Name: 从小鼠心脏祖细胞中分离细胞核，用于单细胞分辨率的表观基因组和基因表达谱分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学习从小鼠心脏祖细胞中分离细胞核的方法，用于单细胞分辨率的表观基因组和基因表达谱分析。该技术有助于研究心脏发育中的细胞异质性及先天性心脏缺陷的分子机制。

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本研究得到了ERA-CVD-2019和ANR-JCJC-2020对SS的资助。我们感谢马赛医学遗传学实验室U 1251/基因组学与生物信息学平台（GBiM）以及匿名审稿人提供的宝贵意见。

本研究采用的动物实验方案已获得马赛大学（Aix-Marseille University，C2EA-14）动物伦理委员会的批准，并依照国家动物实验伦理委员会指定机构批准的方案进行（法国国民教育、高等教育与研究部；授权编号 Apafis N°33927-2021111715507212）。
1. 解剖前设置定时交配
<ol>
	<li>为获取小鼠胚胎，需在心脏区域分离前9.5天进行定时交配。本实验中使用2-6月龄的野生型C57BL/6J小鼠，并在夜间进行定时交配。</li>
	<li>次日早晨检查雌鼠是否形成阴道栓。将发现阴道栓的当天记为胚胎发育第0.5天（E0.5）。</li>
</ol>
2. 组织制备与细胞分离
<ol>
	<li>在受孕后第9.5天处死2至6月龄的C57BL/6J妊娠雌性小鼠 通过 CO2 随着浓度增加，随后进行颈椎脱位。用70%乙醇清洁腹部下部。 
	注意：不建议在颈椎脱位前使用麻醉剂，因为这会使胚胎暴露于可能影响后续转录组学和表观基因组学研究的环境变化中。</li>
	<li>用剪刀打开腹腔和腹膜。观察子宫角，并用镊子切除两侧子宫角。</li>
	<li>将角放入含有冷的完全培养基（含1% FBS）的培养皿中。虽然对体积没有特定要求，但需注意确保胚胎完全浸没在培养基中。每10 cm培养皿使用约10 mL培养基较为合适。</li>
	<li>在体视显微镜下将放大倍数设为5倍，使用镊子从每个胚胎中去除子宫内膜组织、胎盘和卵黄囊。</li>
	<li>将胚胎置于含有1% FBS的冷完全培养基的培养皿中。按照示意图中所示胚胎的示意，解剖胚胎心脏区域 图1，置于冰冷的完全培养基中。</li>
	<li>将五只小鼠胚胎解剖所得的心脏组织汇集至一个1.5 mL微量离心管中。预先将水平转子离心机冷却至4 °C。</li>
	<li>300 × g 离心x g 在室温下以摆桶式离心机离心1分钟。弃去上清液，加入1 mL组织培养级PBS洗涤组织。</li>
	<li>300 x g 离心 g 室温下孵育1分钟。移除上清液，并重复洗涤步骤，共洗涤两次。重复洗涤两次，每次用0.05%胰蛋白酶/EDTA（1×）替代PBS。</li>
	<li>组织消化时，在37 °C下加入50 µL 0.25%胰蛋白酶/EDTA，孵育10分钟。5分钟后，使用宽孔滤芯吸头通过上下吹打进行轻柔的机械解离。</li>
	<li>通过向解离的细胞中加入 350 µL 完全培养基以终止胰蛋白酶消化反应。将重悬的细胞经 40 µm 细胞滤网过滤。</li>
</ol>
3. 细胞计数与活力评估
注意：细胞数量和活力是单细胞实验成功的关键参数。snATAC-seq 方法对细胞数量的微小变化非常敏感。细胞数量过少会导致染色质过度消化，从而产生更多的测序读段，并导致不可及的染色质区域被检测到（噪声增加）。同样，细胞数量过多则会产生难以测序的高分子量片段。为了准确定量细胞和细胞核浓度，采用两种不同方法对细胞数量和活力进行了评估。
<ol>
	<li>按照下述方法进行台盼蓝染色法细胞计数。
	<ol>
		<li>涡旋混匀0.4%台盼蓝染色液，在室温下以2,000 × g 离心10秒，并将10 µL转移至微量离心管中。</li>
		<li>使用移液器混匀细胞悬液，取10 µL细胞悬液加入已分装好的10 µL台盼蓝溶液中。用移液器轻轻吹打混匀10次。</li>
