Name: 小鼠徒手脑室内注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 学习小鼠徒手脑室内注射技术，用于研究神经内分泌调控生殖功能的机制。该方法无需立体定位仪，可快速将药物递送至侧脑室，支持黄体生成素分泌及应激反应相关信号通路的深入研究。

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我们感谢Kellie Breen Church博士、Michael Kreisman先生和Jessica Jang女士在收集代表性结果中所示数据方面所做的贡献。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R00 HD104994项目（R.B.M.）资助。

所有实验程序均经科罗拉多州立大学（#3960）和加州大学圣地亚哥分校机构动物照护与使用委员会批准，代表性数据在上述机构采集（S13235，项目负责人 Kellie Breen Church）。代表性数据部分展示了五只成年雌性及两只成年雄性 C57/BL6 小鼠（9–16 周龄）的数据。雌性小鼠在脑室内注射和采血前 3–4 周进行了卵巢切除术，操作步骤如前所述7。实验前，小鼠饲养于 12 小时光照/12 小时黑暗的光周期环境中，并可自由获取饲料和饮水，符合《实验动物照护与使用指南》的要求。
1. 实施开颅手术
注意：开颅手术可于实际注射前数日进行，这样可使实验当天的注射过程更加快捷。
<ol>
	<li>按照以下说明准备开颅手术所需材料。
	<ol>
		<li>在工作台面上铺上干净的垫布或无菌铺巾。将异氟烷蒸发器的鼻罩用胶带固定在工作台面上（靠近但背向实验操作者；见图1A）。</li>
		<li>将硅胶管套在无菌锋利的18 G针头末端，使针尖约有 ~1 mm 露出。同样，将硅胶管套在无菌钝头针末端，使针尖约有 ~1 mm 露出。 
		注意：每只小鼠应使用独立包装、无菌的针头（锋利和钝头），不可重复使用。</li>
		<li>准备电动剃毛器、碘伏消毒液、无菌纱布和酒精棉片，用于处理注射部位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下说明练习将针头向侧方移动2 mm、向尾侧移动1 mm的操作。
	<ol>
		<li>使用直尺和笔在一张纸上标记一个起始点（代表前囟），在其左侧或右侧2 mm处标记一点，在该点上方再标记一点（代表注射位点；见图1B）。</li>
		<li>反复练习将针头从起始点移动至第一标记点，再移至第二标记点（从前囟到注射位点），直至能够不依赖参照物准确重复该操作。 
		注意：此处描述的坐标适用于成年C57/BL6小鼠，其他品系或年龄组可能需要调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下说明准备小鼠进行开颅手术。
	<ol>
		<li>将小鼠放入诱导室，使用医用级氧气携带3%–4%异氟烷进行麻醉。随着操作熟练度提高，应尽量将异氟烷暴露总时间缩短至开颅手术10分钟以内。 
		警告：异氟烷暴露对人体健康有害；应在通风良好的环境中使用经批准且定期检查的异氟烷蒸发器，并配备废气清除装置。</li>
		<li>当小鼠趾反射消失后，剃除头部毛发，并涂抹眼用润滑剂。</li>
		<li>将小鼠置于工作台面，头部插入鼻罩以维持麻醉状态。</li>
		<li>根据供应商指导，给予镇痛剂（如皮下注射布托啡诺，剂量为0.6–0.8 mg/kg小鼠体重）。</li>
		<li>用浸有碘伏溶液的无菌纱布擦拭头部注射部位（进行三次擦洗），然后用酒精棉片擦拭（重复三次）。 
		&#8203;注意：应清除毛发并清洁注射部位周围的皮肤，使用无菌器械和针头，以预防感染，符合美国兽医协会建议。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用非优势手牢固固定小鼠头部，尽量使其头部平贴于工作台面。</li>
	<li>确定注射位点。
	<ol>
		<li>使用已准备好的18 G锋利针头首先定位前囟；操作时，沿头部中线在皮肤表面从前向后（头侧-尾侧平面）轻划针头。想象一个等边三角形，两个顶点为双眼位置，第三个顶点即为前囟的大致位置（见图1C）。</li>
