Name: 实时测量人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的钙和收缩力参数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习使用光学测量系统在人诱导多能干细胞来源心肌细胞中同步检测收缩力和钙瞬变的方法。该技术通过像素相关分析和Cytosolver数据处理，为临床前药物筛选和心脏疾病机制研究提供可靠平台。

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本研究部分由Eurostars基金项目Estars2 113937 CARDIOMYO（EM &amp;#38; DK）和荷兰科学研究组织（NWO）VICI基金项目91818602（JV）资助。

1. 细胞培养基和试剂的准备
<ol>
	<li>通过将1 mL B27补充剂（50倍浓度）加入49 mL RPMI1640培养基中，制备hiPSC-CM培养基。</li>
	<li>首先将5 mL Knockout血清替代物加入45 mL hiPSC-CM培养基中，制备重铺板培养基；然后加入22.5 µL Y-27632 ROCK抑制剂（1:2,000稀释；储存浓度：10 mM），充分混匀。</li>
	<li>按以下步骤制备基底膜包被的培养板：
	<ol>
		<li>将一瓶基底膜在冰箱中或冰盒上过夜解冻。</li>
		<li>用适量的Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F12（DMEM/F12）稀释基底膜。由于每批基底膜浓度不同，需计算所需DMEM/F12的体积，使终浓度为1 mg/mL。分装成0.5 mL或1 mL等份，于-20 °C保存。 
		注意：步骤1.3.2需在冰上、生物安全柜内操作。</li>
		<li>解冻0.5 mL基底膜分装液，并用6 mL DMEM/F12稀释，充分混匀。</li>
		<li>使用移液器将250 µL稀释后的基底膜溶液加入24孔板的每个孔中。根据不同规格的培养板，根据每孔表面积计算所需体积，例如6孔板为每孔1 mL。</li>
		<li>将培养板置于37 °C培养箱中孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商说明书，将Fura-2 AM溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成1 mM的分装液，并于-20 °C保存。</li>
</ol>
2. 培养 hiPSC-CMs
<ol>
	<li>在37 °C水浴中解冻一管hiPSC-CMs。将解冻后的管内内容物转移至15 mL离心管中。以滴加方式向细胞中加入10 mL重铺培养基。</li>
	<li>在100 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入1 mL重铺培养基。轻轻吹打沉淀，重悬细胞，并去除任何细胞团块。</li>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞数量进行计数。</li>
	<li>移除已孵育平板上的基底膜，并更换为重铺培养基。</li>
	<li>将细胞以适当的密度接种于涂有基底膜（例如，24孔板每孔250,000个细胞）的6/12/24/48/96孔板中。 
	注：进行Ca2+瞬变实验时，应将细胞接种于玻璃底板上。</li>
	<li>次日更换为hiPSC-CM培养基，并随后每隔一天使用24孔板每孔0.5 mL的培养基进行换液。</li>
	<li>待hiPSC-CMs从解冻和重铺中恢复后，进行收缩力测量（本方案中为重铺后3–5天）。 
	&#8203;注：若细胞重铺不均，可能出现部分细胞群与其他重铺细胞无接触，从而表现出不规则或不同步的搏动模式。为避免不同步现象，建议细胞分布均匀，并在每个孔内形成同步且良好连接的hiPSC-CMs单层细胞层。</li>
</ol>
3. 收缩力测量
<ol>
	<li>开启基于光学的测量系统、显微镜发光二极管（LED）光源和计算机（参见材料表）。</li>
	<li>打开程序并新建一个文件。在屏幕左上角的文件菜单下，点击新建。</li>
	<li>点击采集，选择实验，然后选择“iPSC + 钙离子”。</li>