		<li>取10 µL染色后的细胞悬液加入细胞计数板中。将计数板放入细胞计数仪，自动计算细胞浓度和活率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照下述方法进行基于荧光的细胞死亡率评估。 
	注意：该检测基于荧光染料（碘化丙啶同源二聚体-1，EthD-1，以及钙黄绿素AM）评估细胞活力。使用市售试剂盒，并按照供应商提供的说明进行试剂的配制和使用。
	<ol>
		<li>取5 µL提供的2 mM EthD-1储备液加入1 mL无菌组织培养级D-PBS中，配制成10 µM EthD-1溶液，涡旋混匀5秒以确保充分混合。</li>
		<li>将2.5 µL提供的4 mM钙黄绿素AM储备液加入已配制的EthD-1溶液中，涡旋混匀5秒以确保充分混合。</li>
		<li>取10 µL配制好的10 µM EthD-1和10 µM钙黄绿素AM工作液，加入10 µL细胞悬液中。 
		注意：钙黄绿素在水溶液中极易水解，因此工作液应在1天内使用完毕。</li>
		<li>取10 µL染色后的细胞悬液滴加至细胞计数板上，将计数板插入自动荧光细胞计数仪中。使用GFP滤光片计数活细胞，使用RFP滤光片计数死细胞。 
		注意：两种计数方法所得细胞数量和活率结果相似，新鲜解离的细胞总数估计约为每胚胎心脏区域（0.06 mm3）20,000个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞冻存
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心细胞悬液 5 分钟。小心移除上清液，避免接触管底，然后将沉淀重悬于 1 mL 预冷的冻存液中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至预冷的冻存管中，并将冻存管放入预冷的冻存盒内。</li>
	<li>将冻存盒置于 −80 ◦C 环境中 4 至 8 小时。随后将冻存管转移至液氮中，用于后续的单核 RNA 测序和 ATAC 测序实验。 
	&#8203;注意：冻存管在使用前应以干冰运输。根据我们的经验，细胞在液氮中可保存至少 6 个月，且细胞活力不会下降。储存温度应始终低于 −150 °C，以防止冰晶形成。</li>
</ol>
5. 细胞复苏与死细胞去除
<ol>
	<li>将冻存管置于 37 °C 水浴中 1-2 分钟。当冻存管中仅剩微小晶体时，立即取出。</li>
	<li>加入 1 mL 预热（37 °C）的完全培养基，用移液器轻轻吹打混匀 3 次。将细胞悬液转移至含有 10 mL 温热完全培养基的 15 mL 锥形离心管中。</li>
	<li>将全部细胞悬液通过 30 µm 细胞筛过滤。用 1-2 mL 温热完全培养基冲洗细胞筛，将滤过液收集至同一锥形离心管中。</li>
	<li>以 300 x g 离心 5 分钟，弃上清液。用 PBS 洗涤一次，将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>以 300 x g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入 100 µL 提供的磁性微珠，使用宽口移液器吸头吹打混匀 5 次。室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>在此期间，用 500 µL 1x 结合缓冲液冲洗磁性分离柱（容量：1 x 107 至 2 x 108 个细胞）。</li>
	<li>孵育结束后，用 500 µL 1x 结合缓冲液稀释含微珠的细胞悬液。</li>
	<li>将细胞悬液（0.6 µL）加至已准备好的磁性分离柱中。流穿部分为阴性分选的活细胞组分，磁性滞留部分为阳性分选的死细胞。</li>
	<li>将活细胞流出液收集至 15 mL 离心管中。用 2 mL 1x 结合缓冲液冲洗盛有细胞悬液的 1.5 mL 微量离心管及磁性分离柱，并将冲洗液收集至同一 15 mL 离心管中。</li>
