区域发展基金/西班牙科学与创新部（RTI2018-094788-A-I00）、欧洲血液学协会（4823998）以及西班牙抗癌协会（AECC）（项目编号LABAE21981JAVI）提供资金支持。BMJ由La Caixa银行基金会Junior Leader项目（LCF/BQ/PI19/11690001）资助，LR由AGAUR FI博士后奖学金（2019FI-B00017）资助，LT-D由FPI博士后奖学金（PRE2019-088005）资助。我们感谢巴塞罗那自治大学生物化学与分子生物学博士项目提供的支持。&#160;所有资助方均未参与实验设计或手稿撰写的任何环节。

A Comprehensive Approach to Studying the Promoter Interactome in Scarce Cells

作者无任何利益冲突需要披露。

liCHi-C 能够利用与 PCHi-C 相似的实验框架，但所需细胞数量显著减少，从而生成高分辨率的启动子互作组图谱文库。这一优势主要通过省略不必要的步骤实现，例如苯酚纯化和生物素去除。在经典的细胞核内连接 Hi-C 协议57 及其衍生技术 PCHi-C 中，需将未连接的限制性酶切片段上的生物素去除，以避免富集后续无信息价值的 DNA 片段。跳过该步骤及其后续的 DNA 纯化过程，并不会显著降低有效读段的比例（图 3A），同时避免了可能造成 DNA 损失的纯化步骤。在超声破碎后的 Hi-C 文库构建过程中重新设计流程，可通过双端筛选直接作为纯化步骤，从而省去另一次不必要的纯化。所有这些改进通过最大限度减少离心管转移操作，结合反应体系体积的缩小、试剂浓度的优化以及低吸附 DNA 塑料耗材的使用，使得仅用 50,000 个细胞即可构建高质量文库成为可能。需要谨记的是，起始细胞数量在一定程度上决定了文库复杂性，从而影响显著互作的数量。尽管使用 50,000 个细胞构建的文库仍保留了细胞类型特异性和稳定的拓扑结构特征<sup class=...

