Name: 在多重血清学检测中同时检测不同抗体类别 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 了解双报告多重免疫检测技术，用于同时检测血清样本中的IgG和IgM抗体，提高莱姆病诊断的敏感性。该方法支持全球血清监测和病原体消除策略。

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本报告由 Luminex（美国德克萨斯州奥斯汀）资助。作者感谢 Matthew Silverman 博士（Biomedical Publishing Solutions，美国佛罗里达州巴拿马城；mattsilver@yahoo.com）在分析和科学编辑方面提供的协助。作者还感谢 tgcBIOMICS GmbH（德国宾根）的 Harald Klein 和 Christoph von Eichel-Streiber 提供本研究中使用的 Borrelia 抗原。用于技术检测验证和质量控制的人类血清样本来源如下：1）通过德国布伦瑞克赫尔姆霍兹感染研究中心流行病学系获取的德国抗 SARS-CoV-2 抗体多中心及连续流行病学研究样本；2）德国罗德维希市萨克森医院神经科。使用人类样本的许可已由德国汉诺威医学院伦理委员会批准（9086_BO_S_2020）。

本实验系列使用人血清样本已获得机构审查委员会/伦理委员会的适当批准。样本来源于一项德国全国性SARS-CoV-2血清流行率研究的匿名剩余材料14。使用人源样本的批准由德国汉诺威医学院伦理委员会（9086_BO_S_2020）授予。本研究共使用了21份人血清样本。
1. 使用人类样本的伦理审批
<ol>
	<li>获得使用人类样本的适当伦理审批。</li>
</ol>
2. 试剂与仪器
<ol>
	<li>人血清样本：使用既往诊断为莱姆病患者或经证实的血清样本进行技术检测验证和质量控制 伯氏疏螺旋体阴性免疫状态12,14.</li>
	<li>单报告基因仪器。使用双通道单报告基因仪器（材料表用于初步检测方法开发和技术验证。 
	注意：单报告系统包含两束激光：1）识别并量化微球特异性荧光，用于区分不同微球组（如使用时，分类通道）；2）检测并量化微球结合的目标特异性藻红蛋白（PE）荧光（报告通道；532 nm 激发， &#34;橙色&#34; 565-585 nm 发射）。因此，仅需使用单一抗体同种型类别（例如单个报告通道可同时分析IgG或IgM。
	<ol>
		<li>进行初步验证研究以评估抗-伯氏疏螺旋体 IgG 和 IgM，采用单一报告分子的96孔板格式，针对这两类抗体均使用PE标记的检测试剂。 
		注意：本实验旨在评估循环中针对特定抗原的IgG抗体 伯氏疏螺旋体 抗原VlsE和两种DbpA变体，以及针对抗原OspC的循环IgM作为代表性示例。该检测方法可扩展用于评估血清对其他抗原的免疫反应性伯氏疏螺旋体 抗原，根据需要12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双报告基因检测仪器。使用三通道双报告基因检测仪（材料表可实现同一反应中IgG/IgM的同步分析，用于双联IgM/IgG检测方法的开发与技术验证（详见下文）。该仪器共有3个荧光检测通道，其中2个为报告通道，用于检测靶向的Ig相关信号。 
	&#8203;注意：双报告系统配备三种激光：1）识别并量化微球集特异性荧光（分类通道）；2）检测并量化目标特异性藻红蛋白（PE）荧光（报告通道1；532 nm激发， &#34;橙色&#34; 565-585 nm 发射），以及 3）评估第二种目标分析物的靶标特异性 Brilliant Violet 421（BV421）荧光（报告通道 2；405 nm 激发， &#34;蓝色&#34; 421-441 nm 发射光）。双报告系统适用于 96 孔和 384 孔微孔板（半自动化操作）检测模式。通用检测方案如图所示 图1方案步骤如下所述。</li>
</ol>
3. 抗原偶联
<ol>
	<li>使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）/磺基-N-羟基琥珀酰亚胺（sNHS）化学方法，将 Borrelia 抗原偶联至磁性、羧基化且荧光编码的6.5µm微球（微珠；材料表）。 
	注：详细操作步骤参见文献11和文献12。各抗原的偶联浓度见表1。偶联后的微珠应避光保存于4 °C，直至使用。偶联和检测反应中使用的所有缓冲液详见补充材料。</li>
</ol>
4. 检测步骤：单报告基因IgG或IgM血清学检测：96孔板格式
<ol>
	<li>将样本分两步稀释（两步均在96孔板中进行；血清样本在检测缓冲液中稀释200倍）。 
	注意：检测缓冲液的成分为低交叉缓冲液与含1%（w/v）牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）按1:4比例混合，再加入Tween-20至终浓度为0.05%（v/v）。
	<ol>
		<li>样本稀释步骤1：将5 µL血清样本与120 µL检测缓冲液混合（25倍稀释）。</li>
		<li>样本稀释步骤2：取10 µL上述25倍稀释的样本，加入70 µL检测缓冲液，进行8倍进一步稀释，使样本最终稀释倍数为200倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁珠混合液稀释
	<ol>
		<li>制备含有 1.0 × 10 的珠混合物6 每珠子群体每毫升珠子数（即，每种独特靶抗原）</li>