		<li>从前囟开始，将针头向侧方移动2 mm，再向尾侧移动1 mm，到达注射位点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保持针头垂直，用力将针头穿过皮肤和颅骨，直至硅胶管与皮肤表面齐平。</li>
	<li>回撤针头，旋转针头方向，再次压入皮肤和颅骨。重复此过程，直至在颅骨上形成一个小孔。</li>
	<li>使用钝头针检查颅骨上的孔是否足够大。目标是使骨孔大小足以让钝头针顺利穿过。</li>
	<li>将小鼠从鼻罩中取出，用无菌纱布擦净注射部位的血液，然后将小鼠放入垫有保温垫的笼子中直至苏醒。由于开颅产生的孔较小（18 G针头），无需使用缝线或伤口夹闭合。 
	注意：此处产生的孔较小（18 G），因此许多机构将该操作归类为注射而非手术。此外，尽管已穿透皮肤和颅骨至脑部，但拉紧皮肤会使皮肤与颅骨上的孔错位，这可能有助于防止皮肤菌群或笼具垫料接触脑组织。</li>
</ol>
2. 进行注射
<ol>
	<li>按以下步骤准备注射所需材料。
	<ol>
		<li>在工作台面上铺上干净的垫巾或覆盖材料。将异氟烷蒸发器的鼻罩用胶带固定在工作台面上（靠近但背向实验操作者；见图1A）。</li>
		<li>将一根长度为10 mm、带45°斜面的27 G针头连接至5 µL玻璃注射器上。在针头上套上硅胶管，使针尖露出3.5 mm；用实验室胶带将硅胶管固定在注射器筒体上（见图1D）。</li>
		<li>在离心管中准备好注射介质（药物、病毒或其他待注射液体）。本研究的代表性结果中注射的是无菌等渗盐水。 
		注意：选择一种允许玻璃注射器和针头插入的离心管，例如2 mL微量离心管。</li>
		<li>用玻璃注射器吸取3 µL注射介质。首先吸取超过所需体积的液体，然后推出至注射器内剩余3 µL为止。</li>
		<li>准备好碘伏棉球、无菌纱布和酒精棉片，用于注射部位的消毒处理。</li>
		<li>启动实验室计时器并设置为正计时模式，将计时器放置在注射过程中实验操作者易于观察的位置。</li>
		<li>练习将针头向侧方移动2 mm、向尾侧移动1 mm的操作，方法同前一日所进行的操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤准备小鼠以进行注射。
	<ol>
		<li>将小鼠放入诱导室，使用异氟烷进行麻醉。当脚趾反射消失后，涂抹眼用润滑剂，并将小鼠头部置于鼻罩中，身体平放在工作台面上。</li>
		<li>用碘伏和酒精各擦拭三次以清洁注射部位。按照步骤1.8所述方法，使用18 G针头（或钝化针头）确定注射位点。开颅时所形成的孔洞应可被探查到。 
		注意：如果尚未预先进行开颅手术，或颅骨上的孔洞无法探查到，可在本步骤中实施开颅。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用玻璃注射器进行注射，具体步骤如下。
	<ol>
		<li>用非优势手牢固固定小鼠头部，使头部尽可能平贴于工作台面。</li>
		<li>将玻璃注射器的针头穿过颅骨上的孔洞，直至步骤2.1.2中安装在针头上的硅胶管接触小鼠皮肤表面。</li>
		<li>尽可能保持注射器垂直，注意冠状面和矢状面的方向。在1分钟时间内缓慢注入注射介质。</li>
		<li>注射完成后，继续保持注射器和针头原位1分钟，以减少反流。随后缓慢将针头从小鼠头部拔出。</li>
		<li>将小鼠从鼻罩中取出，如有出血，用无菌纱布清洁注射部位，并将小鼠放入笼盒中，置于加热垫上直至苏醒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 确认注射位点
<ol>
	<li>深度麻醉小鼠，并用生理盐水和4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，操作步骤如前所述8将脑组织置于含30%蔗糖的PBS溶液中，4 °C保存，直至脑组织沉底（通常需2天）。</li>
	<li>在冷冻切片机上按先前所述方法切取20–50 µm的冠状切片9切片过程中，观察组织块中的注射轨迹。记录注射轨迹是否明显与侧脑室相交。</li>
</ol>