	<li>以 300 x g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>加入 1 mL PBS-BSA 溶液，使用宽口移液器吸头轻轻吹打 5 次混匀。将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>以 300 x g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>加入 1 mL PBS-BSA 溶液重悬细胞沉淀，并重复洗涤步骤，共洗涤两次。</li>
	<li>将细胞重悬于 100 µL PBS-BSA 溶液中，用移液器轻轻吹打 10 次混匀。</li>
	<li>使用前述方法（步骤 3.1 和步骤 3.2）测定细胞浓度和活力。进行下一步前，确保细胞数量 ≥100,000 个。代表性结果见 图 2。 
	&#8203;注意：冻存过程会导致活细胞起始材料损失约 40%。根据起始细胞数量，磁珠柱分离可获得高细胞活力，但总细胞数量会减少至原来的二分之一至五分之一。建议仅在起始材料充足时使用基于柱的磁珠试剂盒去除死细胞。</li>
</ol>
6. 细胞核分离
注意：单核ATAC和单核RNA测序联合实验需使用纯净且完整的细胞核悬液。建议针对所用细胞类型优化裂解条件（裂解时间和NP40浓度）。最佳裂解时间点和去垢剂浓度应是在不破坏细胞核形态的前提下，使尽可能多的细胞被裂解。使用水平转子离心机替代固定角转子离心机可减少细胞/细胞核的损失。为最大限度减少细胞核在塑料器皿上的残留，建议使用低吸附型移液器吸头和离心管，这有助于提高细胞核回收率。使用5% BSA对移液器吸头和离心管进行包被是一种成本较低但耗时较长的替代方案。
<ol>
	<li>使用70%乙醇和RNase去除溶液清洁工作区域和材料。</li>
	<li>将摆动桶离心机预冷至4 °C。新鲜配制裂解缓冲液、裂解稀释缓冲液、0.1x裂解缓冲液和洗涤缓冲液（见表1）。将缓冲液置于冰上保存。</li>
	<li>在摆动桶离心机中，以500 x g 在4 °C下离心细胞悬液5分钟。小心移去上清液，避免触碰管底，以防扰动细胞沉淀。</li>
	<li>加入100 µL预冷的0.1x裂解缓冲液，通过移液器轻柔吹打10次混匀。冰上孵育5分钟。</li>
	<li>加入1 mL预冷的洗涤缓冲液，用移液器轻柔吹打5次混匀。在4 °C下以500 x g 离心5分钟。移去上清液时避免破坏核沉淀。</li>
	<li>用预冷的洗涤缓冲液重复洗涤，共进行三次洗涤。配制稀释的核缓冲液。重悬后，将核储存液置于冰上保存。</li>
</ol>
7. 分离细胞核的质量与数量评估
注意：根据初始细胞计数，并估计细胞裂解过程中约有 50% 的细胞核损失，应将适当数量的细胞重悬于冰冷的稀释细胞核缓冲液中。使用预冷稀释细胞核缓冲液重悬的体积计算，需依据目标回收的细胞核数量以及制造商用户指南中推荐的相应细胞核储存浓度。该计算示例见补充方案 1。
<ol>
	<li>根据初始细胞数量，并估计细胞裂解过程中约有 50% 的细胞核损失，将适当数量的细胞重悬于冷的稀释细胞核缓冲液中。</li>
	<li>测定实际的细胞核浓度。取 2 µL 细胞核储备液与 8 µL 稀释细胞核缓冲液混合，然后将混合液加入预先分装好的 10 µL 台盼蓝或 EthD-1/CalceinAM 工作液中。使用自动细胞计数仪对细胞核进行计数。活细胞比例应低于 5%。代表性结果见图 3。</li>
	<li>计算所需细胞核储备液和稀释细胞核缓冲液的体积，以获得推荐用于转座反应浓度下的总体积 5 µL（参见试剂盒用户指南）。立即按照用户指南进行转座反应17。 
	&#8203;注意：从转座反应到 ATAC 和 GEX 文库构建的所有步骤均按照用于 snRNA-seq 与 snATAC-seq 联用试剂盒的用户指南进行17。</li>
</ol>
8. snRNA-seq 和 snATAC-seq 文库的质量分析
<ol>
	<li>在进行下一代测序之前，需验证最终的单核转座可及性测序（snATAC-seq）和基因表达（GEX）文库的质量及片段大小分布。使用片段分析系统评估文库中测序序列的质量和数量。代表性质量评估结果参见图4。 
	注意：snATAC-seq文库的最终图谱应显示出核小体缠绕的周期性特征，片段大小范围应在200 bp至数Kbp之间；而基因表达文库的片段大小范围应在300 bp至600 bp之间。</li>
</ol>