		<li>将制备好的微珠混合物用检测缓冲液稀释25倍，使稀释后悬浮液中微珠的终浓度为4 × 104 每微球群体每毫升微球数（即，每种独特靶抗原）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血清样本与磁珠孵育
	<ol>
		<li>移液25 µL稀释的偶联多重微球悬浮液（含有4.0 × 104 珠子/套/mL）加入至96孔半面积微孔板的指定孔中（材料表).</li>
		<li>将25 µL已稀释200倍的血清样本（来自上述第4.1步）加入含有25 µL偶联微球悬浮液的相应孔中。 
		注意：这会额外产生2倍稀释，因此孔中血清样本的最终稀释倍数为400倍，最终微球数量为每50 µL反应体系中每种微球集1000个微球。</li>
		<li>用微孔板密封膜（粘性箔膜或塑料板盖）覆盖96孔反应板。</li>
		<li>在20 °C、750 rpm条件下，于平板摇床中孵育平板2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>珠子洗涤
	<ol>
		<li>从平板振荡器中取出96孔反应板，并小心移除粘性板封。</li>
		<li>将96孔反应板放入洗板机中。</li>
		<li>使用自动化磁力板洗涤仪，用100 µL洗涤缓冲液（1× PBS + 0.05% v/v Tween 20）洗涤磁珠三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将洗涤后的磁珠重悬于100 µL洗涤缓冲液中，用粘性封板膜或塑料板盖覆盖板孔，于20 °C、1000 rpm条件下在板式振荡器上振荡1分钟。</li>
	<li>将洗涤后的磁珠分装
	<ol>
		<li>从平板振荡器中取出96孔反应板，并小心移除粘性板密封膜。</li>
		<li>用移液器上下吹打混合反应液5次，将每个100 µL反应体系中的50 µL分别转移至两个新的96孔反应板中，一个用于IgG检测，另一个用于IgM检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测抗体/试剂孵育 
	注意：此时，已将偶联靶抗原的磁珠与血清样本孵育，以提取血清中可能存在的、可与抗原反应的循环抗体。已将发生反应并结合免疫球蛋白的磁珠分至两块板中，分别在不同的板上使用带PE标记的亚型特异性二抗检测并定量IgG和IgM。两块板的操作时间间隔20分钟。
	<ol>
		<li>使用磁力板洗涤仪吸去含有磁珠的孔中的上清液。</li>
		<li>为每块板配制相应的Ig检测试剂混合液（抗IgG或抗IgM），即在检测缓冲液中加入PE标记的山羊抗人IgG（3 µg/mL）或PE标记的驴抗人IgM（5 µg/mL）。每个含微球的孔使用30 µL检测试剂。根据反应孔数量，配制足量的IgG和IgM检测试剂，额外预留适量以补偿移液过程中的损耗。</li>
		<li>将30 µL IgG检测试剂加入IgG板中每个含有反应后微珠的孔中，并用微孔板密封膜覆盖96孔反应板。</li>
		<li>将30 µL IgM检测试剂加入IgM板中含反应微珠的每个孔中，并用微孔板密封膜封住96孔反应板。</li>
		<li>在平板振荡器上于20 °C、750 rpm条件下振荡孵育45分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>珠子洗涤
	<ol>
		<li>从平板振荡器中取出96孔反应板，并小心移除粘性板密封膜。</li>
		<li>将96孔反应板放入磁力板洗板机中。</li>
		<li>使用磁力板洗涤仪，用100 µL洗涤缓冲液洗涤磁珠三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将珠子重悬于100 µL洗涤缓冲液中。</li>
	<li>在单个报告基因仪器上分析结果。
	<ol>
		<li>用微孔板密封膜覆盖96孔反应板。</li>
		<li>在20 °C下，以1000 rpm的速度在平板振荡器上振荡96孔反应板3分钟。</li>
		<li>将96孔反应板从板式振荡器中取出，放入单报告基因流式分析仪中（材料表).</li>
		<li>针对每个样本，使用以下仪器参数分析中位荧光强度（MFI）：上样体积 = 80 µL，计数 = 每微球群体50个，超时时间 = 60 s，设门范围 = 7,500–15,00012,13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 检测步骤：双报告基因IgG和IgM血清学检测：96孔板格式
<ol>
	<li>样本稀释（2个步骤，均在96孔板中进行；用检测缓冲液将血清样本稀释200倍）
	<ol>
		<li>样本稀释步骤1：将5 µL血清样本与120 µL检测缓冲液混合（25倍稀释）。</li>
		<li>样本稀释步骤2：取10 µL第一步稀释液（5.1.1节中25倍稀释的样本），加入70 µL检测缓冲液，进行8倍稀释，从而获得最终200倍的样本稀释度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁珠混合液稀释
	<ol>
		<li>制备含有 1.0 × 106 每珠子群体每毫升偶联有目标抗原的珠子（即，每种独特靶抗原） 
		注意：在本系列实验中，我们评估了针对四种独特抗原的IgG和IgM免疫反应性 伯氏疏螺旋体 每次反应中的抗原</li>
		<li>将制备好的微珠混合物用检测缓冲液稀释50倍。此稀释后悬液中的微珠浓度为2.0 × 104 每珠群体每毫升珠子数。 