	<li>打开环境控制装置。将温度设置为 37 °C，CO2 浓度设置为 5%。</li>
	<li>将 hiPSC-CM 培养基更换为 Tyrode 溶液（24 孔板中每孔 0.5 mL）。&#160;将培养板盖替换为环境控制盖。 
	注：如果需要进行钙瞬变测量，请按照第 4 节所述方法用 Fura-2 AM 对细胞进行负载。</li>
	<li>当环境控制装置显示温度达到37 °C后，将培养板放入基于光学的测量系统中。 
	注：收缩活动通过明场条件进行测量。</li>
	<li>在工具栏下方点击打开细胞查找器，等待新窗口弹出。在屏幕右上角，选择板型格式和孔。</li>
	<li>选择一个孔，在孔内选择一个可观察到同步收缩与舒张的区域，按下开始，点击添加测量。&#160;在设置中选择测量持续时间（每个区域 10 秒）。立即舍弃不同步收缩的测量结果，并选择新区域。 
	注：实时收缩瞬变可在显示器上观察到。对于同步收缩，可观察到平滑连续的瞬变曲线；而对于不同步收缩，则会出现额外的小峰。</li>
	<li>根据孔的大小，在孔内测量多个区域。例如，若要遵循本研究方案，在 24 孔板中每孔测量 10 个区域。如果仅需基线测量且不计划测试任何化合物，则从步骤 3.13 继续操作。</li>
	<li>完成一个孔内各区域的测量后，按下完成，打开基于光学的测量仪器，向孔中加入应激剂/化合物（例如，溶解于Tyrode溶液中的500 nM ISO）。</li>
	<li>根据目标化合物选择合适的孵育时间（本方案中使用ISO时为2 分钟）。</li>
	<li>点击自动测量，使基于光学的测量仪器在之前进行基线测量的相同区域重复测量，从而实现孔内配对测量。</li>
	<li>当孔内所有测量完成后，按下完成。</li>
	<li>从屏幕右上角选择下一个孔。</li>
	<li>继续完成所有所需孔的测量。</li>
	<li>当所有所需孔均测量完毕后，点击停止并保存文件。 
	&#8203;注：环境控制用于维持稳定的 CO2 水平，从而能够以高速方式测量化合物/应激剂对 hiPSC-CMs 的影响。</li>
</ol>
4. 钙瞬变测量
<ol>
	<li>配制 37 °C 的 Tyrode 溶液。</li>
	<li>将 Fura-2 AM 分装物溶解于 Tyrode 溶液中，使终浓度为 1 µM 的 Fura-2 AM 加入细胞中。 
	注意：使用 Fura-2 AM 时，应关闭超净台内的照明灯，以尽量减少光照暴露。</li>
	<li>吸除培养基，并替换为含有 Fura-2 AM 的 Tyrode 溶液。</li>
	<li>在 37 °C 的培养箱或基于光学的检测系统中孵育 15 分钟。</li>
	<li>移除含 Fura-2 AM 的 Tyrode 溶液，随后用新鲜的 Tyrode 溶液洗涤两次。最后，将细胞在 Tyrode 溶液中于 37 °C 再次孵育 5 分钟，以完成 Fura-2 AM 的去酯化。</li>
	<li>将培养板放入基于光学的检测系统中，并按照第 3 节所述开始测量。 
	&#8203;注意：在步骤 4.6 中，当与收缩力测量同时开始时，可记录到比率型钙瞬变信号：在 100 µm 范围内以 340 nm 和 385 nm 激发，发射光收集波长为 510 ± 40 nm。除收缩力曲线外，实时的比率型钙瞬变曲线也将显示在屏幕上。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>要分析数据，请点击桌面上的 CytoSolver。</li>
	<li>点击 import，然后选择要分析的文件。</li>
	<li>程序完成分析后，观察屏幕上显示的被接受（蓝色）和被拒绝（红色）的瞬变信号（图1A）。 
	注意：此处使用了以下默认拒绝标准，由信噪比（SNR）和拟合优度（R2）定义：收缩瞬变信号的 R2 &#62; 0.9 且 SNR &#62; 4；钙瞬变信号的 R2 &#62; 0.5 且 SNR &#62; 3。用户可根据测量质量、细胞质量以及研究者的主要研究目标调整这些拒绝标准。例如，若研究者主要关注舒张动力学，则可适当降低达峰时间相关参数的标准；若获得的钙瞬变信号非常强，则可能需要提高 SNR 阈值，以排除噪声较大的数据。</li>
	<li>点击 export，并勾选平均瞬变数据。在电子表格中查看已分析的数据。</li>
	<li>关闭计算机及所有其他仪器。</li>
</ol>

Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in hiPSC-CMs

<ol><li>Tsao, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2022+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 145 (8), e153(2022).</li>
<li>Ghionzoli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+emerging+drug+targets+in+heart+failure+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current and emerging drug targets in heart failure treatment.</a> Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).</li>
<li>Criscione, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-on-a-chip+platforms+and+biosensor+integration+for+disease+modeling+and+phenotypic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening.</a> Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840(2023).</li>
<li>vander Velden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+and+animal-free+innovations+for+cardiovascular+research%3A+current+status+and+routes+to+be+explored.+Consensus+document+of+the+ESC+Working+Group+on+Myocardial+Function+and+the+ESC+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart.</a> Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).</li>
<li>Maddah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+platform+for+functional+characterization+of+stem-cell-derived+cardiomyocytes+with+applications+in+cardiotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).</li>
<li>Sala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUSCLEMOTION%3A+A+versatile+open+software+tool+to+quantify+cardiomyocyte+and+cardiac+muscle+contraction+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+fluorescent+tagging+of+endogenous+proteins+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy-linked+mutation+in+troponin+T+causes+myofibrillar+disarray+and+pro-arrhythmic+action+potential+changes+in+human+iPSC+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).</li>
<li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP3R-mediated+compensatory+mechanism+for+calcium+handling+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+with+cardiac+ryanodine+receptor+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772(2020).</li>
<li>Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SuperPlots%3A+communicating+reproducibility+and+variability+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology.</a> The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064(2020).</li>
<li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+maturation%3A+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li>
<li>Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+on-axis+platform+for+all-optical+electrophysiology+with+near-infrared+probes+in+human+stem-cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).</li>
<li>van Meer, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+excitation-contraction+coupling+parameters+identifies+mechanisms+underlying+contractile+responses+of+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 10 (1), 4325(2019).</li>
</ol>

EM 是 CytoCypher BV 的雇员。MH 是 CytoCypher BV 的首席执行官。其余作者声明，本研究是在不存在任何可被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

本研究描述了一种对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）进行收缩力和钙瞬变测量的方法，并可用于研究应激源或药物对这些细胞的影响。收缩力测量、比率法钙成像以及对异丙肾上腺素（ISO）的反应性，在三次独立的细胞分化批次中作为生物学重复进行。每个生物学重复包含三个孔的技术重复。采用此种方式进行测量的目的是确保能够评估样本及检测平台的生物学变异性和技术变异性。除了合理设置生物学重复和技术重复的数量外，hiPSC-CMs的培养条件对于获得稳定且可靠的结果也可能起到关键作用。在实验过程中，需保持对各项标准的一致性，例如hiPSC-CMs的培养天数、培养基成分、重铺板条件以及化合物孵育时间等。在本研究中，单个孔内完成11个区域各两次、每次10秒的测量平均耗时568 ± 24秒，其中包括79 ± 11秒的ISO孵育时间。总体约为每孔10分钟，据此研究人员可在约4小时内完成整块24孔板的检测。气候控制系统用于维持稳定的CO2浓度，从而实现对化合物或应激因素作用于hiPSC-CMs效应的高速检测。
为了测量诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）的收缩功能，目前已有一些依赖光遗传学13或基于无标记视频显微镜技术的系统5,6。光遗传学系统较为复杂，需要特殊技术才能获取电生理和/或收缩力数据。其他系统依赖于对视频的后期分析，这需要大量存储空间，并且在视频采集过程中缺乏实时反馈。此外，要实现足够的时空分辨率较为困难，可能导致采样不足。同样，使用CRISPR/Cas9编辑并携带荧光报告基因的hiPSC-CMs7可能会对心肌细胞行为产生非预期的影响。&#160;使用荧光染料进行收缩-舒张测量也是一种优雅的方法，但限制了对同一样本进行长期连续实验的可行性14。
然而，这种基于光学的测量平台可用于测量收缩-舒张时间，而无需使用任何荧光染料或侵入性方法。但是，由于像素相关性不提供空间信息，该方法无法用于测量收缩力的强度，而只能可靠地检测收缩和舒张速度的变化。所引入的测量系统具有温度控制功能，能够以每秒超过&#62;200帧的分辨率实时获取钙信号和收缩力数据。此外，系统会记录每次测量的位置，从而实现配对测量，提高实验的统计效能。同时，该平台使研究人员能够在实验结束后立即存储数据并进行即时分析。总体而言，这种基于光学的测量系统是一种研究细胞病理机制的有前景的方法，可评估化合物对人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）功能的影响，并有助于药物筛选的临床前研究过程。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65326">Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes</a>. The Authors section was updated from:
Rafeeh Dinani1,2 
Emmy Manders1,2,3 
Michiel Helmes1,2,3 
Lili Wang4 
Bjorn Knollmann4 
Diederik W. D. Kuster1,2 
Jolanda van der Velden1,2 
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University 
2Heart Failure &#38; Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences 
3CytoCypher BV 
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine
to:
Rafeeh Dinani1,2 
Emmy Manders1,2,3 
Michiel Helmes1,2,3 
Lili Wang4 
Bjorn C. Knollmann4 
Diederik W. D. Kuster1,2 
Jolanda van der Velden1,2 
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University 
2Heart Failure &#38; Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences 
3CytoCypher BV 
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65326">Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

