Name: 集成光声、超声和血管造影断层扫描 （PAUSAT） 用于缺血性卒中的无创全脑成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 了解集成光声、超声和血管造影断层扫描（PAUSAT）技术，用于缺血性卒中的无创全脑成像。该方法结合光声成像与声学血管造影，可在麻醉小鼠模型中实时评估脑血流与组织氧合变化。

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作者谨此感谢 SonoVol 公司工程团队提供的技术支持。本工作部分由美国心脏协会协作科学奖（18CSA34080277）资助，授予 J. Yao 和 W. Yang；美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R21EB027981、R21 EB027304、RF1 NS115581（BRAIN 计划）、R01 NS111039、R01 EB028143；美国国家科学基金会（NSF）CAREER 奖 2144788；Chan Zuckerberg 倡议基金（2020-226178），授予 J. Yao；以及 NIH 资助项目 R21NS127163 和 R01NS099590，授予 W. Yang。

所有动物实验程序均经杜克大学医学中心动物护理和使用委员会批准，并依照美国公共卫生署关于实验动物人道护理和使用的政策进行。本研究使用雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠（见材料表）。每种卒中模型组至少对三只动物进行成像。本方案所遵循的工作流程见图2。
<img alt="小鼠脑卒中模型pMCAO/PT成像：TTC染色、光声成像、血管造影、B型扫描结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65319/65319fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：应用于脑卒中的PAUSAT成像实验流程概要。 使用Biorender.com创建。该图展示了成像流程的工作路径，起始于（A）两种主要的脑卒中模型（pMCAO和PT脑卒中）。（B）在将动物放置于PAUSAT膜上之前，必须进行眶后注射微泡。（C）该实验装置需要使用麻醉面罩以维持持续麻醉，以及加热垫以保持动物体温稳定。动物身体置于加热垫上，头部则放置于系统膜上。（D）图像采集的顺序也在图中显示。（E）本研究中通过TTC染色来验证实验结果。DPI：损伤后天数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65319/65319fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 诱导小鼠脑卒中模型
<ol>
	<li>永久性大脑中动脉阻塞（pMCAO）联合颈总动脉（CCA）结扎。 
	注意：简而言之，对右侧颈总动脉进行永久性结扎，并通过电凝法对右侧大脑中动脉（MCA）进行后部烧灼17。该操作可限制脑部右侧皮层的脑血流，从而诱发缺血性脑卒中18。
	<ol>
		<li>在诱导室中使用含5.0%异氟烷的吸入性混合气体（30% O2/70% N2）诱导麻醉，直至动物意识丧失（以足底反射消失为判断依据）。</li>
		<li>使用20 G导管（材料表）对动物进行插管，并连接至自动呼吸机。根据动物体重设定气体流速，并以1.5%-2.0%异氟烷（30% O2/70% N2）维持麻醉状态。</li>
		<li>使用加热灯及连接至温控装置的直肠探头，将动物体温维持在37 °C。</li>
		<li>在小鼠眼部滴加一滴润滑性眼膏。</li>
		<li>将动物置于仰卧位，使用修毛器去除颈部区域的毛发。</li>
		<li>先用含聚维酮碘的棉签清洁皮肤区域，再用70%乙醇浸润的无菌纱布擦拭，重复三次。</li>
		<li>通过轻捏动物后肢足掌，确认麻醉深度及无痛反应。</li>
		<li>在颈部正中线做一条0.8 cm的矢状切口，暴露右侧颈总动脉（CCA）。</li>
		<li>准备用于CCA结扎的缝线：将4-0丝线拆分为更细的股线，取其中一股约1.5 cm长度，用于永久结扎CCA。 
		注意：打结紧固后，将结外多余线头剪除，剪切位置距离结约1-2 mm。</li>
		<li>缝合伤口前滴加一滴布比卡因。</li>
		<li>使用间断的4-0丝线外科缝合线关闭切口，并在表面涂抹三层抗生素软膏以预防感染。</li>
		<li>将小鼠翻转，使其右侧身体朝上。</li>
		<li>
		<div>使用修毛器去除耳部与眼部之间区域的毛发。</div>
		</li>
		<li>
		<div>先用含聚维酮碘的棉签消毒手术区域，再用70%乙醇浸润的无菌纱布擦拭，重复三次。</div>