基因的时间特异性表达驱动细胞分化，并最终影响生物体的发育，其表达模式的改变与多种疾病密切相关1,2,3,4,5。基因转录受到调控元件的精细调控，这些元件可分为近端调控元件（如基因启动子）和远端调控元件（如增强子或沉默子），后者通常位于其靶基因较远的位置，并通过染色质成环结构与靶基因发生物理相互作用，从而调控基因表达6,7,8。
基因组中远端调控区域的鉴定是一个广受认可的研究方向，因为这些区域含有特定的组蛋白修饰9,10,11，并包含特定的转录因子识别基序，可作为转录因子的招募平台12,13,14。此外，对于增强子和超级增强子15,16而言，它们还表现出核小体占据率较低17,18，并可转录生成非编码的eRNA19,20。
然而，每个远端调控元件的靶基因更难以预测。远端调控元件与其靶基因之间的相互作用通常具有细胞类型和刺激特异性21,22，跨度可达数百千碱基，可跨越任意方向上的其他基因23,24,25，甚至可能位于其靶基因或其他非邻近基因的内含子区域内部26,27。此外，远端调控元件也可同时调控多个基因，反之亦然28,29。这种位置上的复杂性阻碍了它们之间调控关系的精确定位，因此，在每种细胞类型中，大多数调控元件的靶基因仍不明确。
近年来，染色体构象捕获（3C）技术在研究染色质相互作用方面得到了显著发展。其中应用最广泛的是Hi-C技术，它能够生成细胞基因组各个片段之间所有相互作用的图谱30。然而，要在限制性酶切片段水平上检测到显著的相互作用，Hi-C依赖于超深度测序，这使其难以常规用于研究单个基因的调控图景。为了克服这一经济上的限制，多种基于富集的3C技术应运而生，例如ChIA-PET31、HiChIP32及其低起始量版本HiCuT33。这些技术依赖抗体来富集由特定蛋白介导的全基因组范围内的相互作用。然而，这些3C技术的独特优势也正是其应用中的主要局限：用户必须依赖于针对目标蛋白的高质量抗体，并且无法比较蛋白结合状态动态变化的实验条件。
启动子捕获高通量染色体构象捕获技术（Promoter Capture Hi-C, PCHi-C）是另一种基于富集的3C技术，可克服上述局限性34,35。通过采用生物素化RNA探针富集系统，PCHi-C能够生成与28,650个人源或27,595个鼠源注释基因启动子相互作用的全基因组高分辨率文库，这些文库也被称为启动子互作组。该方法能够在限制性酶切片段水平上检测活性与非活性启动子的显著长距离相互作用，并且无需依赖组蛋白修饰或蛋白质结合的动态变化，即可在不同条件下稳健地比较启动子互作组。近年来，PCHi-C已被广泛用于研究细胞分化过程中启动子互作组的重排36,37，揭示转录因子的作用机制38,39，以及通过非编码变异发现疾病中异常调控的潜在新基因和通路40,41,42,43,44,45,46,47,48，同时发现新的驱动性非编码突变49,50。此外，仅需调整捕获系统，该技术即可根据具体生物学问题进行定制，用于研究任意类型的互作组（例如增强子互作组51，或一组非编码变异的互作组41,52）。
然而，PCHi-C 技术至少需要 2000 万个细胞才能实施，这限制了对稀有细胞群体的研究，而这类细胞群体在发育生物学和临床应用中常常被使用。为此，我们开发了低起始量捕获 Hi-C（liCHi-C），这是一种基于 PCHi-C 实验框架的新方法，具有成本低、可定制的特点，可用于以少量细胞输入生成高分辨率的启动子互作组。通过尽量减少实验过程中的管转移、替换或省略原始 PCHi-C 方案中的步骤、大幅降低反应体积以及调整试剂浓度，最大限度地提高了文库复杂度，仅需低至 50,000 个细胞即可构建高质量文库53。
低输入量捕获Hi-C（liCHi-C）已与PCHi-C进行过性能比较，并被用于阐明人类造血细胞分化过程中启动子相互作用组的重连、发现由非编码变异导致失调的潜在新疾病相关基因和通路，以及检测染色体异常53。本文详细描述了该技术的逐步操作流程以及各个环节的质量控制，直至最终文库的构建及其计算分析。