心力衰竭是全球范围内导致死亡的首要原因。2019年，心血管疾病在全球造成1860万人死亡，相较于过去十年增长了17.1%1。尽管研究人员已努力寻找预防和治愈心力衰竭的药物靶点，但患者的预后仍然不佳2。动物模型与人类在病理生理学上的差异，可能是限制心力衰竭治疗方案优化取得成功的关键因素之一3。因此，亟需开发更多具有人类特征的模型，以模拟疾病过程，并评估新型药物化合物的毒性和疗效。
由人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）是一种强大的工具，可用于阐明由应激因素、缺血、代谢改变或致病性基因变异所引发的细胞病理机制，以及药物干预的有效性和毒性4。为了明确这些因素对hiPSC-CMs功能特性的影响，需要一种能够以无偏倚且可重复的方式高速测量细胞收缩的收缩期和舒张期特性的系统。本研究的总体目标是证明，基于光学的系统是一种用于实时分析hiPSC-CMs功能参数的有力工具。
目前，已有多种平台可用于评估hiPSC-CMs的收缩能力。然而，现有系统要么读出速度较慢，要么所需细胞数量可能难以满足。无标记视频测量系统5,6依赖于对视频的后期分析，这需要大量存储空间，并且在视频采集过程中缺乏实时反馈。此外，实现足够的时空分辨率较为困难，可能导致采样不足。其他测定心肌细胞特性的方法，例如使用携带荧光报告基因的CRISPR/Cas9编辑hiPSC-CMs7，可能干扰细胞的基因稳定性，并需要专业的实验室技术。
为克服上述局限性，本研究开发并引入了一种独特的基于光学的测量系统。该平台通过将未经修饰的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）重新接种到任意所需板型上，即可实现收缩力的测量，且不受板尺寸的限制。此外，实时测量可直接观察和分析 hiPSC-CMs 的功能参数，从而提供一个可即时调整和优化实验方案的实验环境。同时，每次测量的位置均被记录，可在同一样本上进行配对测量，从而提高实验的统计效力。
为了演示基于光学的系统，对一个对照组 hiPSC-CM 细胞系进行了收缩力测量。该对照组 hiPSC 细胞系来源于一名核型正常的健康男性供体的皮肤成纤维细胞8。收缩动力学在 37 °C 下进行测量，通过分析相对于舒张期参考帧的像素相关性变化，以 250 Hz 的采样频率采集数据。由于收缩的精确起始点并不总能明确确定，因此将达到峰值高度 20% 时的时间点（达峰时间 20%）作为测量达峰时间的起始点。采用此方法可减少该参数在同一样本内的变异性。类似地，由于信号恢复至基线的确切时刻难以判断，因此采用从峰值恢复至基线 80% 所需的时间（恢复至基线时间 80%）来描述舒张时间。
整体收缩性测量包括静息搏动频率、从20%峰值到峰值收缩的时间（TP.Con），以及从峰值收缩到恢复至基线水平80%的时间（TB.Con）。80) (图1B）。为了检测应激源的作用，将细胞与异丙肾上腺素（ISO）共同孵育。此外，在进行收缩力测量的同时，检测钙2+ 通过以 Fura-2-乙酰甲氧基酯（Fura-2 AM）负载细胞，并在 250 Hz 的采样频率下检测，测量钙瞬变。比率法钙2+ 测量9 使用超速开关在50 µm直径的照明区域上进行，该区域对应于收缩力测量的区域。Ca2+ 测量数据表示为 Ca 达到峰值的 20% 至峰值的时间2+ 瞬态（TP.Ca）以及从峰值到基线值80%的时间（TB.Ca）80) (图1C采用一种快速、自动化的数据分析工具，计算每个区域的平均收缩和钙动力学参数。