		</li>
		<li>
		<div>铺设无菌手术巾以保护手术区域，随后在动物右眼与右耳之间做一条0.5 cm切口，暴露颅骨与颞肌交界处。</div>
		</li>
		<li>使用电凝环对肌肉进行电凝分离，使其脱离颅骨，暴露大脑中动脉（MCA）区域。</li>
		<li>使用电动钻头钻出一个0.2 mm2的窗口以暴露MCA，并对MCA进行电凝以阻断血流。 
		注意：单次80%功率强度的脉冲足以完成MCA电凝。</li>
		<li>使用连接27G针头的1 mL注射器，在手术部位滴加一滴布比卡因（材料表）。</li>
		<li>使用间断的6-0透明单股缝合线关闭皮肤切口，并在表面涂抹三层抗生素软膏以预防感染。</li>
		<li>手术完成后，将动物转移至温度可控的孵育箱（32 °C）中，使其恢复。</li>
		<li>2小时后，将动物转移回其饲养笼，并自由提供食物和饮水 ad libitum。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光化学法脑卒中（PT脑卒中） 
	注意：简而言之，PT脑卒中通过在脑血管内照射玫瑰红（Rose Bengal）实现。玫瑰红经腹腔注射后，约5分钟内广泛分布于全身，随后使用绿色冷光源照射，激活玫瑰红产生活性氧（ROS）。ROS损伤血管内皮细胞膜，导致照射区域内广泛形成血栓，从而引起局部脑血流中断19。
	<ol>
		<li>在诱导室中使用含5.0%异氟烷的吸入性混合气体（30% O2/70% N2）诱导麻醉，直至动物意识丧失（以足底反射消失为判断依据）。</li>
		<li>将动物固定于立体定位仪上，通过面罩持续给予1.5%-2.0%异氟烷（30% O2/70% N2）以维持麻醉。</li>
		<li>使用循环热水加热装置及直肠探头监测并维持动物体温在37 °C。</li>
		<li>在小鼠眼部滴加一滴润滑性眼膏。</li>
		<li>使用修毛器剃除动物头部毛发。</li>
		<li>使用含聚维酮碘的棉签清洁剃毛后的头皮区域，再用70%乙醇浸润的无菌纱布擦拭，重复三次。</li>
		<li>通过轻捏动物后肢足掌，确认无痛反应。</li>
		<li>使用手术刀在头皮正中线做一条1.4 cm的矢状切口，暴露颅骨。</li>
		<li>使用尖头铅笔在冠状缝向右侧1.5 mm处做一标记。</li>
		<li>将一个直径为2.5 mm的圆形针孔对准1.5 mm标记中心放置。 
		注意：可使用双面黑色胶带制作一个中央带有2.5 mm直径圆孔的方形遮光片，使用对应尺寸的单孔打孔器即可完成。</li>
		<li>将绿色冷光源对准圆形针孔，尽量减小光源与针孔之间的间隙。</li>
		<li>使用铝箔覆盖周围区域，防止光线扩散。</li>
		<li>准备就绪后，经腹腔注射10 mg/kg玫瑰红（10 mg/mL，溶于1×磷酸盐缓冲液[PBS]），随后等待5分钟。</li>
		<li>5分钟后，开启冷光源（强度：4.25），持续照射15分钟。</li>
		<li>关闭冷光源后，可通过肉眼观察（预期区域较周围组织更苍白）或使用外部设备检测脑血流变化（例如激光散斑对比成像（材料表）；参见步骤5.1）来确认脑卒中是否成功。</li>
		<li>使用连接27G针头的1 mL注射器，在手术部位滴加一滴布比卡因（材料表）。</li>
		<li>使用间断的6-0透明单股缝合线关闭皮肤切口，并在表面涂抹三层抗生素软膏以预防感染。</li>
		<li>手术完成后，将动物转移至温度可控的孵育箱（32 °C）中，使其恢复。</li>
		<li>2小时后，将动物转移回其饲养笼，并自由提供食物和饮水 ad libitum。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备PAUSAT用于成像
<ol>
	<li>打开 532 nm 激光器，并预热 15 分钟。</li>
	<li>为麻醉动物准备成像平台。
	<ol>
		<li>将连接至手动可调载物台（图 2C）的定制斜坡放置在成像膜旁边（材料表）。</li>
		<li>将带有呼吸管的小鼠门齿固定器连接至定制斜坡，并在斜坡表面固定加热垫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>激光器预热完成后，使用近红外探测卡（材料表）检查激光光路及光纤束耦合是否对准：将探测卡置于光纤束输入端前方，确保激光光束进入光纤束。 
	​注意：根据需要调整激光光路中的任何反射镜，以确保激光输入与光纤束输入中心对齐。</li>
</ol>
3. 为动物准备PAUSAT
注意：PAUSAT 在 PT 脑卒中手术后 1 天或 pMCAO 手术后 3 天进行。成像前的 PAUSAT 准备（步骤 2）约需 20 分钟，应在动物准备接受 PAUSAT 前立即进行。
<ol>