		注意：在初步研究证实使用一半数量的微球仍可使荧光信号保持在定量线性范围内后，为实现两种检测方法之间的直接可比性并节约资源，双因子检测反应中的微球数量较单 reporter 反应减少一半。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血清样本与磁珠孵育
	<ol>
		<li>移液25 µL稀释后的目标抗原偶联微球悬浮液（含2.0 × 104 微珠/套/mL）加入至96孔半面积微孔板中预先指定的孔中。反应孔的具体数量及其在板上的位置取决于操作者确定的&#160;检测的样本总数，以及每个样本将进行单孔还是复孔检测。 
		注意：目标抗原偶联的磁珠将与人血清样本反应。两者均使用抗-伯氏疏螺旋体 若样本中存在抗原免疫反应性IgG和IgM，它们将结合并固定在相同抗原偶联的微球上。随后在同一反应中，利用针对IgG和IgM的不同荧光染料，在同一微球上对结合的IgG和IgM进行二级抗体定量，从而实现两者的区分鉴定。</li>
		<li>向每孔中加入25 µL已稀释200倍的血清（来自上述步骤5.1），每孔预先含有25 µL混合的目标抗原偶联微球悬浮液（步骤5.2）。 
		注意：这会额外产生2倍稀释，因此孔中血清样本的最终稀释倍数为400倍，最终微球数量为每50 µL反应体系中每种微球500个。</li>
		<li>用微孔板密封膜（粘性箔膜或塑料板盖）覆盖96孔反应板。</li>
		<li>将含有珠子的培养板在20 °C、750 rpm条件下于培养板振荡器中孵育2 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>珠子洗涤（去除&#160;过量血清样本
	<ol>
		<li>从平板振荡器中取出96孔反应板，并移除粘性板密封膜。</li>
		<li>将96孔反应板放入磁力板洗板机中。</li>
		<li>使用磁力板洗涤仪，用100 µL洗涤缓冲液洗涤磁珠3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次洗涤步骤后，从珠子中吸出最后的洗涤液体积。</li>
	<li>检测抗体（孵育 - 第一部分）
	<ol>
		<li>在检测缓冲液中配制新鲜的IgG和IgM双检试剂，其中含生物素标记的山羊抗人IgG（1 µg/mL）和PE标记的驴抗人IgM（5 µg/mL）。每个含微球的孔使用30 µL双检试剂。根据反应孔数量准备足量的IgG和IgM双检试剂，额外多配以补偿移液过程中的损耗。</li>
		<li>将30 µL IgG和IgM双检试剂加入指定的每个孔中，并用微孔板密封膜覆盖96孔反应板。</li>
		<li>在20 °C下，于平板振荡器上以750 rpm振荡孵育平板45分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>珠子洗涤（去除过量检测抗体）
	<ol>
		<li>从平板振荡器中取出96孔反应板，并小心移除粘性板密封膜。</li>
		<li>将96孔反应板放入自动磁力板洗板机中。</li>
		<li>使用自动化磁力板洗涤仪，用100 µL洗涤缓冲液洗涤磁珠3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次洗涤步骤后，从珠子中吸出最后的洗涤液体。</li>
	<li>链霉亲和素偶联报告分子（孵育 - 第二部分）
	<ol>
		<li>将新鲜的BV421标记链霉亲和素用检测缓冲液稀释至浓度为0.2 µg/mL。每个含珠子的孔使用30 µL BV421标记链霉亲和素。根据反应孔数量准备足量的BV421标记链霉亲和素溶液，并额外多准备适量以补偿移液过程中的损耗。</li>
		<li>将30 µL稀释后的BV421-链霉亲和素加入每个反应孔中，并用微孔板密封膜封住96孔反应板。</li>
		<li>在20 °C下于平板振荡器上以750 rpm振荡孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤磁珠（以去除过量的BV421-链霉亲和素）
	<ol>
		<li>从平板振荡器中取出96孔反应板，并小心移除粘性板封。</li>
		<li>将96孔反应板放入磁力板洗板机中。</li>
		<li>使用自动化磁力板洗涤仪，用100 µL洗涤缓冲液洗涤磁珠3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将磁珠在孔内重悬，用洗涤缓冲液定容至终体积100 µL。</li>
	<li>在双报告基因检测仪上分析结果
	<ol>
		<li>用微孔板密封膜覆盖96孔反应板。</li>
		<li>将96孔反应板在20 °C、1000 rpm条件下于平板振荡器中孵育3分钟。</li>
		<li>将96孔反应板从板式振荡器转移至双报告基因流动分析仪（材料表).</li>
		<li>根据制造商说明评估样品的中位荧光强度（MFI）（仪器设置：双报告模式， uptake volume = 80 µL，Count =&#160;50/珠粒群，超时时间 = 60秒，门控 = 7,500–15,000。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 双报告基因IgG和IgM血清学检测：384孔半自动化格式
<ol>
	<li>使用第5节中详述的实验步骤，在384孔板中进行双报告基因检测，但需使用移液机器人和自动磁板洗涤仪处理样品（材料表）。在384孔板体系中，孵育和洗涤过程中以1450 rpm振荡板子；在检测荧光前，于21 °C以1800 rpm振荡5分钟。</li>
</ol>