Performing Intracerebroventricular Injection in Mice Using a Free-Hand Approach

<ol><li>Roseweir, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+potent+kisspeptin+antagonists+delineate+physiological+mechanisms+of+gonadotropin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation.</a> Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).</li>
<li>Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+intracerebroventricular+injection+of+CD4%28%2B%29+T+cells+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).</li>
<li>Russo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+the+female+reproductive+axis+through+gated+responsiveness+of+the+RFRP-3+system+to+VIP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling.</a> Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).</li>
<li>Laursen, S. E., Belknap, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+injections+in+mice.+Some+methodological+refinements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements.</a> Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).</li>
<li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).</li>
<li>McCosh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-induced+hypoglycaemia+suppresses+pulsatile+luteinising+hormone+secretion+and+arcuate+Kiss1+cell+activation+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Comba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+glioma+subregions+for+spatial+and+molecular+characterization+of+intratumoral+heterogeneity%2C+oncostreams%2C+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion.</a> Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).</li>
<li>Porteous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reformulation+of+PULSAR+for+analysis+of+pulsatile+LH+secretion+and+a+revised+model+of+estrogen-negative+feedback+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice.</a> Endocrinology. 162 (11), (2021).</li>
<li>Hohmann, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+melanocortins+in+mediating+leptin%27s+central+effects+on+feeding+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).</li>
<li>Gottsch, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+kisspeptins+in+the+regulation+of+gonadotropin+secretion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).</li>
<li>Krasnow, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+galanin-like+peptide+in+the+integration+of+feeding%2C+body+weight+regulation%2C+and+reproduction+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse.</a> Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种在小鼠中进行脑室内注射的简单且有效的方法。由于该技术不需要使用立体定位仪，因此更多研究人员能够开展药物和实验试剂的中枢递送研究。此外，该方法通量相对较高，因为准备和注射操作均可快速完成。
由于该操作需要手动操控针头和玻璃注射器，并依据大致距离进行定位，因此建议初学者在接触活体动物前，先花费一定时间练习相关操作动作。此外，使用小鼠尸体有助于练习通过针头定位前囟。在初步掌握操作动作后，借助专门用于练习的活体动物积累经验将非常有帮助。练习过程中，注射3 µL印度墨汁可使注射位置的视觉评估更为直观。定位准确的注射会在同侧侧脑室出现黑色染色，常同时可见第三脑室及对侧侧脑室染色。墨汁注射为终末性操作，注射后不应让小鼠从麻醉中苏醒。即使是经验丰富的操作者，也建议在正式注射前重复练习2 mm外侧和1 mm尾侧的移动动作数次。此外，将玻璃注射器插入脑组织时，必须保持其垂直。通过反复练习， &#62;可预期约75%的注射能够准确定位。在完全注入液体后，将针头保持在原位约1分钟，有助于防止液体从脑组织回流。在此期间，必须确保针头处于正确位置且无任何移动。成功完成该操作需要操作者具备稳定操控和持握针头及玻璃注射器的熟练经验。
如果某些注射位置不准确，可采取多种排查措施。首先，检查注射针头是否笔直（无弯曲），并确保针头已牢固固定在玻璃注射器上。其次，若遗漏的注射位置存在较大变异，则需要进一步练习操作和握持玻璃注射器的技巧。另请一人协助观察注射过程中注射器是否保持垂直，也可能有所帮助。在完整皮肤上准确定位前囟（bregma）同样需要练习。在进行注射前，建议花费足够时间，准确确认该解剖标志的位置。如果注射位置持续偏离目标区域，则必须调整注射坐标。本文所述坐标（前囟后1 mm，外侧±2 mm）适用于成年C57/BL6小鼠，但针对其他品系或不同年龄组，可能需要对坐标进行相应调整。
尽管该技术在快速向中枢递送试剂方面可能非常有效，但仍存在一些局限性。由于注射器的推杆由手动推动，注射速度可能不一致。建议以相对较慢的速度注射，以避免脑室系统内压力可能引起的脱靶效应。本方案推荐注射体积为 3 µL；然而，其他实验室也曾使用更大的注射体积（5 µL）11。根据所测量的实验结果，可能需要调整注射体积和注射速率。例如，幼年小鼠可能仅能耐受较小的注射体积。因此，建议进行预实验以检测溶剂效应。另一个局限性在于，对注射位点是否准确的确认仅能依赖于组织采集后对注射轨迹的主观评估。在脑室内注射数小时后采集的新鲜冷冻组织或经多聚甲醛灌注固定的组织中，均可观察到注射轨迹（参见代表性结果中的图像）。若进行多次注射，则可能无法通过轨迹标记明确判断每次注射是否均准确到位。
这种徒手进行脑室注射的方法需要使用麻醉剂。经过练习后，注射操作可快速完成，从而使动物暴露于麻醉剂的时间缩短至几分钟（3-5 分钟）。通过在实验前剃除小鼠头部毛发，并提前完成开颅操作（用锐利的针头刺穿颅骨），可进一步减少实验过程中动物处于麻醉状态的时间。小鼠通常在短暂麻醉后数分钟内即可完全恢复。由于在麻醉后立即采集尾尖血样可能存在困难，因此建议在注射后暂停采样约 30 分钟，以减轻小鼠的应激反应，尽管这并非必需。其他实验室也已成功利用这种徒手脑室注射技术，在给予药理学试剂后 30 分钟采集单次血样，检测黄体生成素（LH）分泌水平的变化1,12。此外，已有研究在脑室注射后观察到 24 小时内运动行为和摄食行为的变化13，表明该方法适用于长期行为监测。建议在正式实验前开展预实验，以评估采样的难易程度以及麻醉对目标观测指标可能产生的影响。
总之，本文所述的徒手脑室内注射技术是一种将实验试剂递送至大脑的简单而有效的方法。该技术的具体优势在于操作快速、技术简便，并能实现较高比例的准确注射。此外，由于该技术仅需短暂麻醉暴露，因此可与其他多种技术联合使用，例如频繁采血、神经环路调控或 体内 记录以研究神经内分泌过程。