	<li>使用5%异氟烷与30% O2/70% N2的吸入混合气体，在诱导室中诱导麻醉，直至动物意识丧失（以足底反射消失为判断依据）。</li>
	<li>将动物转移至带有门齿固定器和面罩的加热平台，并以1.5%-2.0%异氟烷维持在30% O2/70% N2混合气体中的麻醉状态。</li>
	<li>使用加热灯及连接至温控装置的直肠探头，维持动物体温在37 °C。</li>
	<li>使用电动剃须刀修剪动物头部顶部的毛发，范围包括从眼睛附近至耳后区域。</li>
	<li>涂抹市售脱毛膏以彻底清除残留的短毛，完成头部顶部脱毛。脱毛膏在皮肤上保留5-6分钟，然后用蘸水的棉签擦拭以彻底清除脱毛膏。重复操作直至皮肤完全无毛。 
	注意：若在手术后1天进行成像，可在手术开始前执行此步骤；在光栓法脑卒中模型术后1天时，可省略此步骤。当PAUSAT成像在手术后数天进行时，此步骤必须执行。</li>
	<li>当动物和成像系统均已准备就绪，在将动物转移至系统平台前，使用27 G针头经眼后眶注射100 µL微泡溶液（原液浓度，见材料表）。 
	​注意：微泡进入血液循环后，有效成像时间有限（约10分钟），需在此时间内完成成像以避免信号显著衰减。</li>
	<li>在小鼠眼睛上滴加一滴眼部保护液。 
	注意：为避免外源物质进入动物血液循环，不建议在完成眼后眶注射前使用眼用润滑剂。因此，脱毛膏的涂抹必须缓慢且小心，避免过于靠近眼睛（但需充分暴露预期发生脑卒中的目标区域）。脱毛膏的清除应使用预先蘸水的棉签，防止脱毛膏滴落对眼睛造成损伤。</li>
</ol>
4. PAUSAT 成像
注意：这是为了在脑卒中后对大脑的对侧和同侧区域进行成像
<ol>
	<li>将小鼠转移至集成的 PAUSAT（材料表）成像平台，使其仰卧于定制的斜坡上（图 2C）。</li>
	<li>在成像窗口表面加入足量蒸馏水以实现声学耦合。 
	注意：建议使用3D打印机打印的可选斜坡，以防止动物身体在图像采集过程中被浸湿，提高动物舒适度，并有助于维持稳定的体温。此外，该斜坡可连接至手动载物台（材料表），用于调节双元件摆动换能器相对于小鼠头部的焦深。定制斜坡的设计文件可向作者索取。</li>
	<li>将小鼠头部固定于门齿夹中，并确保麻醉适当且气流通畅。</li>
	<li>使用连接至温控设备的加热灯和直肠探针，将动物体温维持在 37 °C。</li>
	<li>打开成像软件（材料表），进入B模式超声界面。</li>
	<li>利用实时超声窗口手动调整小鼠头部至所需位置。</li>
	<li>利用实时超声窗口调节载物台高度，使换能器的焦深（19 mm）大致位于待成像区域的中心。</li>
	<li>进行B模式超声成像
	<ol>
		<li>调整B模式下的超声发射频率（本研究中使用 16 MHz）。</li>
		<li>在成像软件中输入保存目录信息。</li>
		<li>使用浮动框选择大脑B模式扫描的感兴趣区域。</li>
		<li>按下 Acquire Static 按钮。</li>
		<li>图像采集完成后，在软件中检查扫描结果，确保已成功成像目标区域。 
		注意：应避免B模式成像过程中的不必要延迟，以确保在进行声学血管造影（AA）时血液中仍有足够浓度的微泡存在。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行声学血管造影（AA）成像
	<ol>
		<li>返回至 Image Acquisition 界面。</li>
		<li>在成像软件中切换至 Acoustic Angiography 模式（材料表）。</li>
		<li>输入所需的扫描协议参数（其中最重要的是帧间距和每位置帧数，本研究中分别设为 0.2 mm 和 10）。</li>
		<li>按下 Acquire Static 按钮。 
		注意：AA 成像所需时间长于 B 模式超声成像。</li>
		<li>扫描完成后，在 Image Analysis 中检查扫描结果，确保图像质量符合预期。 
		注意：为获得更具代表性的全脑体积图像，可在脑内不同焦深处重复进行第二次扫描，并通过适当的后期处理将图像合并（见 图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行光声断层扫描（PAT）成像
	<ol>
		<li>打开光学参量振荡器（OPO）软件（材料表），将其设定为 756 nm。 
		注意：OPO 容易失准，因此实验前应使用独立光谱仪确认其已正确校准。</li>
		<li>手动平移线阵换能器至先前确定的坐标位置，以确保摆动换能器与线阵换能器的成像体积能够自动共定位。 
		注意：必须事先使用幻影网格进行共定位实验，以确定载物台所需平移的精确距离，从而使两个换能器获取的数据在三维空间中实现共定位。</li>
		<li>打开激光软件，并开启 532 nm 激光。</li>
		<li>使用激光功率计测量激光输出能量，并确保其达到所需能量（本研究中每脉冲约使用 10 mJ）。</li>