Multiplex Immunoassay for Borrelia-Specific IgG and IgM in Serum

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<li>Coors, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+seropositivity+for+Borrelia+burgdorferi+and+associated+risk+factors%3A+findings+from+the+Rhineland+Study%2C+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany.</a> Parasites & Vectors. 15 (1), 241(2022).</li>
<li>Gürsoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+IgA+and+IgG+antibody+responses+against+periodontitis-associated+bacteria+in+Crohn%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn's Disease.</a> International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385(2023).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本报告重点介绍了一种基于双报告珠的Borrelia免疫检测方法的开发，该方法可重复且灵敏地测定血清样本中的抗Borrelia免疫反应性12。引起莱姆病的多种致病性Borrelia物种可通过其变异特异性抗原异质性加以区分6,7,8,9。该多重检测方法在同一反应孔中同时评估IgG和IgM介导的抗Borrelia免疫反应性，从而节省了分别进行两次单重检测所需的试剂、人力和样本材料。通过比较IgM与IgG反应随时间的变化，可更有效地追踪疾病进展，因为感染后会发生IgM向IgG的血清学转换6。
双报告系统采用两种不同的检测抗体系统13,15。相关实验表明，当IgM和IgG两类抗体在同一反应孔中同时分析时，Borrelia抗IgM与抗IgG检测系统之间未观察到显著的可检测交叉反应性12。考虑到IgM抗体相较于IgG抗体的结合亲和力较低16,17，我们选择PE标记的检测抗体用于IgM检测（双报告系统的第一个报告通道），因为PE是免疫分析中常规使用的最强荧光染料之一18。对于IgG的检测，我们采用生物素标记的检测抗体，随后用BV421标记的链霉亲和素进行显色（仪器的第二个报告通道）19。尽管相比单报告系统增加了30分钟的孵育步骤，双报告系统可在每个反应中提供两倍的信息量。总体而言，与运行两次单报告系统检测相比，双报告多重检测所需的累计时间和材料投入更少。
多重检测的优异性能与稳定性 伯氏疏螺旋体 该检测在IgG和IgM评估中，通过方法内和方法间精密度研究显示出高重复性，并在宽浓度范围内验证了稀释线性和稀释平行性。我们观察到，使用单通道仪器时，相同荧光染料的绝对荧光发射信号水平高于双通道系统&#8776;1.7&#215; 高于PE），这是由于两种仪器在光学系统和校准设置上的差异所致（图4）。然而，两种荧光染料的荧光发射曲线在高稀释度和低稀释度极端条件下，于两台仪器上均保持在线性范围内，且所测得的绝对荧光值的任何差异均未影响分类结果 伯疏螺旋体 暴露状态12
这种基于微球的 Borrelia 多重检测方法的一个主要优势在于，可轻松对检测体系进行修改或扩展，以评估不同或额外的分析物，例如，检测针对其他 Borrelia 物种抗原的抗体。xMAP 磁性微球集包含不同的染料组合，可在仪器的分类通道中加以区分，理论上可被用于构建多重检测体系，从而在同一份样本中同时检测多达 500 种不同的分析物。尽管本研究重点介绍了四种代表性的 Borrelia 抗原，以展示检测方法的功能性和稳定性，并比较单报告系统与双报告系统的性能，但最终的检测体系包含八种抗原，联合使用可识别在欧洲和北美地区流行的全部五种临床相关 Borrelia 病原体12。
使用标准的384孔微孔板在半自动化检测体系中可实现高通量操作。由于检测方法与仪器兼容96孔和384孔板，该Borrelia多重检测可用于高效筛选大量样本，例如全国性研究20。对于较小规模的样本集，仍可使用较小的96孔板进行手动操作。
本研究的局限性包括仅在少量人血清样本中对少数 Borrelia 免疫反应靶标进行了比较评估。然而，原始研究已证实，在较大样本集中分析已知全部五种 Borrelia 物种的八种抗原时，该检测方法对 IgG 和 IgM 的性能均得以保持12。此外，双报告系统仪器每次反应只能同时检测两种抗体同种型，因此若需完成完整的同种型谱型分析，则需进行额外的检测反应13。
总之，本报告详细阐述了将基于微球的单报告系统免疫测定法成功整合并转化为双报告系统测定法的过程，该方法可同时评估人血清样本中针对致病性Borrelia的特异性IgG和IgM抗体。这种联合方法在生成与两个独立单报告系统测定相当的数据量时，节省了总体时间、材料和人力投入。该多重测定可从96孔扩展至384孔微孔板格式，并可通过使用机器人板和液体处理仪器实现半自动化，适用于大规模人群调查等高通量应用。基于微球的双报告系统测定此前已证明可用于评估其他病毒和细菌病原体的免疫应答13,21，评估器官移植中针对HLA表位的同种异体抗体应答22，以及探索自身免疫性疾病的机制23。本报告以利用多重技术识别导致莱姆病的Borrelia病原体暴露为例，说明实验室如何采用该方法研究多种疾病中复杂的免疫机制。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65323">Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test</a>. The Authors section was updated to correct an Affiliation. It was updated from:
Julia H&#228;ring1 
Tanja Michel1 
Matthias Becker1 
Daniel Junker1 
Tatia Tchitchagua2 
Olaf Leschnik2 
Berit Lange3,4 
Stefanie Castell3,4 
G&#233;rard Krause3,4 
Monika Strengert3 
Alex Dulovic1 
Nicole Schneiderhan-Marra1 
1NMI Natural and Medical Sciences Institute, University of T&#252;bingen 
2Department of Neurology, S&#228;chsisches Krankenhaus Rodewisch 
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research 
4German Centre for Infection Research (DZIF)
to:
Julia H&#228;ring1 
Tanja Michel1 
Matthias Becker1 
Daniel Junker1 
Tatia Tchitchagua2 
Olaf Leschnik2 
Berit Lange3,4 
Stefanie Castell3,4 
G&#233;rard Krause3,4 
Monika Strengert3 
Alex Dulovic1 
Nicole Schneiderhan-Marra1 
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the&#160;University of T&#252;bingen 
2Department of Neurology, S&#228;chsisches Krankenhaus Rodewisch 
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research 
4German Centre for Infection Research (DZIF)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65323">Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test</a>. The Authors section was updated to correct an Affiliation.