在神经内分泌学研究中，通常需要将实验试剂（如药物1、病毒2或细胞3）递送至脑内。如果该试剂不能轻易穿过血脑屏障，或实验目的是特异性地检测该试剂的中枢作用，则必须具备一种可靠的脑内注射给药方法。此外，向脑室内（ICV）注射可使试剂在脑内广泛分布，并提供较大的靶区，从而提高注射成功的可能性2。
一种常见的脑室内注射方法是植入永久性留置导管。该方法需要使用立体定位仪来固定 commercially available 或定制的导管，并用胶水或牙科水泥将导管固定在颅骨上。通常在动物恢复后，通过导管给予超生理剂量的血管紧张素II，若立即观察到饮水行为，则认为导管位置正确4。该方法具有多种优势，包括能够进行长期输注以及对同一动物进行多次注射；此外，若使用血管紧张素II，可在给予实验性化合物之前确认导管位置是否准确。然而，植入永久性导管也存在一些局限性，例如需要昂贵的设备（立体定位仪）、导管植入后可能受到损伤（例如小鼠可能啃咬同笼小鼠的导管）以及导管周围可能发生感染。单次脑室内注射也可借助立体定位仪完成3，尽管该方法有效，但需要较长时间暴露于麻醉状态，因此可能掩盖治疗引起的某些急性生理和行为效应。此外，将小鼠固定于立体定位仪需要经过大量训练，以实现稳定固定并防止耳道破裂。
本文介绍了一种已建立的小鼠徒手注射方法。该方法基于先前的报道5,6。此技术的优点在于操作简单、快速，且无需使用立体定位仪等特殊设备。如下所述，该操作过程通过相对于小鼠头部的解剖标志手动调控玻璃注射器完成注射，操作迅速，因此在实验当天仅需数分钟的气体麻醉时间。