		<li>选择 PAT 所需的扫描参数（步长 0.4 mm，扫描长度 20 mm，每位置平均 10 帧）。</li>
		<li>打开超声数据采集系统的 MATLAB 程序（材料表），点击 Run 按钮。</li>
		<li>按下 Start 按钮以开始 PAT 扫描。</li>
		<li>扫描完成后，打开 MATLAB 保存程序，将保存文件名更改为所需名称，然后点击 Run 按钮。</li>
		<li>将 OPO 波长更改为 798 nm，并重复步骤 4.10.3 至 4.10.8。 
		​注意：对于纵向研究，建议在完成 PAUSAT 成像后，将动物置于培养箱中并观察数小时以促使其恢复（参照步骤 1.1.18 和 1.1.19）。如需立即验证结果，可在 PAUSAT 成像后直接进入第 5 节。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 可选：结果验证
<ol>
	<li>激光散斑对比成像（LSCI）。
	<ol>
		<li>使用30% O2/70% N2混合气体中含1.5%-2.0%异氟烷对动物进行麻醉。</li>
		<li>将动物固定于立体定位仪上，并通过面罩持续给予上述吸入性麻醉剂以维持麻醉状态。</li>
		<li>使用循环热水加热装置及直肠探头监测体温，保持动物体温在37 °C。</li>
		<li>在小鼠眼睛上滴加一滴护眼润肤液。</li>
		<li>轻轻夹捏动物后肢足掌，确认其无疼痛反应。</li>
		<li>使用修毛器去除动物头皮上的毛发。</li>
		<li>用含聚维酮碘的棉签消毒手术区域，随后用70%乙醇的无菌纱布擦拭，重复此步骤三次。</li>
		<li>沿头皮中线做一条1.4 mm的矢状切口，暴露颅骨。使用镊子牵拉头皮，避免其遮挡待扫描的脑区。</li>
		<li>在颅骨表面滴加数滴生理盐水，并将激光散斑对比成像系统设备（材料表）置于动物头部上方。</li>
		<li>在文件菜单下，选择子菜单工作模式中的在线模式。</li>
		<li>在文件菜单的保存设置子菜单中，选择默认的图像存储文件夹。</li>
		<li>在光源菜单中，开启导引激光（“激光开”）和白光（“白光开”），以准确定位成像窗口的位置。</li>
		<li>在设置菜单中选择放大倍数设置，手动将光标移至2.5，点击应用和确定以保存设置。</li>
		<li>通过手动调节主页面顶部子菜单中的焦距滑杆来调整焦距。</li>
		<li>在设置菜单中选择伪彩色阈值设置，根据需要调节阈值，点击应用和确定以保存设置。</li>
		<li>在开始采集图像前，在光源菜单中关闭导引激光（“激光关”）和白光（“白光关”）。</li>
		<li>点击主页面顶部子菜单中的播放按钮以开始采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氯化三苯基四氮唑（TTC）染色
	<ol>
		<li>使用30% O2/70% N2混合气体中含5%异氟烷对动物进行深度麻醉。</li>
		<li>待动物呼吸停止后，使用锋利剪刀进行断头。</li>
		<li>去除头部周围的所有皮肤及颈部区域的肌肉。</li>
		<li>在颅骨枕部做矢状切口，直至顶骨区域。</li>
		<li>在血管下方左右两侧各做一水平切口（约5 mm），使用直头镊子去除颅骨枕骨部分。</li>
		<li>在颅骨额鼻缝处做一切口（约5 mm）。</li>
		<li>在颅骨中线（两半球之间）做一矢状切口（约10-15 mm），确保两半球完全分离。</li>
		<li>使用#7号弯头剪刀从中心向两侧剪除左右顶骨部分。</li>
		<li>将脑组织转移至含有5 mL冰上预冷的1x PBS的容器中，冰上保存10分钟。</li>
		<li>将脑组织转移至不锈钢脑切片模具中（切片厚度为1 mm）。</li>
		<li>使用一次性剃须刀片对脑组织进行1 mm厚度的冠状切片（材料表）。</li>
		<li>手持刀片两侧，将切好的脑片转移至盛有冰上预冷1x PBS的容器中。</li>
		<li>小心地将各脑片逐片从刀片上分离。</li>
		<li>将脑切片转移至直径70 mm的培养皿中，加入5 mL含2% TTC（材料表，3）的1x PBS溶液。</li>
		<li>室温避光孵育15分钟。</li>
		<li>15分钟后弃去TTC溶液，更换为3 mL福尔马林溶液，继续避光孵育至少30分钟（室温）。</li>
		<li>最后将脑切片转移至透明塑料薄膜上，扫描样本图像，并在扫描图中包含标尺，以便后续测量时作为参考。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Non-Invasive Integrated PAUSAT Whole-Brain Imaging of Ischemic Stroke