<table><tbody><tr><td>&amp;micro;-24孔黑板，内径14 mm</td><td>ibidi</td><td>82421</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓缩）</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CytoSolver瞬时分析工具</td><td>CytoCypher</td><td></td><td>一种快速自动化的数据分析工具</td></tr><tr><td>DMEM/F-12培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM</td><td>Thermo Fisher</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>盐酸异丙肾上腺素</td><td>Merck</td><td>15627</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut&amp;trade; 血清替代物</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Merck</td><td>CLS3542C</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>配备尼康20倍Super Fluor物镜、730 nm LED光源和Ionwizard软件的MultiCell CytoCypher系统</td><td>CytoCypher</td><td></td><td>基于光学的测量系统</td></tr><tr><td>ROCK抑制剂Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode溶液</td><td></td><td></td><td>自行配制溶液，各组分终浓度如下：NaCl 134 mM、KCl 5 mM、Hepes 12 mM、MgSO4 1.2 mM、NaH2PO4·H2O 1.2 mM、葡萄糖 11 mM、丙酮酸钠 5 mM、CaCl2 1 mM</td></tr></tbody></table>

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

由人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）是研究突变介导的心肌细胞功能变化以及明确应激因素和药物干预效应的有力工具。本研究展示了该基于光学的系统是一种评估二维培养条件下hiPSC-CMs功能参数的强大平台。利用此平台，可在温度环境良好维持的条件下，针对不同板式布局进行配对测量。此外，该系统可为研究人员提供即时的数据分析功能。
本文介绍了一种测量未经修饰的hiPSC-CMs收缩力的方法。收缩动力学在37 °C下进行测量，基于与舒张状态参考帧相比的像素相关性变化，采样频率为250 Hz。此外，可通过加载钙敏感荧光染料（如Fura-2）来同步获取细胞内钙瞬变的测量数据。利用超速切换装置，可在直径为50 µm的照明区域上进行比例式钙测量，该区域与收缩力测量区域相对应。