Erratum: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

莱姆病是北半球温带地区最常见的蜱传感染性疾病1。它由密螺旋体属的螺旋体细菌引起 伯氏疏螺旋体，包含五种已知的人类病原体，其地理分布各不相同2. 主要致病的 伯氏疏螺旋体 欧洲的物种 B. afzelii 和 B. garinii 与 B. burgdorferi s.s. B. spielmanii 和 B. bavariensis 较少被牵涉。在北美， B. burgdorferi s.s. 是莱姆病的唯一致病因子2,3. 伯氏疏螺旋体 病原体由蜱属成员传播 Ixodes，蜱叮咬后24小时内即可发生传播4.
莱姆病的诊断通常基于临床症状，并通过血清学检测进一步确诊。在欧洲和北美，诊断指南均推荐采用两步检测法：首先进行酶联免疫吸附试验（ELISA），随后根据结果进行免疫印迹试验，以评估机体针对Borrelia特异性抗原的抗体反应1,5,6,7,8,9。然而，该方法敏感性不足，尤其在感染早期，血清学转换可能尚未完成，抗Borrelia IgG和IgM滴度可能过低，导致检测效果不理想6。
多重免疫分析技术改进了传统免疫分析方法，后者每次只能检测一个靶标，而多重免疫分析可同时评估针对一种或多种抗原的多种抗体亚型反应10,11,12。例如ELISA等分析方法仅能在单次反应中识别和定量一种分析物，在本研究中&#160;即感染伯氏疏螺旋体（Borrelia）后在体内循环的单一细菌抗原特异性IgG或IgM抗体。本报告阐述了利用基于微球的分析物谱型技术，开发一种可同时检测人血清样本中针对任意一种所选伯氏疏螺旋体抗原的IgG和IgM抗体的多重免疫分析方法。我们选择了四种抗原，共同覆盖了在欧洲（B. garinii、B. afzelii、B. burgdorferi s.s.）和北美（B. burgdorferi s.s.）最常见的致病性伯氏疏螺旋体物种（表1）2,3。该方法可实现对病原体的明确鉴定，并能够区分患者样本中早期出现的IgM和后期持续存在的IgG免疫反应性。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶向同种型</td>
			<td>报告通道</td>
			<td>抗原</td>
			<td>伯氏疏螺旋体种</td>
			<td>菌株</td>
			<td>抗原偶联浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>PE</td>
			<td>OspC</td>
			<td>B. garinii</td>
			<td>20047</td>
			<td>5.0 µg/106 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>BV421</td>
			<td>VlsE</td>
			<td>B. burgdorferi s.s</td>
			<td>B31</td>
			<td>1.25 µg/106 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>BV421</td>
			<td>DbpA</td>
			<td>B. burgdorferi s.s.</td>
			<td>ZS7</td>
			<td>10.0 µg/106 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>BV421</td>
			<td>DbpA</td>
			<td>B. afzelii</td>
			<td>PKo</td>
			<td>5.0 µg/106 beads</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：代表性 伯氏疏螺旋体 用于多重检测方法开发的抗原。
我们最初开发了一种单报告分子免疫测定法，可在两个独立反应中分别检测抗Borrelia抗原的IgG或IgM抗体，随后将这两种检测方法整合为一种双报告分子多重检测法，可在同一反应体系中同时测定两种抗体亚型。磁珠与感兴趣的病原体靶抗原偶联后，与患者血清样本共同孵育。磁珠偶联的抗原可被血清中针对该病原体抗原的免疫应答所产生的循环IgG和IgM识别并捕获。检测中对IgG与IgM的特异性区分取决于所选用的二抗，即分别结合IgG或IgM的二抗，每种二抗均带有不同的荧光标记信号。每种荧光信号由仪器的两个报告通道之一（即双报告分子）检测，每个通道具有不同的激发激光和发射光捕获系统，分别对应于用于检测IgG或IgM的单一荧光染料（此处分别为Brilliant Violet 421和藻红蛋白）。仪器的分类通道用于识别不同磁珠组固有的编码染料。因此，可将多种靶抗原偶联至不同染色的磁珠上，再将各磁珠组混合，用于全面评估血清样本中针对多种病原体的免疫反应性。分类通道可识别每种独立的磁珠组（即特定抗原），并测量针对该抗原的IgG或IgM相关荧光强度。该多重检测法相比传统检测方法更全面，节省时间和资源，且可在有限样本量条件下准确记录莱姆病的免疫反应性。