人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

由人诱导性多能干细胞分化而来的心肌细胞是研究基因突变引起的心肌细胞功能变化以及定义应激因素和药物干预效应的有力工具。目前亟需一个能够以用户友好且可重复的方式同时检测此类心肌细胞收缩功能和钙处理能力的实验平台。本方法使研究人员能够通过像素相关性分析检测人诱导性多能干细胞分化心肌细胞的收缩性，同时利用钙离子敏感性染料FloA-PhoR对细胞进行负载，以同步测量细胞内钙瞬变。

通过使用该平台，可以在温度环境保持良好的条件下，对不同板型进行各项测量，并即时访问数据。该方法能够研究细胞病理机制，评估化合物的作用效果以及人源诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的功能，从而有助于临床前药物筛选过程。首先，打开基于光学的测量系统、显微镜发光二极管光源以及计算机。

在计算机上启动程序，点击屏幕左上角“文件”下的“新建”以打开一个新文件。点击“采集”，选择“实验”，然后选择“IPSC 和钙离子测量”。接下来，在24孔板中，将人源IPSC心肌细胞培养基更换为每孔0.5毫升的台氏液。

将培养板盖替换为气候控制盖，并将培养板放入设备的光学空间测量系统中，调节温度至37摄氏度。点击工具栏下方的“打开细胞查找器”，等待新界面出现。在屏幕顶部的腔室类型和孔板格式中选择相应的培养板规格。

选择一个孔，并在孔内选择一个区域以观察同步的收缩和舒张。按下屏幕左下角的“开始”按钮，然后点击“添加测量”以测量该区域。

在24孔板中，每孔测量约10个区域。若仅进行基线测量，继续测量下一孔的区域。若需测试化合物，在完成单孔内所有区域的测量后，点击“完成”。

打开基于光学的测量仪器，并将所需的应激物或化合物加入孔中。在设定的时间段孵育后，单击自动测量，以在与基线测量相同的位置进行配对测量。完成所有测量后，按完成。

从屏幕右上角选择下一个孔，并继续对所有需要的孔进行测量。完成所有需要的孔的测量后，单击停止并将文件保存到指定位置。将Fura-2 AM分装液溶解于Tyrode溶液中，配制成终浓度为1 µM的Fura-2 AM溶液，用于加入细胞中。

吸除培养基，加入含有Fura-2 AM的Tyrode溶液，在37摄氏度的培养箱或基于光学的检测系统中孵育15分钟。移除含Fura-2 AM的Tyrode溶液，用新鲜的Tyrode溶液洗涤孔板两次。最后，将细胞在Tyrode溶液中于37摄氏度继续孵育5分钟，以完成Fura-2 AM的去酯化。将培养板放入基于光学的检测系统中，开始进行收缩力测定。

选择一个孔。在孔内选择一个可观察到同步收缩和舒张的区域，然后点击开始并添加测量。除了收缩力曲线外，实时比率计量的钙瞬变也会显示在屏幕上。

要分析数据，请点击桌面上的 Cytosolver。从文件菜单中点击导入，然后选择要分析的文件。分析完成后，在屏幕上观察被接受和被拒绝的瞬态信号。

单击屏幕左上方的“导出”按钮，并启用平均瞬态数据。将其导出为 Excel 文件，然后点击“导出”。在电子表格中检查已分析的数据。

关闭计算机及所有其他仪器。使用 Cytosolver 程序分析收缩性测量结果，并报告对照组人源诱导多能干细胞衍生心肌细胞的静息/搏动频率、达峰收缩时间及恢复至基线收缩时间等参数。应用 500 纳摩尔的异丙肾上腺素（iso，一种非选择性β肾上腺素受体激动剂）后，所有孔中的搏动频率均显著增加。

Iso 还加快了收缩动力学，表现为达到峰值收缩力的时间和恢复至基础收缩力水平的时间均缩短。与收缩力类似，钙离子信号的测量结果也进行了分析，并报告了相关参数。