<table><tbody><tr><td>0.4 mM 生物素-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>在文稿中称为限制性酶切缓冲液2</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA连接酶反应缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛溶液（w/v），无甲醇</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>20 mg/mL 牛血清白蛋白</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock Gel Light 管</td><td>Qiuantabio</td><td>2302820</td><td>&lt;strong&gt;用于第4节中的酚-氯仿纯化（DNA纯化）。Phase Lock Gel管是一种商业化的专用离心管，设计用于在酚-氯仿纯化后最大化DNA回收率，同时通过含有中等密度的树脂将有机相与水相分隔开来，防止有机相中的污染物残留。使用前应以12,000 × g离心30秒，确保树脂充分沉降至管底&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>文库扩增用接头和PCR引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td>作为单个引物购买，经PAGE纯化用于NGS</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Nunc</td><td>179693</td><td>或任何其他品牌</td></tr><tr><td>离心机（适用于1.5 mL离心管的固定角转子）</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHiCAGO R软件包</td><td>1.14.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CleanNGS磁珠</td><td>CleanNA</td><td>CNGS-0050</td><td></td></tr><tr><td>dATP、dCTP、dGTP、dTTP</td><td>Promega</td><td>U120A, U121A, U122A, U123A</td><td>或任何其他品牌</td></tr><tr><td>DNA LoBind管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind管，2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>DNA聚合酶I大片段（Klenow）5000单位/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>&lt;strong&gt;用于第8节中预捕获文库的生物素富集&lt;/strong&gt;（生物素富集）</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素T1磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>65602</td><td>&lt;strong&gt;用于第11节中后捕获文库的生物素富集&lt;/strong&gt;（生物素富集和PCR扩增）</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>或任何适用于1.5 mL离心管的磁力架</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>经认证的胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>或任何其他品牌</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue共沉淀剂</td><td>Invitrogen</td><td>AM9515</td><td>&lt;strong&gt;用于第4节中的DNA共沉淀&lt;/strong&gt;（DNA纯化）</td></tr><tr><td>HiCUP</td><td>0.8.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII，100 U/&amp;micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104T</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Klenow EXO- 5000单位/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>低吸附滤芯吸头&amp;nbsp;(10 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L 和 1000 &amp;micro;L)</td><td>ZeroTip</td><td>PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000</td><td></td></tr><tr><td>M220 聚焦超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>500295</td><td></td></tr><tr><td>Micro TUBE AFA Fiber 预切裂口卡扣盖 6 x 16 mm 管</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>&lt;strong&gt;用于第6节中的超声处理&lt;/strong&gt;（超声处理）</td></tr><tr><td>NheI-HF，100 U/&amp;micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>R3131M</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶分子生物学级水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>用于质量控制的PCR引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PCR排管&amp;nbsp;和管盖</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022, 401425</td><td></td></tr><tr><td>酚:氯仿:异戊醇 25:24:1，用含10 mM Tris（pH 8.0）、1 mM EDTA的溶液饱和</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&amp;nbsp;高保真PCR预混液（含HF缓冲液）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531L</td><td>&lt;strong&gt;用于第9节中&lt;/strong&gt;文库扩增（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;和第11节&lt;/strong&gt;（生物素富集和PCR扩增）</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>重组蛋白酶K，PCR级</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x dsDNA 高灵敏度检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q33230</td><td>&lt;strong&gt;用于第4节中沉淀后DNA的定量&lt;/strong&gt;（DNA纯化）</td></tr><tr><td>Qubit检测管</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>rCutsmart缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基 1x + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>或任何其他品牌</td></tr><tr><td>SDS - 分子生物学用10%溶液</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0676</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠 pH 5.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect 定制3-5.9 Mb文库</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td><td>定制的小鼠或人源捕获系统，用于靶向捕获</td></tr><tr><td>SureSelect 靶向富集试剂盒Box 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-8645</td><td>&lt;strong&gt;用于靶向捕获&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SureSelect 靶向富集试剂盒 ILM PE 全接头</td><td>Agilent Technologies</td><td>931107</td><td>&lt;strong&gt;用于靶向捕获&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶 1 U/&amp;micro;L</td><td>Invitrogen</td><td>15224025</td><td>&lt;strong&gt;用于第3节中的连接反应&lt;/strong&gt;（连接与去交联）</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶 2000000/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>&lt;strong&gt;用于第9节中的连接反应&lt;/strong&gt;（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）</td></tr><tr><td>T4 DNA聚合酶 3000单位/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000单位/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4200仪器</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>&lt;strong&gt;用于第9节中的自动化电泳&lt;/strong&gt;（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）&lt;strong&gt;和&lt;br/&gt;第11节&lt;/strong&gt;（生物素富集和PCR扩增）。任何其他自动化电泳系统均可使用</td></tr><tr><td>Tapestation试剂</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,</td><td>&lt;strong&gt;用于第9节中的自动化电泳&lt;/strong&gt;（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）&lt;strong&gt;和&lt;br/&gt;第11节&lt;/strong&gt;（生物素富集和PCR扩增）。任何其他自动化电泳系统均可使用</td></tr><tr><td>分子生物学级Triton X-100</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

时空特异性的基因转录受到远端调控元件（如增强子和沉默子）的严格调控，这些元件依赖于与靶基因启动子的物理邻近来控制转录。尽管这些调控元件易于识别，但其靶基因却难以预测，因为大多数调控元件具有细胞类型特异性，并且在线性基因组序列中可能与靶基因相距数十万碱基对，中间跨越了多个非靶基因。多年来，启动子捕获高通量染色体构象捕获技术（Promoter Capture Hi-C, PCHi-C）一直是将远端调控元件与其靶基因关联的金标准。然而，PCHi-C 需要数百万个细胞，限制了其在稀有细胞群体（例如常从原代组织中获得的细胞）研究中的应用。为了克服这一限制，已开发出一种低成本且可定制的低起始量捕获 Hi-C 技术（low input Capture Hi-C, liCHi-C），用于鉴定调控基因组中每个基因的远端调控元件谱。liCHi-C 采用与 PCHi-C 相似的实验和计算框架，但通过尽量减少管转移步骤、调整&#160;试剂浓度和体积，以及替换或省略某些步骤，最大限度地减少了文库构建过程中的样本损失。&#160;总体而言，liCHi-C 使得在发育生物学和细胞功能背景下研究基因调控及基因组的时空组织成为可能。