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</ol>

作者声明本工作中不存在利益冲突。

该方法有几个关键环节，若操作不当，可能导致图像质量显著下降以及定量分析结果不准确。在PAUSAT成像中，用户操作错误最常导致的结果是信号缺失或信号强度极低，这两种情况可能由多种原因引起。其中一个原因是声学耦合出现问题。成像过程中，小鼠头部周围的水中若存在较大的气泡，往往会阻碍超声波传向或来自换能器，从而在三种成像模式的图像中均产生阴影区域。为避免此问题，需确保系统膜与待成像样本之间有充足的水。另一种情况是AA信号缺失，但PA信号却异常高，且与所用波长无关。这可能是由于毛发——尤其是深色毛发——干扰了光的吸收所致。为避免这一问题，必须事先将动物头部的毛发彻底剃除，直至肉眼无法辨识任何残留毛发为止。
关于AA成像，另一个可能出现并导致信号缺失或极弱的问题是循环系统中微泡浓度较低。如果微泡被过度稀释或注射不当，所获得的信号将非常微弱。眼后注射必须由经过良好培训的人员进行。另一个可能的原因是微泡注射与成像开始之间间隔时间过长，这会导致血液中微泡数量减少。为避免此问题，建议在注射微泡前先完成成像系统的准备工作，以便在注射后立即将动物转移至PAUSAT系统膜上。值得一提的是，当动物已放置在PA...