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells at Single-Cell Resolution

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过结合单核RNA测序（snRNA-seq）和单核ATAC测序（snATAC-seq）研究发育中心脏的细胞组成，有助于更深入理解先天性心脏病的发病机制26。多个研究实验室已探讨了心脏组织冷冻保存对snRNA-seq的影响27。在比较不同实验条件时，使用来自人类疾病小鼠模型的新鲜显微解剖组织进行snRNA-seq和snATAC-seq在操作上可能具有挑战性。对于特定发育阶段，一个难点在于对照组和实验组必须在同一轮实验中处理，以减少样本处理过程中引入的技术变异。当无法处理新鲜组织时，根据我们的研究结果，建议先进行组织解离，然后冷冻保存，而不是直接将整个胚胎心脏组织速冻。选择前一种方法的原因在于，若将心脏组织整体冷冻，解冻后获得有活力的单细胞将更加困难。然而，如果组织解离方案未经过优化，则整体速冻组织可能是更优选择。优先推荐解离后冷冻保存，因为该组织解离方案可获得&#62;90%的新鲜有活力细胞，且无细胞类型偏好性。
这种方法具有多个优势，例如可使用冻存细胞，从而无需新鲜组织；同时采用单细胞解...

在出生缺陷中，先天性心脏病（CHDs）最为常见，每年约发生在1%的活产婴儿中1,2。仅在少数病例中可识别出基因突变，表明其他病因（如基因调控异常）也参与了先天性心脏病的发病机制2,3。心脏发育是一个涉及多种相互作用细胞类型的复杂过程，这使得识别非编码区致病突变及其对基因调控的影响变得极具挑战性。心脏器官发生始于细胞前体，这些前体分化为不同类型的心脏细胞，包括心肌细胞、成纤维细胞、外膜细胞和内膜细胞4,5。&#160;单细胞基因组学正成为研究心脏发育以及评估细胞异质性在健康与疾病状态下影响的关键方法6。多组学技术的发展实现了对不同参数的同步检测，同时计算分析流程的不断拓展，促进了对正常和病变心脏中细胞类型及亚型的发现6。本文介绍了一种可靠的单细胞核分离方案，适用于从小鼠胚胎获取的冷冻心脏前体细胞，该方案可兼容后续的snRNA-seq和snATAC-seq分析（也可用于snRNA-seq与snATAC-seq联合分析）7,8,9。
ATAC-seq 是一种可靠的方法，可用于鉴定调控性开放染色质区域并确定核小体的位置10,11。这些信息可用于推断转录因子的位置、身份和活性。由于该方法在检测染色质结构的定量变化方面具有高度敏感性，因此还可用于分析染色质因子（包括染色质重塑复合物）以及RNA聚合酶的转录活性1,2。因此，ATAC-seq 提供了一种稳健且无偏倚的方法，用于揭示特定细胞类型中转录调控的机制。ATAC-seq 方案还已被验证可用于单细胞水平的染色质可及性检测，从而揭示细胞群体内染色质结构的异质性10,12,13。
尽管近年来单细胞研究领域取得了显著进展，但开展这些实验所需新鲜样本的处理仍是主要难题14。为克服这一困难，研究人员已开展多项测试，旨在利用冷冻的心脏组织或细胞进行snRNA-seq和snATAC-seq等分析15,16。
已有多种平台被用于分析单细胞基因组学数据17。目前广泛使用的单细胞基因表达和ATAC分析平台均基于多重微流控液滴包封技术17。由于这些平台依赖微流控腔室，碎片或聚集体可能堵塞系统，导致数据无法使用。因此，单细胞研究的成功取决于对单个细胞/细胞核的精确分离。
本文所述方案采用了一种与近期利用snRNA-seq和snATAC-seq研究先天性心脏病相似的方法18,19,20,21,22,23。该方法首先对新鲜显微解剖获得的心脏组织进行酶解离，随后对小鼠心脏前体细胞进行冷冻保存。解冻后，通过纯化获得活细胞，并进一步进行细胞核分离处理。在本研究中，该方案已成功用于从小鼠心脏前体细胞的同一批核制备物中获取snRNA-seq和snATAC-seq数据。

<table><tbody><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>Agilent</td><td></td><td>无目录编号</td></tr><tr><td>5M 氯化钠 (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>59222C-500ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10% BSA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A1595-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 芯片 J 单细胞试剂盒，16 次反应</td><td>10X Genomics</td><td>1000230</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 单细胞多组学 ATAC + 基因表达试剂套装，4 次反应（含 20X 细胞核缓冲液）</td><td>10X Genomics</td><td>1000285</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板载玻片</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess III FL</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>无目录编号</td></tr><tr><td>Digitonin (5%)</td><td>Thermofisher</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5x5ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190094</td><td>无菌且无 RNase</td></tr><tr><td>双索引试剂盒 TT Set A，96 次反应</td><td>10X Genomics</td><td>1000215</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>HI-FBS</td><td>Thermofisher</td><td>A3840001</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>高灵敏度 DNA 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒</td><td>Thermofisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>MACS 死细胞去除试剂盒：死细胞去除 MicroBeads，结合缓冲液 20X</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>McCoy 5A 培养基&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>NovaSeq 6000 S2</td><td>Illumina</td><td></td><td>无目录编号</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 (Pen/Strep)</td><td>Thermofisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer Mini 40&amp;micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>V-PM15-2021-12</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-333-M005</td><td></td></tr><tr><td>单索引试剂盒 N Set A，96 次反应</td><td>10X Genomics</td><td>1000212</td><td></td></tr><tr><td>标准 90 mm 无菌培养皿 Sterilin</td><td>Thermofisher</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>无菌双蒸水</td><td>Thermofisher</td><td>R0582</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 盐酸溶液 (HCl)</td><td>Sigma</td><td>T2194-100ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液 (0.4%)</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶 - 1X EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>宽口滤芯移液器吸头 200 &amp;mu;l</td><td>Labcon</td><td>1152-965-008-9</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS SteREO Discovery.V8</td><td>ZEISS</td><td></td><td>无目录编号</td></tr></tbody></table>