liCHi-C 能够以低至 50,000 个细胞生成高质量、高分辨率的全基因组启动子互作图谱文库53。这不仅通过大幅降低反应体积并在整个实验流程中使用低吸附 DNA 塑料耗材实现，还通过从原始方案中去除若干导致显著材料损失的非必要步骤达成。这些步骤包括交联逆转后的苯酚纯化、生物素去除，以及后续的苯酚-氯仿纯化和乙醇沉淀。此外，重新组织 Hi-C 文库构建步骤（包括生物素下拉、A 尾修饰、接头连接、PCR 扩增和双端磁珠筛选，以及 PCR 产物纯化）使我们能够进一步去除另一个不必要的 DNA 纯化步骤。实验流程概览见图 1A。
为评估文库质量，需在整个实验流程中进行多项质控，其中第一项为计算基因组消化效率；通常认为超过 80% 的数值是可接受的（表 3）。建议在独立实验中检测特定细胞类型的消化效率，以避免在单次 liCHi-C 实验中损失大量样本材料。第二，在超声破碎与末端修复之前，建议通过常规 PCR 扩增细胞类型不变的染色质相互作用，以检测...

基因表达受到基因启动子与远端调控元件相互作用的调控。本文介绍了低起始量的捕获染色体构象捕获技术（liCHi-C）如何实现对稀有细胞类型中这些相互作用的鉴定，而这些细胞类型在此前是无法测量的。