血液运输氧气（通过 血红蛋白）以及其它重要营养物质输送到身体各组织。当组织中的血液流动受阻（缺血）时，组织可能发生严重损伤，其中最直接的影响是由于缺乏氧气（缺氧）所致。缺血性脑卒中是由于大脑某一区域的血液供应中断所引起。缺血性脑卒中导致的脑损伤可在血管阻塞后数分钟内发生，并常造成严重的、持久的功能障碍1,2评估缺血性脑卒中后生理病理变化以及发现和测试新疗法的一个极具价值的策略是在实验室中使用小型动物模型。在实验室中发现的治疗方法旨在转化为临床应用，以改善患者的生活质量。然而，根据罗素（Russell）和伯奇（Burch）提出的“3R”原则——替代（replacement）、减少（reduction）和优化（refinement），在生物医学研究中使用动物必须经过审慎评估。3减少动物使用数量而不影响数据采集是减量原则的目标。在此基础上，通过非侵入性成像技术对病灶演变进行纵向评估，能够显著减少所需实验动物数量，同时最大限度地获取每只动物的实验信息。4.
光声断层成像（PAT）是一种结合了光学吸收对比度与超声成像空间分辨率的混合成像技术5。PAT 的成像机制如下：将一束激发激光脉冲照射到待成像的目标上。假设该目标在激发激光波长处吸收光，则其温度会上升。这种快速的温度升高会导致目标发生热弹性膨胀。膨胀过程会引发超声波从目标向外传播。通过在多个位置检测该超声波，可利用波从目标传播至探测器所需的时间，结合重建算法生成图像。PAT 能够探测深层组织中的光学吸收特性，这一点使其区别于超声成像——后者探测的是不同组织间声阻抗的边界5。在可见光和近红外光谱范围内，生物体内主要的强吸收生物分子包括血红蛋白、脂质、黑色素和水7。在脑卒中研究中，尤其关注的是血红蛋白。由于氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白具有不同的光学吸收光谱，因此可利用多个激发激光波长的 PAT 技术，确定该蛋白质两种状态的相对浓度。这使得可以在梗死区域内外量化血红蛋白的氧饱和度（sO2），即血液氧合水平8,9。这一参数在缺血性脑卒中中具有重要意义，因为它可以反映缺血后受损脑组织中的氧含量水平。
声学血管造影（AA）是一种对比增强型超声成像方法，特别适用于活体血管形态的成像in vivo10。该方法依赖于双元件摆动式换能器（一个低频元件和一个高频元件）与注入成像对象循环系统中的微泡造影剂联合使用。换能器的低频元件用于在微泡的共振频率下发射信号（例如 2 MHz），而高频元件则用于接收微泡的超谐波信号（例如 26 MHz）。当在共振频率下被激发时，微泡表现出强烈的非线性响应，产生周围体组织无法生成的超谐波信号11。通过使用高频元件接收信号，可确保仅检测到微泡的信号。由于微泡局限于血管内部，因此最终获得的是血管形态的血管造影图像。AA 是一种用于成像缺血性卒中的有力方法，因为流经循环系统的微泡无法通过阻塞的血管。这使得 AA 能够检测由于缺血性卒中导致无灌注的脑区，从而指示梗死区域。
缺血性脑卒中的临床前研究通常依赖组织学分析和行为学测试来评估脑卒中的位置和严重程度。氯化三苯基四氮唑（TTC）染色是一种常用的组织学分析方法，用于确定脑卒中梗死体积。然而，该方法仅可用于终点检测，因为它需要处死实验动物12。行为学测试可用于在多个时间点评估运动功能障碍，但无法提供定量的解剖或生理数值13。生物医学成像技术为无创、纵向研究缺血性脑卒中的影响提供了更为定量的方法9,14,15。然而，现有的成像技术（如小动物磁共振成像 [MRI]）可能成本高昂，无法同时提供结构和功能信息，或穿透深度有限（如大多数光学成像技术）。
本文结合了光声、超声和血管造影断层成像技术（PAUSAT；系统示意图见图1），可提供缺血性脑卒中后血流灌注和血氧水平的互补性结构与功能信息16。这两方面对于评估损伤严重程度以及监测恢复过程或治疗反应至关重要。采用这些集成成像方法可增加每只实验动物所获取的信息量，减少所需动物数量，从而在缺血性脑卒中潜在治疗方法的研究中提供更丰富的数据。
<img alt="光子系统示意图、光学激发、光谱学装置、532/756/798 nm 脉冲激光器、成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65319/65319fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：PAUSAT 系统示意图。（A）PAUSAT 系统的完整示意图，包括用于光声断层成像（PAT）的激光器和光学参量振荡器（OPO）。（B）PAUSAT 系统内部视图，包含两个超声换能器。双元件摆动式换能器用于B模式超声成像和声学显微成像（AA），线阵换能器用于光声断层成像（PAT）。两个换能器均安装在同一二维电动平台上，可进行扫描以生成三维数据。该图改编自16。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65319/65319fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>20 号导管</td><td>BD Insyte Autoguard Winged</td><td>381534</td><td>用于小鼠插管</td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>用于 TTC 染色脑组织以进行验证</td></tr><tr><td>532 nm 激光器</td><td>Quantel</td><td>Q-smart 850</td><td>用于泵浦 OPO 以实现光声断层成像（PAT）</td></tr><tr><td>自动呼吸机 Rovent Jr.</td><td>Kent Scientific</td><td>RV-JR</td><td>在手术过程中维持小鼠的麻醉状态</td></tr><tr><td>黑色编织丝线 4-0 USP</td><td>Surgical Specialties</td><td>SP116</td><td>用于 pMCAO 手术中颈部缝合</td></tr><tr><td>布比卡因</td><td>Hospira</td><td>0409-1159-18</td><td>手术关闭切口前使用</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Jackson Lab</td><td>#000664</td><td>用于缺血性脑卒中研究（2–6 月龄雄性/雌性）</td></tr><tr><td>透明缝线</td><td>Ethicon</td><td>8606</td><td>用于关闭切口（PT 脑卒中和 pMCAO）。透明缝线不会干扰 PAT 成像</td></tr><tr><td>冷光源 LED</td><td>Schott</td><td>KL 1600</td><td>用于诱导 PT 脑卒中</td></tr><tr><td>一次性剃刀片</td><td>Accutec Blades</td><td>74-0002</td><td>用于小鼠脑组织切片</td></tr><tr><td>电钻</td><td>JSDA</td><td>JD-700</td><td>在 pMCAO 手术中用于暴露大脑中动脉（MCA）</td></tr><tr><td>电凝工具</td><td>Wet-Field</td><td>Wet-Field Bipolar-RG</td><td>pMCAO 手术钻孔后用于止血</td></tr><tr><td>脱毛凝胶</td><td>Veet</td><td>8282651</td><td>成像前用于去除小鼠体毛</td></tr><tr><td>高温电凝环头</td><td>BOVIE 医疗公司</td><td>REF AA03</td><td>分离颞肌与颅骨时用于防止出血</td></tr><tr><td>红外探测卡</td><td>Thorlabs</td><td>VRC5</td><td>用于确保光路对准</td></tr><tr><td>激光功率计</td><td>Ophir</td><td>StarBright, P/N 7Z01580</td><td>可用于成像前校准激光能量</td></tr><tr><td>激光散斑成像系统</td><td>RWD 生命科学公司</td><td>RFLSI-III</td><td>可用于验证脑卒中手术的成功</td></tr><tr><td>润滑性眼膏</td><td>Soothe</td><td>AB31336</td><td>可用于防止眼睛干燥</td></tr><tr><td>手动可调载物台</td><td>Thorlabs</td><td>L490</td><td>与定制斜坡配合用于多焦深声学分辨光声成像（AA 成像）</td></tr><tr><td>改良型 Vega 成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>LLA00061</td><td>包含 B 模式/AA 和 PAT 换能器的系统</td></tr><tr><td>光学参量振荡器</td><td>Quantel</td><td>versaScan-L532</td><td>可在宽范围内调节激发波长</td></tr><tr><td>可编程超声系统</td><td>Verasonics</td><td>Vantage 256</td><td>用于系统的 PAT 部分</td></tr><tr><td>玫瑰红染料</td><td>Sigma</td><td>330000</td><td>用于诱导 PT 脑卒中</td></tr><tr><td>缝线</td><td>LOOK</td><td>SP116</td><td>用于颈总动脉（CCA）的永久性结扎</td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2</td><td>用于在实验过程中维持小鼠体温稳定</td></tr><tr><td>VesselVue 微泡造影剂</td><td>Perkin Elmer</td><td>P-4007001</td><td>用于声学血管造影（2.43 &amp;times; 10^9 微泡/mL）</td></tr></tbody></table>