<table><tbody><tr><td>18号钝头针</td><td>SAI输注</td><td>B18-150</td><td></td></tr><tr><td>18号针头</td><td>BD Medical</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>实验台垫</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>14-206-62AC22</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>NC1696484</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-892-5235</td><td>管制药品</td></tr><tr><td>眼用润滑膏</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器</td><td>Hamilton</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>注射针头</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>27号，小接头RN针头，尖端类型：4，针头长度：10 cm，角度：45°</td></tr><tr><td>异氟烷&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-893-8441</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷挥发器</td><td>Vet Equip</td><td>V-10</td><td></td></tr><tr><td>实验室胶带</td><td>VWR</td><td>89098-128</td><td></td></tr><tr><td>医用级氧气</td><td>Airgas</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Millipore-Sigma</td><td>8.18715.1000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>J67802.K2</td><td></td></tr><tr><td>PulsaR软件</td><td>开源，奥塔哥大学</td><td></td><td>参见参考文献9</td></tr><tr><td>尺子</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>12-00-152</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管（0.040&quot; 内径）</td><td>DOW</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管（0.078&quot; 内径）</td><td>DOW</td><td>508-009</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>VWR</td><td>101320-574</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖&amp;nbsp;</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>S5-500</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠脑室内自由手注射

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

研究神经内分泌系统通常需要将药物、病毒或其他实验试剂直接递送至小鼠脑内。脑室内（ICV）注射可使实验试剂广泛分布于全脑（尤其是靠近脑室的结构）。本文描述了在成年小鼠中进行徒手脑室内注射的方法。通过利用小鼠头部的视觉和触觉解剖标志，可快速且可靠地将试剂注入侧脑室。注射时使用玻璃注射器，由实验者手持，并根据与解剖标志的大致距离进行定位。因此，该技术无需使用立体定位仪。此外，该技术仅需短暂的异氟烷麻醉，便于在清醒、自由活动的小鼠中后续评估其行为和/或生理状态。徒手脑室内注射是一种高效向活体小鼠脑内递送实验试剂的有力工具，可与其他技术结合使用，例如频繁采血、神经环路操控或体内记录，以研究神经内分泌过程。

当操作成功时，该技术可实现将实验试剂快速递送至脑室系统。图 2A 展示了一只接受脑室内注射 3 µL 无菌等渗盐水（多种药理学化合物的溶剂）的去卵巢小鼠的黄体生成素（LH）脉冲分泌谱。此示例表明，短暂暴露于气体麻醉以及向脑室系统注射 3 µL 液体本身并未改变 LH 的脉冲式分泌。脑室内注射后 3 小时，动物被实施安乐死，采集新鲜冷冻的神经组织并在冷冻切片机上切片；可见注射轨迹明显穿入侧脑室。在经固定液灌注（10 mL 肝素化生理盐水，随后 20 mL 磷酸盐缓冲液中的 4% 多聚甲醛）的小鼠神经组织中，也可观察到注射轨迹。正确注射位置的示例如图 2B 所示。图 2C 展示了两个注射位置错误的示例。正确（左侧）与错误注射印度墨汁的示例如图 2D 所示。注射印度墨汁有助于练习该技术，因其可清晰显示注射部位。在正确注射的样本中，可见染料流入双侧侧脑室及第三脑室（图 2D，左侧）。
<img alt="使用异氟烷蒸发器、注射部位示意图、前囟位置、注射器的小鼠麻醉装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65324/65324fig01.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="图1"> 
图1：展示徒手脑室内注射所需设备准备及注射坐标的示意图。（A）徒手脑室内注射工作站的配置。（B）在3-4月龄雌性C57/BL6小鼠中练习实施脑室内注射所需操作动作的示意图。（C）成年小鼠前囟的大致位置。（D）调整导管位置，使针尖露出3.5 mm用于注射。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65324/65324fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="促黄体生成素 (LH) 反应图及脑室注射生理盐水后的脑切片，实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65324/65324fig02.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="图 2"> 
图 2：与徒手脑室注射相关的代表性促黄体生成素及组织学数据。（A）脑室注射前后促黄体生成素（LH）脉冲曲线。实心黑色数据点表示根据文献中推荐的参数，使用PULSAR10算法的改进版本检测到的脉冲信号，适用于卵巢切除小鼠，检测阈值为0.32 ng/mL。（B）脑室注射位置正确的ICV注射后小鼠脑冠状切面照片。（C）脑室注射位置错误的ICV注射后小鼠脑冠状切面照片：左侧为注射轨迹位于脑室侧方，右侧为注射轨迹位于脑室背侧。（D）使用墨汁进行ICV注射的小鼠脑冠状切面照片：左侧为注射位置正确，右侧为注射位置错误。注：图B和C展示的是注射生理盐水3小时后经多聚甲醛灌流固定的脑组织；图D展示的是注射墨汁2分钟后在干冰上采集的新鲜脑组织。比例尺 = 1 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65324/65324fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种无需使用脑立体定位仪的徒手操作方法，用于在小鼠中快速、简便地进行脑室内注射。