&#160;尽管类似的双报告分子方法此前已被用于对其他疾病（如SARS-CoV-2感染）的免疫应答进行分类13，但本研究详细阐述了多重荧光检测技术在莱姆病螺旋体病免疫反应性表征中的应用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体与检测试剂&lt;/strong&gt;</td><td>来源</td><td>目录编号</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗人IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch (Dianova)</td><td>109-066-098&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421标记的链霉亲和素</td><td>BD Biosciences</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>驴抗人IgM&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch (Dianova)</td><td>709-116-073</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;伯氏疏螺旋体抗原&lt;/strong&gt;</td><td>tgcBIOMICS (Bingen, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;偶联试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>77149 ProteoChem (100 mg)</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Carl Roth</td><td>T844.3</td><td></td></tr><tr><td>MES（2-乙烷磺酸；两性离子缓冲液）</td><td>Carl Roth</td><td>4256.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>ProClin300</td><td>Sigma</td><td>48914-U</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐）</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>24510 (500 mg)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器与辅助实验耗材&lt;/strong&gt;</td><td>来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384孔板</td><td>Corning, Cat# 3570</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔深孔板</td><td>ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔半面积板&amp;nbsp;</td><td>Corning, Cat# 3690</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioTek 405 TS 洗板机</td><td>BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioTek MultiFlo FX 洗板机</td><td>BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag Spin 磁力架（用于微离心管中磁珠的分离）</td><td>ThermoFisher, Cat# 12320D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D（双通道、单报告分子仪器）</td><td>Luminex Corp., Austin, TX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KingFisher 磁性粒子处理器（用于96孔板中磁珠的分离）&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher, Cat# A31508</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagPlex 微球（磁性、荧光、直径6.5-&amp;micro;m）</td><td>Luminex Corp., Austin, TX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock 板</td><td>Eppendorf, Cat# 5363000039</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf, Cat# 5382000015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf, Cat# 5308000003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xMAP Intelliflex（三通道、双报告分子仪器）</td><td>Luminex Corp., Austin, TX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