集成光声、超声和血管造影断层成像（pausat）用于缺血性卒中全脑无创成像

Integrated Photoacoustic, Ultrasound, and Angiographic Tomography (PAUSAT) for NonInvasive Whole-Brain Imaging of Ischemic Stroke

本文介绍了一项利用我们新开发的无创成像系统开展的实验性缺血性脑卒中研究，该系统整合了三种基于声学的成像技术：光声成像、超声成像和血管造影断层成像（PAUSAT）。结合这三种成像模式，可实现对脑组织血氧水平的多光谱光声断层成像（PAT）、对脑组织的高频超声成像以及对脑血流灌注的声学血管造影成像。这一多模态成像平台可用于研究脑卒中后全脑范围内的脑灌注和血氧变化。研究评估了两种常用的缺血性脑卒中模型：永久性大脑中动脉闭塞（pMCAO）模型和光化学诱导血栓（PT）模型。利用PAUSAT系统对同一只小鼠在脑卒中前后进行脑部成像，并对两种模型进行了定量分析。该成像系统能够清晰显示缺血性脑卒中后的脑血管变化，包括与未受损侧（对侧）组织相比，卒中梗死区域（同侧）的血流灌注和血氧水平显著降低。上述结果通过激光散斑衬度成像和三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色得到了验证。此外，两种卒中模型的梗死体积均通过TTC染色作为金标准进行了测量和验证。本研究表明，PAUSAT系统可成为无创、纵向开展缺血性脑卒中临床前研究的有力工具。

脑内血管形态成像 
声学造影（AA）通过在循环系统中以微泡的共振频率对其进行激发，并接收微泡的超谐波响应，从而生成血管形态图像。通过使用固定在手动可调载物台上的定制斜坡装置（图2C），我们可以在两个不同的焦深位置对小鼠脑部进行AA模式成像。当目标区域较深时，较表浅的区域（如大脑皮层）图像分辨率和信号强度会降低（图3A）；反之亦然（图3B）。然而，通过获取两个不同焦深的图像并将其融合，AA图像可提供完整冠状切面的结构信息（图3C，D）。此外，通过使用电动载物台沿第三维度进行扫描，PAUSAT技术能够记录一系列覆盖用户所定义感兴趣区域（ROI）的冠状图像。这些图像序列可被配准并用于重建整个脑部或用户定义ROI的三维可视化图像。同时，本文还提供了进一步结果，表明利用PAUSAT采集图像所构建的三维信息，还可用于分析其他定量参数（如每搏...