神经内分泌系统的研究通常需要将药物、病毒或其他实验试剂直接递送至小鼠脑内。

我们关注生殖功能的神经调控机制，特别是大脑在健康状态及应激条件下如何调控性腺激素的释放。该技术的主要优势在于操作相对简单且快速。将药物递送至侧脑室是一种有效的方法，可用于广泛验证信号通路，从而为后续更深入的实验提供支持。关于生殖的神经内分泌调控，仍有许多问题有待阐明，包括促黄体生成素脉冲分泌的分子机制、应激状态下调节脉冲频率的机制，以及排卵前黄体生成素激增的产生机制。未来，我们尤其希望将各种不同的研究发现整合到模型中。首先，在工作台面上铺上洁净的垫巾，为开颅手术做好准备。将异氟烷挥发器的鼻锥用胶带固定在工作台面上。接着，将硅胶管套在18号针头的末端，确保针尖露出1毫米。通过在一张纸上标记来练习针头移动：第一个点为前囟位置，第二个点在其外侧0.2毫米处，第三个点位于第二个点尾侧1毫米处。练习将针头从起始点移动到第二个标记，然后移动到最终标记，确保在没有导引的情况下移动可重复。接下来，剃除麻醉动物头部的毛发。将小鼠放置在工作台面上，保持头部处于鼻罩内以维持麻醉状态。并在双眼上涂抹眼用润滑剂。现在，用浸有碘溶液的无菌纱布擦拭注射部位。然后使用酒精擦拭垫清洁该区域。重复此过程三次。用非优势手牢固地固定头部，使小鼠平躺在工作台面上。将准备好的18号针头沿头部皮肤中线从前向后方向划过，以确定前囟。 现在，将针头向侧方移动2毫米，并向尾侧移动1毫米至注射位点。保持针头垂直，用力将其穿过皮肤和颅骨，直至导管与皮肤表面齐平。回撤针头，旋转后再次压入并穿过皮肤和颅骨，重复此过程以在颅骨上形成一个小孔。使用钝针检查骨骼上是否有足够大小的孔洞，确保孔洞足够大以允许针头穿过。将小鼠从鼻罩中取出。使用无菌纱布清洁注射部位的任何血液。将小鼠放入笼子中，置于笼式加热器上直至苏醒。首先在工作台面上铺上干净的实验垫或覆盖材料。用胶带将异氟烷挥发器的鼻锥固定在台面上，确保其朝向远离实验操作者的方向。将一根长度为10毫米、27号针头（斜面角度为45度）连接到5微升玻璃注射器上。在针头端连接硅胶管，使管尖端外露3.5毫米。使用实验室胶带将硅胶管固定在注射器筒身上。接下来，先吸取超过所需量的注射介质，然后推出多余部分，直至玻璃注射器中仅剩3 µL，从而吸取3 µL注射介质。启动实验室计时器并设置为正计时模式，将其放置在注射过程中易于观察的位置。在练习了针头的横向和尾向移动后，通过先用碘酒、再用酒精重复清洁注射部位三次，对已麻醉的小鼠进行注射前准备。使用18号针头穿过颅骨开孔部位，确定注射位点。注射小鼠时，首先用非优势手牢固地固定小鼠头部，将头部平放在工作台面上。接下来，将玻璃注射器的针头穿过颅骨上的孔，直至导管接触小鼠皮肤。保持注射器垂直于冠状面和矢状面，缓慢注入培养基，持续约一分钟。继续固定注射器和针头一分钟，以尽量减少回流。然后缓慢撤出针头。将小鼠从鼻罩中取出。使用无菌纱布清洁注射部位的血液，并将小鼠放入笼中，置于笼式加热器上直至苏醒。短暂暴露于气体麻醉剂以及单独向脑室系统注射三微升液体均未改变黄体生成素的脉冲式分泌。在神经组织中可见注射轨迹，并与侧脑室相交。

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