按照本方案，对hiPSC-CMs的收缩力、Ca2+瞬变及对化合物的反应进行了测量。通过使用基于光学的检测系统，可将hiPSC-CMs简单地重铺至所需培养板上，随后即可进行收缩力检测。收缩力通过计算目标区域（ROI）内像素与参考帧的相关性来测定，检测区域为100 µm × 100 µm，采集速率为每秒250帧。参考帧由系统在舒张末期自动识别确定。在进行收缩检测的同时，同步记录比率型钙瞬变信号。
本研究采用三次不同的分化过程作为三个生物学重复。每次分化实验中，每个样本设置三个孔作为技术重复进行检测。实验使用24孔板进行，每孔内检测10个区域。测量完成后，立即使用CytoSolver程序对数据进行分析。报告的参数包括对照组hiPSC-CMs的静息搏动频率、TP.Con以及TB.Con80（图2A–C）。为了直观展示各参数数据的变异性，每孔内的测量值以及每次分化过程中三个孔的平均值以超级图（superplot）形式呈现10。为进一步评估每次分化实验内部以及三次分化实验之间的数据变异性，计算了各参数的变异系数（图2D）。如图2D所示，对应于同一个生物学重复的技术重复数值彼此非常接近（即变异系数较低），表明该方法具有良好的稳健性。
该应用非常适合用于检测药物效应。在此实验中，测试了500 nM ISO（一种非选择性β-肾上腺素能受体激动剂）对对照组hiPSC-CMs收缩力的影响。已知该化合物可提高心率并产生正性舒张作用。如图3A所示，ISO显著增加了所有孔中的搏动频率。ISO还加快了收缩和舒张动力学，表现为TP.Con和TB.Con80的降低（图3B、C）。总体而言，在ISO孵育后，所有孔的搏动频率均显著增加，同时收缩和舒张时间缩短，表明该平台成功记录了对此化合物的预期反应。
在进行收缩力测量的同时，也进行了钙离子测量。与收缩力数据（图2）类似，hiPSC-CMs的钙离子测量数据如图4所示。TB.Ca80的持续时间明显长于分离的大鼠或小鼠心肌细胞，这在一定程度上可归因于物种差异和心率不同11，同时也与hiPSC-CMs中钙处理功能不成熟有关，表现为肌浆网内的钙离子动态较低，以及钙处理相关蛋白的表达水平低于原代心肌细胞12。与收缩力数据类似，钙离子测量的变异系数也进行了计算，结果显示技术重复和生物学重复之间的变异性较低（图4C）。
<img alt="瞬态吸收光谱分析；光激发测量图；数据拟合结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65326/65326fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：实验后立即使用 CytoSolver 瞬态分析工具分析数据。（A）一个孔内某一区域测得的可接受瞬态信号示例（均为蓝色）。图A1显示收缩瞬态信号，图A2表示钙瞬态信号。（B）从一轮分化中三个孔的测量数据获得的平均收缩瞬态信号。从每个单个或平均的收缩瞬态信号中，可提取收缩达峰时间（TP.Con）和回到基线时间（TB.Con）等不同时间点的数据。由于收缩起始点并不总能明确判定，因此采用达峰时间20%作为测量达峰时间的起点。类似地，信号返回基线的确切时刻也难以判断，因此采用回到基线80%的时间来描述舒张时间。本研究中使用 TP.Con（达峰时间－达峰时间20%）和 TB.Con80（回到基线80%－达峰时间）作为参数。（C）从一轮分化中三个孔的测量数据获得的平均钙瞬态信号。从每个单个或平均的钙瞬态信号中，可提取钙信号达峰时间（TP.Ca）和回到基线时间（TB.Ca）等不同时间点的数据。达峰时间的测量以达峰时间20%为起点，回到基线时间则以回到基线80%为终点。本研究中采用 TP.Ca（达峰时间－达峰时间20%）和 TB.Ca80（回到基线80%－达峰时间）作为参数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65326/65326fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="搏动频率和变异系数分析；散点图与数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65326/65326fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：在三轮不同分化过程中进行的基础收缩性测量。 每轮分化包含三个生物学重复，每个生物学重复包含三个孔（即三个技术重复）。每轮分化中的三个主要符号代表各孔内所测区域的平均值（背景中颜色较淡的符号）。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。静息搏动频率的数据单位为赫兹（Hertz），TP.Con 和 TB.Con80 的数据单位为秒。(A) 静息搏动频率。(B) 达峰时间（TP.Con）。(C) 回到基线 80% 的时间（TB.Con80）。(D) 为评估每轮分化内及三轮分化之间的数据变异情况，使用各孔的平均值计算了变异系数百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65326/65326fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基线及异丙肾上腺素处理后的搏动频率、收缩达峰时间（TP.Con）和恢复至基线80%时间（TB.Con80）分析，含ISO处理的统计柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65326/65326fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：三轮分化实验中三个孔板在基础状态（-）及异丙肾上腺素（ISO）孵育后（+）的收缩功能参数测量结果。（A）基础状态下的静息搏动频率（-）以及500 nM ISO孵育后的搏动频率（+）。（B）基础状态和ISO孵育后收缩达峰时间（TP.Con）的测量结果。（C）基础状态和ISO孵育后恢复至基线80%时间（TB.Con80）的测量结果。为评估ISO对收缩功能参数的影响，采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）并进行Bonferroni校正。数据以均值±标准误（SEM）表示。静息搏动频率数据单位为赫兹（Hertz），TP.Con与TB.Con80数据单位为秒（s）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65326/65326fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="比较分析图；TP.Ca、TB.Ca₈₀ 数据；变异系数、统计趋势。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65326/65326fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：在三轮分化过程中，来自三个孔的钙瞬变基线测量结果。（A）达峰时间（TP.Ca）和（B）恢复至基线80%的时间（TB.Ca80）的钙瞬变数据。数据以均值±标准误（SEM）表示。TP.Ca 和 TB.Ca80 数据单位为秒。（C）为评估每轮分化内及三轮分化之间的数据变异情况，采用各孔的平均值计算变异系数百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65326/65326fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）是研究突变介导的心肌细胞变化的有力工具...