时空基因转录受到远端调控元件（如增强子和沉默子）的严格调控，这些元件依赖于物理上的邻近性……

利用LeTech，我们试图回答的主要问题是染色质在细胞核内如何相互作用，从而理解基因调控的一个新层面。我们已通过LeTech证明，可以探索特定样本的基因组结构，将与疾病相关的非编码突变与潜在受影响的基因联系起来，并检测染色体重排（例如在肿瘤样本中的易位）。现在，我们能够研究瘢痕细胞类型（如原代干细胞或相关临床样本）的三维染色质结构。本方案减少了探索限制性酶切片段分辨率下基因组结构所需投入的材料、时间和成本，从而获得高质量数据。LeTech 扩展了三维染色质结构研究领域的应用范围，使我们能够分析此前无法研究的新细胞类型。得益于 LeTech，科学界可探究特定肿瘤内染色体亚群中基因表达的特殊调控机制，例如恶性转化过程中的调控。首先，取一份冷冻的稀有细胞，加入一毫升冷裂解缓冲液以破坏细胞膜。将细胞在冰上孵育30分钟，每5分钟颠倒混匀一次。在1000 × g离心10分钟，弃去上清液，并将细胞核重悬于500微升冰冷的1.25 × 限制性缓冲液2中。然后，加入 5.5 µL 的 10% 十二烷基硫酸钠。涡旋混匀后，在温控金属块中孵育。接着通过加入 37.5 µL 的 10% Triton X-100 终止 SDS 的作用。按照之前演示的方法混合并孵育样品。加入7.5 µL的hint three以消化染色质，混匀溶液，并在37°C下孵育过夜。首先，取已消化的稀有细胞DNA，置于冰上。使用所需的试剂配制主混合液，以填补并进行限制性片段突出末端的生物素标记。将样品在37摄氏度孵育75分钟，每15分钟翻转混匀一次。将样品置于冰上冷却，然后通过配制含有连接反应所需试剂的主混合液，对填补后的DNA末端进行连接。最后，将样品在16摄氏度孵育4至6小时，然后在室温下孵育30分钟。加入30微升浓度为10毫克/毫升的蛋白酶K溶液，以解除染色质的交联。混匀溶液，并在65摄氏度下过夜孵育。纯化DNA后，开始取稀有细胞中连接并去交联的消化染色质。将水浴超声仪设置为20%的占空因数，峰值入射功率为每脉冲50至200个循环，持续65秒，温度范围为6至10摄氏度，对连接并去交联的消化染色质进行超声处理。样品末端修复后，将每份样品150微升C1链霉亲和素磁珠转移至1.5毫升离心管中。将它们置于1.5毫升管磁铁上，等待所有磁珠吸附至管壁。随后移除上清液，保留磁珠。接下来，加入400 µL吐温缓冲液洗涤磁珠，并通过轻柔涡旋振荡重新悬浮磁珠。将离心管放回磁力架，直至所有磁珠吸附在管壁上。然后移除上清液，保留磁珠。将磁珠重悬于300 µL的2×无Tween缓冲液（NTB）中，随后与300 µL样品混合。最后，在室温下旋转孵育15分钟，利用生物素沉淀含有信息的DNA片段。首先，取用生物素富集的稀有细胞DNA片段。通过加入dATP加尾所需的试剂配制主混合液，并将样品在37摄氏度下孵育30分钟。然后将样品在65摄氏度孵育10分钟，以灭活Klenow exo-minus，随后在冰上冷却。用300微升TB缓冲液、NTB缓冲液及100微升连接缓冲液依次洗涤磁珠后，将磁珠重悬于50微升连接缓冲液中。向样品中加入4微升15微摩尔的预退火接头混合物以及1微升2000单位/微升的T4 DNA连接酶。用400 µL TB、200 µL NTB 和100 µL 限制性缓冲液二洗涤磁珠。PCR扩增文库后，将同一样本的所有50 µL反应产物合并至一个1.5 mL DNA低吸附离心管中。将离心管置于磁力架上，静置直至所有磁珠吸附至管壁。将含有文库的上清液转移至新的1.5毫升DNA低吸附离心管中，并用TLE缓冲液补至500微升。若要使用磁性珠纯化进行双端筛选，向文库中加入200微升储存态磁珠，涡旋混匀后于室温旋转孵育10分钟。随后将文库置于磁力架上，静置直至所有磁珠吸附至管壁。 将含有文库的上清液转移至一个新的1.5毫升DNA低吸附离心管中。取750微升磁珠储备液，放入1.5毫升离心管中，并置于磁力架上，使磁珠充分聚集。待所有磁珠吸附至管壁后，吸除上清液，再加入300微升新的磁珠储备液，通过涡旋振荡重悬磁珠。向样品中加入 300 µL 浓缩珠。通过涡旋混合，并在室温下旋转孵育 10 分钟。置于磁铁上。等待所有磁珠完全吸附至管壁后，移除上清液。向磁珠所在的管中加入1毫升70%乙醇进行洗涤，磁珠仍置于磁力架上。让磁珠自然风干，然后加入21微升TLE缓冲液，通过涡旋振荡重悬磁珠。为从磁珠上洗脱文库，将样品置于恒温金属浴中，在37摄氏度孵育10分钟。将离心管置于磁力架上，转移含有文库的上清液至新的1.5毫升低吸附DNA管中。首先取500至1000纳克的稀有细胞DNA文库。使用真空浓缩仪将DNA干燥，并用3.4 µL无核酸酶水重悬。加入阻断剂后，在65 °C的热循环仪中孵育时，将含生物素标记RNA的杂交溶液转移至已阻断的文库中。将管盖牢固闭合后，在65 °C热循环仪中孵育过夜。然后将每份样品50 µL的T1链霉亲和素磁珠转移至一个1.5 mL DNA低吸附离心管中，并将管子置于1.5 mL管磁力架上。待所有磁珠吸附至管壁后，小心移除上清液，保留磁珠。随后用200 µL靶向富集试剂盒中的结合缓冲液对磁珠洗涤三次，并将磁珠重悬于200 µL结合缓冲液中。将样品转移至热循环仪中的重悬珠子中，孵育30分钟。用200微升洗涤缓冲液一在室温下旋转孵育15分钟后，洗涤珠子。随后用200微升预热至65摄氏度的洗涤缓冲液二洗涤珠子三次，并在温控金属块中孵育。最后，在通过PCR扩增文库后，向样品中加入270微升磁珠储备液，涡旋混匀，使用磁性 beads 进行DNA纯化。在捕获前对文库进行自动化电泳分析，结果显示在20微升反应体系中DNA浓度为49.7纳克/微升。然而，对构建完成的lech文库进行高灵敏度自动化电泳分析，仅获得3.06纳克/微升的DNA。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