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

发育中的心脏是一个复杂的结构，包含多种由复杂调控机制控制的前体细胞。对单个细胞的基因表达和染色质状态进行检测，可以识别细胞类型和状态。单细胞测序技术已揭示了心脏前体细胞异质性的多个重要特征。然而，这些方法通常仅限于新鲜组织，这限制了在不同实验条件下的研究，因为新鲜组织必须在同一次实验中立即处理，以减少技术上的变异性。因此，该领域迫切需要简便且灵活的方法，以支持单核RNA测序（snRNA-seq）和基于高通量测序的单核转座酶可及染色质分析（snATAC-seq）等技术的数据生成。本文介绍了一种快速分离细胞核以进行后续单核双组学分析（联合snRNA-seq与snATAC-seq）的实验方案。该方法可从心脏前体细胞的冷冻样本中分离细胞核，并可与使用微流控腔室的平台相结合。

与用于单细胞技术的单细胞悬液制备相比，单核悬液的制备更具挑战性，需要更高的分辨率和更精细的处理。成功实现snRNA-seq与snATAC-seq联合分析的关键因素在于获得纯净且完整的细胞核悬液。高效的细胞核分离方案必须根据组织类型和样本状态（新鲜或冷冻）进行相应调整。本文介绍了一种优化后的从小鼠胚胎心脏冷冻组织中分离细胞核的方案。从胚胎心脏区域的解剖、心肌细胞的解离到细胞核的分离，所有步骤均在图1中进行了总结。在起始材料方面，建议用于高效细胞核分离的细胞数量为1×105–1×106个细胞，细胞活力应>70%。如图2所示，本方案中在解冻后额外增加了死细胞去除与分选步骤，从而获得了更纯净的细胞悬液，显著提高了细胞活力，并改善了起始样本的质量。除细胞核分离外，本方案还详细说明了如何评估所分离细胞核的质量与数量（图3）。所分离细胞核的质量会显著影响snRNA-seq与snATAC-seq联合数据的质量；在此，通过评估核膜形态...