多重血清学检测中不同抗体类别同时检测

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

为了监测传染病的进展，评估机体对不同抗原决定簇的免疫反应性，并检测不同类型的抗体同种型具有重要意义，因为这些同种型在宿主免疫应答的不同阶段出现。在莱姆病中，致病因子可能是伯氏疏螺旋体属的多个成员之一 伯氏疏螺旋体 物种。因此，正确的样本分类需要评估针对不同抗原的不同免疫反应性 伯氏疏螺旋体 物种。此外，在疾病进展过程中，抗病原体的IgG和IgM免疫应答可能具有不同的诱导时间进程。本文展示了双报告分子多重免疫测定法的建立，该方法可用于鉴定 伯氏疏螺旋体通过在同一反应孔中同时检测人血清样本中针对不同细菌抗原的IgG和IgM免疫反应性，以评估特异性免疫应答。这种双报告分子方法在节省时间、资源并减少样本用量的同时，保持了单报告分子方法的分析性能。该检测方法可在一半时间内从一份血液样本中获得近两倍的血清学信息。

实验概述 
单报告基因和双报告基因珠粒检测的总体方案 伯氏疏螺旋体 检测结果如图所示 图1. 对于单一抗体靶点（即，针对特定抗原产生的IgG或IgM 伯氏疏螺旋体 抗原，使用PE标记的抗同种型抗体分别在人血清样本中独立评估两种抗体类别。对于同时分析IgG和IgM免疫反应性的双报告系统检测， 伯氏疏螺旋体 抗原特异性IgG检测采用生物素标记的抗人IgG与BV421标记的链霉亲和素（蓝色荧光）报告系统，同时保留PE偶联的报告系统（橙色荧光）用于IgM检测。双报告系统检测流程与单报告系统检测相似，唯一区别在于额外增加30分钟与第二通道荧光检测试剂BV421-Streptavidin的孵育步骤。
<img alt="使用MagPlex磁珠进行单报告基因与双报告基因IgG/IgM检测比较的免疫测定示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：基于磁珠的单报告基因与双报告基因Borrelia检测示意图。（A）采用单报告基因仪器开发并初步验证了基于磁珠的检测方法，该方法可分别表征抗Borrelia IgG或IgM抗体，均使用藻红蛋白（PE）荧光报告标记，其在“橙色”光谱范围内发射信号。任何所需的Borrelia抗原均可偶联至磁珠，用于捕获并定量血清样本中存在的IgG或IgM。为评估针对某一特定抗原的IgG和IgM反应性，需进行两个独立的免疫检测。（B）双报告基因系统可在同一孔中同时分析血清样本中针对任一特定Borrelia抗原的IgG和IgM抗体。该方法使用相同的PE标记检测抗体靶向抗Borrelia IgM，但将IgG的检测由基于PE的系统替换为生物素化的一抗检测抗体，并使用BV421标记的链霉亲和素（“蓝色”发射体），此步骤需额外增加30分钟的检测系统孵育时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
批内精密度 
针对三种代表性伯氏疏螺旋体（Borrelia）抗原的Spearman相关性分析（图2）表明，在检测人血清中抗Borrelia抗体时，MFI值具有良好的重复性。
<img alt="血清样本中IgG/IgM的点图比较，展示流式细胞术数据的高度相关性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：基于双报告微球的Borrelia检测方法的批内精密度。 使用PE检测系统检测Borrelia特异性IgM抗体（A），使用BV421检测系统检测Borrelia特异性IgG抗体（B, C）时，Spearman相关性分析显示该双报告检测方法具有较高的批内精密度。共采用半自动化流程对21份血清样本进行了重复检测。在每张图中，MFI信号相互对照绘制，并通过线性回归进行分析。红色虚线表示线性曲线（x=y），代表检测系统间MFI信号完全一致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
批间精密度 
双报告基因检测显示出良好的批间重复性。对质控样本在七次独立运行中测得的荧光强度值（MFI）绘制的Levey-Jennings图（图3）显示，所有代表性抗原均具有较高的批间精密度。四种代表性 Borrelia 抗原的平均变异系数（CV% = 标准差/均值 × 100）为5.3%。
稀释线性 
由于原始的单报告基因检测法和新的双报告基因检测法采用了不同的流式细胞术平台，我们比较了两种流式细胞仪在同一抗原免疫检测中的中位荧光信号输出（图4）。样本稀释系列在IgM和IgG的检测中均呈现出线性稀释曲线，并在整个评估的稀释范围（1:100–1:12,800）内，两种仪器之间的剂量反应具有良好的平行性。
<img alt="伯氏疏螺旋体抗体检测图表；MFI与运行数据；IgM/IgG水平；PE/BV报告分子；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：双报告分子磁珠法Borrelia检测的批间精密度。为评估批间精密度，对一份质控样本中的Borrelia特异性IgM（A）和IgG（B-D）抗体反应，在七次独立实验中每次设两个复孔进行检测。实验均为手工操作。将MFI值绘制于Levey-Jennings质控图中。绿色线条表示所有数值的均值，两条红色虚线表示批间精密度的容许范围，该范围由均值±2.5倍标准差（2.5 S.D.）计算得出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术稀释曲线；抗OspC IgM、抗DbpA IgG、单报告系统与双报告系统、MFI结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：双报告珠基Borrelia检测法的稀释线性。 在样本稀释倍数为100倍至12,800倍时，使用单报告仪器和双报告仪器手动操作，IgM检测（A）和IgG检测（B）的稀释曲线相似。在所有测试的稀释倍数下，单报告仪器（红色符号）测得的MFI值略高于双报告仪器（蓝色符号）。图中显示了两种代表性抗原的稀释曲线，每个稀释点代表三个复孔的平均测量值，标准差（SD *）由误差线表示。注意：在此比例尺下，较小的标准差不可见。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充材料。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/Supplementary_FIle_Buffer_Compositions.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