研究稀缺细胞群中以启动子为中心的时空基因组结构的集成工作流程

DNA 调控元件（如增强子）通过与靶基因启动子发生物理接触来调控基因表达，这种接触通常通过跨越较大基因组距离的长距离染色体相互作用实现。启动子捕获...

启动子捕获Hi-C：启动子相互作用的高分辨率全基因组分析

本文介绍的方法结合微图形化技术与定量成像，以揭示哺乳动物细胞培养物中的空间组织结构。该技术易于在标准的细胞生物学实验室中建立，为体外研究模式形成提供了一个可操作的实验系统。...

利用微图形技术和定量成像技术绘制哺乳动物细胞的自组织空间结构

我们报道了在由胚胎干细胞生成的拟胚体中应用定量染色体构象捕获技术并结合高通量测序的方法。该技术可用于鉴定和定量分析在胚胎干细胞分化过程中特定基因的潜在增强子与启动子区域之间的相互作用。...

通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

在此，作者展示了MULTI-seq在表型分析及后续配对的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq）中的应用价值，用于表征视网膜中的转录组和染色质可及性谱型。...

利用单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序对视网膜基因表达与染色质可及性进行多重分析

本方案描述了一种利用可重复使用的单个细胞进行多轮表观基因组分析的单细胞方法。这种可重复使用的单个细胞允许在同一个单细胞中分析多种表观遗传标记，并对结果进行统计学验证。...

可重复使用的单细胞用于迭代表观基因组分析

我们提供一种无需编程的生物学家工作流程，仅使用基于浏览器的工具即可识别组织特异性基因增强子。本方案利用公共的H3K4me1/H3K27ac组蛋白修饰标记和Hi-C数据，使不具备编程经验的研究人员也能够获取、分析并识别与其目标基因相关的潜在调控元件。...

一种用于筛选基因和组织特异性增强子的基于网络的分析流程

本方案提供了一条简化的计算流程，用于定量新生增强子转录本。通过整合染色质可及性、染色质特征和转录数据，该方法能够在复杂的基因内区域实现对增强子活性的准确检测和链特异性分析，同时适用于不具备深入生物信息学训练背景的研究人员。...

小鼠胚胎干细胞中基因间/基因内增强子RNA定量的计算分析流程

本文介绍了一种快速简便的ATAC-seq实验方案，仅需30 µL线虫沉淀，即可应用于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

完整 Caenorhabditis elegans L4 幼虫中的染色质可及性分析

本研究提出了一种空间Trekker–CUT&amp;#38;Tag多组学方案，将组织切片的直接空间条形码技术与单细胞多组学分析相结合。该方法能够同时实现基因表达和组蛋白H3K27ac修饰的空间解析单细胞谱型分析，为在组织微解剖背景下理解基因调控机制提供了深入见解。...

空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

本方案描述了如何在克隆水平上评估大量基因的表达。单细胞逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）可对数百个样本和基因产生高度可靠且灵敏度强的结果。...

利用多重RT-qPCR进行单细胞基因表达分析以表征稀有淋巴细胞群体的异质性

了解低输入量Capture Hi-C（liCHi-C）技术如何分析稀缺细胞类型中的染色质相互作用。该方法可识别基因启动子与远端调控元件的相互作用，有助于研究基因调控机制及肿瘤样本中的染色体重排。

一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

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