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。

发育中的心脏是一种复杂的结构，包含受复杂调控机制控制的多种前体细胞。对基因的检测……

本方案的主要目标是研究遗传因素与环境因素在心脏发育过程中的相互作用，以及它们对先天性心脏病的贡献。单细胞核分析方法，例如单细胞核RNA测序（single nuclei RNA-Seq）和单细胞核染色质可及性分析（single nuclei ataxic），正逐渐成为研究心脏发育过程中健康与疾病状态下细胞异质性的关键技术。这些实验的一个限制步骤在于，所有样本必须同时进行检测。在进行所有实验条件操作时，同时为各个条件收集足够新鲜的材料可能具有挑战性。尽管近年来单细胞研究领域已取得显著进展，但主要困难仍在于新鲜样本的处理。克服这一困难对于揭示先天性心脏病缺陷的分子机制具有重要意义。本方案描述了从经安乐死处理的2至6个月龄怀孕雌性小鼠胚胎中获取的冷冻心肌细胞悬液中成功分离高质量细胞核的步骤，我们的方案适用于后续的单细胞核RNA测序（single nuclei RNA-Seq）和单细胞核染色质可及性分析（single nuclei ataxic）。我们希望该实验流程能够帮助感兴趣的科研人员，并鼓励他们将这一强大技术应用于自身研究中。首先，将从小鼠胚胎中解剖得到的组织置于含1%胎牛血清的冷完全培养基中。在5倍放大镜下移除胚胎的子宫内膜组织、胎盘和卵黄囊后，使用镊子从胚胎心脏区域分离出心脏前体细胞。将从五只小鼠胚胎中分离出的所有心脏区域组织收集至1.5毫升微量离心管中，并在已预冷至4°C的摆桶式离心机中进行离心。吸除上清液，并用1毫升组织培养级PBS洗涤组织。在4°C条件下，以300G离心1分钟。然后弃去上清液，并用1毫升PBS重复洗涤两次。完成后，将PBS替换为0.05%胰蛋白酶EDTA。离心并用0.05%胰蛋白酶EDTA重复洗涤两次。为消化组织，加入50 µL 0.05%胰蛋白酶EDTA，在37°C下加热10分钟。随后，五分钟后通过使用宽孔滤芯吸头将悬液上下吹打，进行轻柔的机械解离。通过向解离的细胞中加入 350 微升完全培养基来灭活胰蛋白酶消化活性。将细胞悬液通过 40 微米细胞滤筛。通过离心新鲜解离的细胞悬液，制备用于冻存的细胞。 小心吸除上清液，并将沉淀重悬于1毫升预冷的冻存液中。将细胞悬液转移至预冷的冻存管中，再将冻存管放入预冷的冻存盒内。将冻存盒置于-80摄氏度环境中保存4至8小时，随后转移至液氮中，用于后续测序实验。首先将含有冻存管的冻存解离胚胎心肌细胞悬液置于37摄氏度水浴中1至2分钟。向解冻后的细胞悬液中加入1毫升预热至37摄氏度的完全培养基，用移液器吹打混匀3次。然后将细胞悬液转移至含有10毫升温热完全培养基的15毫升锥形离心管中。将整个细胞悬液通过30微米滤网，并用一到两毫升温热的完全培养基冲洗滤网。