由人诱导性多能干细胞分化而来的心肌细胞是研究基因突变引起的心肌细胞功能变化以及定义应激因素和药物干预效应的有力工具。目前亟需一个能够以用户友好且可重复的方式同时检测此类心肌细胞收缩功能和钙处理能力的实验平台。本方法使研究人员能够通过像素相关性分析检测人诱导性多能干细胞分化心肌细胞的收缩性，同时利用钙离子敏感性染料FloA-PhoR对细胞进行负载，以同步测量细胞内钙瞬变。通过使用该平台，可以在温度环境保持良好的条件下，对不同板型进行各项测量，并即时访问数据。该方法能够研究细胞病理机制，评估化合物的作用效果以及人源诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的功能，从而有助于临床前药物筛选过程。首先，打开基于光学的测量系统、显微镜发光二极管光源以及计算机。在计算机上启动程序，点击屏幕左上角“文件”下的“新建”以打开一个新文件。点击“采集”，选择“实验”，然后选择“IPSC 和钙离子测量”。接下来，在24孔板中，将人源IPSC心肌细胞培养基更换为每孔0.5毫升的台氏液。将培养板盖替换为气候控制盖，并将培养板放入设备的光学空间测量系统中，调节温度至37摄氏度。点击工具栏下方的“打开细胞查找器”，等待新界面出现。在屏幕顶部的腔室类型和孔板格式中选择相应的培养板规格。选择一个孔，并在孔内选择一个区域以观察同步的收缩和舒张。按下屏幕左下角的“开始”按钮，然后点击“添加测量”以测量该区域。在24孔板中，每孔测量约10个区域。若仅进行基线测量，继续测量下一孔的区域。若需测试化合物，在完成单孔内所有区域的测量后，点击“完成”。打开基于光学的测量仪器，并将所需的应激物或化合物加入孔中。在设定的时间段孵育后，单击自动测量，以在与基线测量相同的位置进行配对测量。完成所有测量后，按完成。从屏幕右上角选择下一个孔，并继续对所有需要的孔进行测量。完成所有需要的孔的测量后，单击停止并将文件保存到指定位置。将Fura-2 AM分装液溶解于Tyrode溶液中，配制成终浓度为1 µM的Fura-2 AM溶液，用于加入细胞中。吸除培养基，加入含有Fura-2 AM的Tyrode溶液，在37摄氏度的培养箱或基于光学的检测系统中孵育15分钟。移除含Fura-2 AM的Tyrode溶液，用新鲜的Tyrode溶液洗涤孔板两次。最后，将细胞在Tyrode溶液中于37摄氏度继续孵育5分钟，以完成Fura-2 AM的去酯化。将培养板放入基于光学的检测系统中，开始进行收缩力测定。选择一个孔。在孔内选择一个可观察到同步收缩和舒张的区域，然后点击开始并添加测量。除了收缩力曲线外，实时比率计量的钙瞬变也会显示在屏幕上。要分析数据，请点击桌面上的 Cytosolver。从文件菜单中点击导入，然后选择要分析的文件。分析完成后，在屏幕上观察被接受和被拒绝的瞬态信号。单击屏幕左上方的“导出”按钮，并启用平均瞬态数据。将其导出为 Excel 文件，然后点击“导出”。在电子表格中检查已分析的数据。关闭计算机及所有其他仪器。使用 Cytosolver 程序分析收缩性测量结果，并报告对照组人源诱导多能干细胞衍生心肌细胞的静息/搏动频率、达峰收缩时间及恢复至基线收缩时间等参数。应用 500 纳摩尔的异丙肾上腺素（iso，一种非选择性β肾上腺素受体激动剂）后，所有孔中的搏动频率均显著增加。Iso 还加快了收缩动力学，表现为达到峰值收缩力的时间和恢复至基础收缩力水平的时间均缩短。与收缩力类似，钙离子信号的测量结果也进行了分析，并报告了相关参数。

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