本研究展示了一种基于多模态超声成像平台的无创成像技术，用于缺血性脑卒中的成像。该系统可通过光声成像量化脑组织的血氧水平，并通过声学血管造影评估脑部灌注损伤情况。

集成光声、超声和血管造影断层成像（PAUSAT）用于缺血性卒中全脑无创成像

本文介绍了一项利用我们新开发的非侵入性成像系统进行的实验性缺血性卒中研究，该系统整合了三种基于声学的成像技术……

存在一些实验挑战。例如，头皮中的毛发可能会在获取的图像中产生伪影。动物的年龄也起着关键作用，因为目前颅骨的厚度限制了对较深信号的检测。许多纯光学成像技术需要侵入性操作，且只能成像约一毫米的深度。通过PAUSAT，我们结合了超声和光学成像的优势，能够以完全安全且非侵入性的方式获取缺血性中风周围区域的结构和功能信息。能够在不同时间点对同一动物在有无治疗情况下的损伤进展进行评估，使我们能够收集到非常有价值的信息，同时减少不同研究所需的动物数量。我们一直在不断改进光声成像和超声成像的成像速度、成像深度、分辨率和对比度。借助更先进的成像系统，我们能够回答更基础的生物学问题，并评估新的实验性治疗方法。设置成像系统时，首先打开532纳米激光器并预热15分钟。接着，将连接至手动可调平台的定制斜坡放置在成像膜旁边。将带有连接呼吸管的小鼠牙齿固定器安装到斜坡上，并在斜坡表面固定加热垫。激光器预热完成后，将一块近红外探测卡置于光纤束输入端前方，通过确认激光光束进入光纤束来检查激光对准情况。开始动物准备：使用电动剃须刀将麻醉小鼠从眼睛附近至耳后头部的毛发剪短，并在头顶涂抹脱毛膏。静置五分钟之后，用湿润的棉签擦去乳膏。重复涂抹，直至头部皮肤完全脱毛。在将动物转移至系统平台前，使用27号针头向眼后静脉丛注射100 µL原液浓度的微泡。现在将一滴眼部保护液滴入眼睛。通过在成像窗口表面加入蒸馏水以实现声学耦合，开始PAUSAT成像。接着，将小鼠头部固定在门齿固定器上，并确保麻醉适当且气流通畅。使用加热灯和连接至温度控制器的直肠探头，将动物的体温维持在 37 摄氏度。打开成像应用程序并进入 B 模式超声界面。利用实时超声窗口手动调整小鼠头部至所需位置，并相应调节载物台高度。将B模式下的超声传输频率调整为16兆赫，然后在成像应用程序中输入保存目录信息。接下来，使用浮动框选择所需的大脑扫描区域。按下“获取静态图像”按钮，在图像采集完成后检查扫描结果，以确保目标区域成像清晰。进行声学血管造影成像时，返回图像采集界面，然后将模式更改为声学血管造影。接下来输入所需的扫描协议参数，将帧间距设置为0.2毫米，每个位置采集10帧图像。在图像分析中检查扫描结果，以确保图像质量。进行光声断层成像时，打开光参量振荡器（OPO）应用程序，并将其设置为 756 纳米，然后手动移动线性阵列换能器至先前确定的坐标位置，以自动实现摆动器扫描体积与线性阵列扫描体积的共定位。打开激光应用程序，并开启 532 纳米激光器。将扫描参数设置为 0.4 毫米步长、20 毫米扫描长度，每个位置平均采集 10 帧图像。现在打开超声数据采集系统 MATLAB 程序并按下运行按钮。接着，在扫描应用程序中按下开始按钮。扫描完成后，打开 MATLAB 保存程序，将保存文件名更改为所需的文件名，然后按下运行按钮；随后将 OPO 波长更改为 798

integrated-photoacoustic-ultrasound-angiographic-tomography-pausat

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科研

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神经科学

集成光声、超声和血管造影断层扫描 （PAUSAT） 用于缺血性卒中的无创全脑成像

来源：Giustetto, P., et. al., 非侵入性实质、血管与代谢性高频超声及光声大鼠深部脑成像。J. Vis. Exp.

无创高频超声与多普勒成像技术在大鼠脑血流动力学中的应用

来源： Upputuri, P. K., 等一种高性能紧凑型光声断层成像系统 体内 小动物脑成像 视频实验杂志...

使用光声断层成像技术对大鼠脑部进行活体成像

本研究介绍了一种在大鼠脑部进行无创高频超声和光声成像的新方案，通过将信号引导至动物颅骨上天然存在的颅骨孔，有效可视化深层皮层下区域及其血管模式。...

无创性高频超声与光声大鼠深部脑组织成像：实质、血管与代谢联合检测

基于紧凑型脉冲激光二极管的光声断层成像（PLD-PAT）系统用于高速成像 体内...

一种高性能紧凑型光声断层成像系统 体内 小动物脑成像

本文探讨了联合使用经颅磁刺激（TMS）与功能性磁共振成像（fMRI）以研究脑刺激对默认网络影响的方法学及相关注意事项。...

结合经颅磁刺激与功能性磁共振成像研究默认模式网络

本文研究了Theta-Burst经颅磁刺激对脆性X综合征患者以及自闭症谱系个体大脑皮层可塑性的影响。...

TMS：使用theta爆发模式探究脆性X综合征和自闭症患者突触可塑性的机制

本文研究了视觉相关状态依赖性对经颅磁刺激（TMS）诱发的动机性光幻视呈现的影响。...

状态依赖性对经颅磁刺激的影响：动机性光幻视行为研究

NeuroStar TMS 设备：实施经 FDA 批准的抑郁症治疗方案

急性缺血性卒中患者的预后取决于脑血流的迅速恢复。本方案旨在通过缩短围手术期各环节的时间，优化此类患者的管理，使从入院至再灌注的时间尽可能缩短。...

急性缺血性卒中血管内治疗的优化管理

本实验的总体目标是提供一种高度可重复的技术，用于在缺血性脑卒中大鼠模型中进行血脑屏障破坏的体内评估。...

一个 在体 内 缺血性中风大鼠模型中血脑屏障破坏的评估

了解集成光声、超声和血管造影断层扫描（PAUSAT）技术，用于缺血性卒中的无创全脑成像。该方法结合光声成像与声学血管造影，可在麻醉小鼠模型中实时评估脑血流与组织氧合变化。

集成光声、超声和血管造影断层成像（PAUSAT）用于缺血性卒中全脑无创成像

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