将滤过液收集到同一锥形管中。接着，以300×g离心5分钟。去除上清液后，用 PBS 洗涤沉淀，并将细胞悬液转移至 1.5 毫升微量离心管中。离心细胞悬液，向沉淀的细胞中加入 100 微升提供的磁性微珠。使用宽口移液器吸头将悬液吹打混匀 5 次，然后在室温下孵育 15 分钟。在此期间，用 500 微升结合缓冲液冲洗磁性分离柱。孵育完成后，用 500 微升结合缓冲液稀释磁珠细胞悬液混合物。接着，将 0.6 毫升细胞悬液加入磁性分离柱中。用一个15毫升离心管收集活细胞流出液。接着，用1毫升结合缓冲液冲洗盛有细胞悬液的1.5毫升微量离心管。冲洗后，将1.5毫升微量离心管中的结合缓冲液转移至层析柱中，并将流出液收集到同一个15毫升离心管中。使用1毫升结合缓冲液重复冲洗1.5毫升离心管。将流出液在300×g下离心5分钟，然后小心去除上清液，避免扰动细胞沉淀。加入1毫升PBS BSA溶液，使用宽口吸头通过移液操作轻轻混匀。然后，将细胞悬液转移至一个1.5毫升的微量离心管中。再次离心细胞悬液，并在不扰动细胞沉淀的前提下弃去上清液。重复用1毫升PBS BSA洗涤两次。去除1 mL PBS BSA后，将细胞重悬于100 µL PBS BSA溶液中。用移液器吹打10次混匀。通过台盼蓝染色法测定细胞浓度，确保细胞数量大于或等于100,000个，并进行基于荧光的细胞活力评估。解冻后增加的死细胞分选与去除步骤，使得获得的细胞悬液更为纯净，细胞活力显著提高，从而改善了起始样本的质量。为了提高准确性，采用了两种不同的计数方法对细胞和细胞核进行定量，包括台盼蓝染色法和基于荧光的活力评估法。在本方案中观察到，细胞活力在细胞核分离前为80%至90%，而在细胞核分离后则降至5%以下。首先，使用70%乙醇和RNase去除溶液清洁工作区域和材料。新鲜配制裂解缓冲液、裂解稀释缓冲液、0.1X裂解缓冲液和洗涤缓冲液，并将缓冲液置于冰上保存。预先将水平转子离心机冷却至4°C。将心脏前体细胞悬液在摆桶式离心机中离心。小心移除所有上清液，避免接触管底。向细胞悬液中加入100 µL预冷的0.1X裂解缓冲液，通过移液器吹打10次混匀。在冰上孵育5分钟后，加入1毫升预冷的洗涤缓冲液并混匀。离心悬浮液后，吸除上清液，并用预冷的洗涤缓冲液再重复洗涤两次。配制稀释的细胞核缓冲液。将细胞核重悬于细胞核缓冲液后，将细胞核储存液置于冰上。通过评估核膜形态来检测分离细胞核的质量时，在明场显微镜下观察，分离的细胞核表面光滑且呈均匀圆形，表明细胞核分离过程有效。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从小鼠心脏祖细胞中分离细胞核，用于单细胞分辨率的表观基因组和基因表达谱分析

单细胞表达谱分析可对单个细胞进行详细的基因表达分析。我们描述了心肌细胞的分离方法，以及对所得裂解液进行全转录组微阵列分析或特定靶标qPCR检测的制备步骤。...