采用三通道双报告荧光流式分析系统，建立了一种基于微球的多重免疫测定方法，可同时检测血清样本中针对多种引起欧洲和北美莱姆病的Borrelia物种抗原所产生的IgG和IgM抗体。

为监测传染病的进展，有必要评估针对多种抗原决定簇的免疫反应性，并测定不同……

尽管经过多年的科研探索，莱姆病伯氏疏螺旋体病的诊断仍不理想，且敏感性不足。通过我们开发的双报告系统多重伯氏疏螺旋体检测方法，可识别患者样本中针对不同伯氏疏螺旋体物种的免疫反应性，从而区分早期的IgM和后期更持久的IgG免疫反应性。Luminex公司的Intelliflex仪器凭借其多重检测能力和双报告系统，属于当前最先进的技术之一，能够在使用少量供体材料的情况下最大化信息输出。 双报告分子免疫检测方法通过同时检测人血清样本中针对任意一种已知伯氏疏螺旋体抗原的IgG和IgM抗体，改进了传统的免疫检测技术。通过这种方法，我们可在一次检测运行中从宝贵的样本材料中获取两倍的信息。该方法可同时实现对伯氏疏螺旋体病原体的明确鉴定，以及对早期感染阶段和后续更持久的免疫反应的高灵敏度检测。从而实现成本、材料和时间的高效性，并提高莱姆病感染检测的精确度。我们的检测方法支持全球血清学监测和病原体消除策略，有助于确定不同地区的物种分布及感染来源。本实验室致力于针对多种病毒病原体的预防性和治疗性疫苗研发，特别关注疫苗免疫反应与感染免疫反应的血清学区分，以及免疫反应的深入表征。

simultaneous-detection-different-antibody-classes-multiplexed

Research

科研

JoVE Journal

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采用一种用于基于微球的多重检测的流式分析系统，该系统提供双报告信号读出，用于开发多重血清学和抗体中和检测方法，可同时检测SARS-CoV-2的中和性IgG和IgM抗体。...

一种用于多重微球流式分析系统的快速、多重双报告基因IgG和IgM SARS-CoV-2中和检测方法

本文介绍了一种便捷的方法，可同时监测针对SARS-CoV-2感染或疫苗接种所引发的免疫反应中两种免疫球蛋白亚型（IgA、IgM或IgG）抗体滴度的动态变化。该“多重分析物新冠免疫反应检测组”采用基于编码微球的三种间接免疫测定法，使用具备“双通道”功能的流式多重读数仪进行检测。...

使用多指标免疫磁珠检测法对新冠血清转化进行动态监测

多重条形码成像分析技术最近显著改进了对肿瘤微环境的表征，使得能够全面研究细胞组成、功能状态以及细胞间相互作用。本文中，我们描述了一种染色与成像方案，该方案利用寡核苷酸偶联抗体的条形码技术和循环成像，从而实现高维成像 分析技术的应用。...

用于石蜡组织样本单细胞分析中免疫谱型与空间定位特征的多重条形码图像分析

多重荧光免疫测定正成为血清学检测的参考方法。然而，其应用受限于复杂且耗时的微球-分析物偶联过程。本报告介绍了一种半自动化、可重复的多重微球偶联方案，其效果与标准方法相当，但显著缩短了获得结果所需的时间。...

一种用于检测虫媒病毒抗体反应的多重血清学检测方法

了解双报告多重免疫检测技术，用于同时检测血清样本中的IgG和IgM抗体，提高莱姆病诊断的敏感性。该方法支持全球血清监测和病原体消除策略。

多重血清学检测中不同抗体类别同时检测

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