成年小鼠心肌细胞的单细胞转录谱分析

通过密度沉降法分离心脏细胞核，并使用抗中心粒周围物质1（PCM-1）抗体对细胞核进行免疫标记，以通过流式细胞术识别和分选心肌细胞核。...

从死后组织中分离心肌细胞核

本文介绍一种从新鲜或冷冻组织中快速分离高质量细胞核的方案，适用于后续的大规模平行RNA测序。方案中包括去污剂-机械法和低渗-机械法两种组织破碎与细胞裂解方法，均可用于细胞核的分离。...

用于大规模并行单核RNA测序的成年脊髓核的分离

单个细胞核的分离依赖于细胞膜的解离和基于去垢剂的透化处理，这些步骤需要优化，且容易引入技术性假象。我们展示了一种无需去垢剂和酶的快速分离完整细胞核的方案，可直接从完整组织中获取适用于单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）或ATAC-seq的细胞核。...

使用去污剂和酶解-free方法从完整组织中分离细胞核

本文介绍一种从冻存小鼠肾脏中分离高质量细胞核的实验方案，该方法可提高肾髓质细胞类型的代表性，并避免酶解组织解离导致的基因表达异常。...

从成年小鼠肾脏中分离细胞核用于单细胞核RNA测序

我们介绍一种方法，用于从暴露于稳定或扰动血流条件的小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞和细胞核，以进行单细胞组学实验。...

从小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞用于单细胞多组学实验

本方案详细描述了单细胞核测序的低起始量样本制备流程，包括小鼠颈上神经节和星状神经节的解剖、细胞解离、冷冻保存、细胞核分离以及标签条形码标记。...

低输入量细胞核分离及条形码抗体多重检测小鼠交感神经节用于单细胞核RNA测序

本文介绍一种从速冻保存的存档肝组织中分离细胞核的方案，用于单细胞核RNA测序（RNA-seq）、ATAC-seq以及联合多组学分析（RNA-seq和ATAC-seq）。...

从速冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学分析

单细胞/单细胞核转录组学和多组学研究的成功在很大程度上取决于细胞/细胞核的质量。因此，从组织中分离细胞/细胞核并进行纯化的步骤必须高度标准化。本方案描述了为后续单细胞核多组学检测制备脑组织和骨髓细胞核的方法。...

高质量脑组织与骨髓细胞核制备用于单细胞核多组学分析

我们描述了一种从冻存的诱导多能干细胞来源的基质/内皮细胞和血细胞类型中提取高质量细胞核的方案，以支持单细胞核下一代测序分析。获得高质量且完整的细胞核对于多组学实验至关重要，但对部分实验室而言，这可能构成进入该领域的技术障碍。...

从冷冻保存的体外衍生血细胞中分离细胞核

本研究提出了一种空间Trekker–CUT&amp;#38;Tag多组学方案，将组织切片的直接空间条形码技术与单细胞多组学分析相结合。该方法能够同时实现基因表达和组蛋白H3K27ac修饰的空间解析单细胞谱型分析，为在组织微解剖背景下理解基因调控机制提供了深入见解。...

空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

学习从小鼠心脏祖细胞中分离细胞核的方法，用于单细胞分辨率的表观基因组和基因表达谱分析。该技术有助于研究心脏发育中的细胞异质性及先天性心脏缺陷的分子机制。

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