一套用于快速评估中性粒细胞功能的筛选技术

中性粒细胞功能筛选（NeutroFun screen）方案提供了一组功能检测方法，该方法使用低成本化学试剂，可从新鲜中性粒细胞中在单次实验中完成。这使得能够对中性粒细胞的一些主要功能进行初步评估，从而为后续更复杂且昂贵的研究提供指导。中性粒细胞研究中采用多种调节条件，如细胞因子、肽类、微生物组产物以及物理刺激。

此外，分析方法还包括流式细胞术、蛋白质组学、显微操作装置以及免疫细胞化学。由于涉及大量品牌设备和联合使用的检测方法，中性粒细胞研究工作通常耗时较长、劳动强度大且成本高昂。这通常会减少所测试的条件数量或实验重复次数。

目前最先进的方法需要昂贵的耗材、大量细胞以及耗时的制备流程。我们的方案——NeutroFun 筛选法，相较于其他方法，能够更快速且更经济地评估细胞功能。该方法通过在方案中整合多种分析手段，同时保持结果的准确性与全面性，从而实现这一优势。

两名研究人员同时进行此工作流程，以快速评估中性粒细胞功能。研究人员一负责分离PNNs，调整浓度并孵育激活系统，而研究人员二则准备后续实验所需的材料；随后，研究人员一进行吞噬作用、NET诱导以及比色NBT检测，同时研究人员二开展实时迁移实验和NBT载片检测。在50 mL锥形管中配制12 mL的60%和70%分离介质稀释液。

接下来，使用5毫升移液管，每次加入4毫升60%稀释液，逐层叠加在70%稀释液上方，自下而上制备梯度。然后，小心地将12毫升肝素抗凝血叠加在密度梯度液顶部，在室温下以200 ×g离心15分钟。弃去血浆层和单个核细胞层，随后小心地将红细胞沉淀层上方约7.5毫升的液体转移至两个15毫升锥形管中。

在19摄氏度下，以300 ×g离心5分钟。随后用Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞沉淀。然后进行低渗裂解，去除残留的红细胞。

弃去上清液后，将剩余缓冲液中的多形核中性粒细胞轻轻重悬，并转移至预冷的微量离心管中。随后，取三份每份一微升（1 µL）的细胞悬液转移至洁净的玻璃载片上。使用快速全染法染色，以评估细胞形态及纯度。

在显微镜下观察细胞，并对每个孔中随机选取的300个细胞进行计数。标记中性粒细胞和其他细胞类型，以评估分离的纯度。接着，将1微升细胞悬液加入49微升0.2%台盼蓝染料中，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）对死细胞和活细胞进行计数。

用50%自体血浆和50%HBSS（含钙和镁）将细胞浓度调整至每微升6,667个细胞。然后，将细胞悬液等分至1.5毫升微量离心管中，每管对应不同的检测条件，包括阴性对照。为每种条件配制激活体系，确保最终细胞浓度保持在每微升6,600个多形核中性粒细胞。

在37摄氏度下静置孵育，不进行旋转。首先将0.0005克NBT溶解于10微升DMSO中。涡旋振荡15分钟后，加入90微升含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）以及1微升待测物质。

再次涡旋振荡试管，时间不超过两分钟。进行NBT玻片试验时，轻轻混匀，并将2 µL先前制备的活化多形核中性粒细胞转移至洁净的玻璃玻片上。将玻片置于湿润容器中，在37 °C条件下孵育20分钟。

接下来，在细胞上加入一微升 NBT 工作液。再次避光孵育 20 分钟。将玻片干燥后，通过在每个孔中加入一滴甲醇固定一分钟。

用0.03的沙黄染液对玻片进行复染，时间一分钟。在每个孔中计数100个随机细胞，区分有无甲臜沉积物的中性粒细胞。进行NBT比色测定实验时，轻轻混匀并转移90微升先前制备的活化多形核中性粒细胞至洁净的微量离心管中，然后小心加入20微升6毫摩尔的NBT溶液，在37°C避光孵育20分钟。

孵育后，加入100 µL的10% SDS，涡旋混匀。使用探头式超声仪在60%的振幅下进行超声处理，每次15秒，共5个循环，每个循环间隔15秒。在12,000 ×g下离心5分钟。

取60微升上清液转移至透明底96孔板中，于570纳米处测定甲臜产物的吸光度。分光光度法检测结果显示，与fMLP组和对照组相比，100纳摩尔PMA可诱导活性氧（ROS）生成显著升高。NBT载片试验结果与分光光度法结果一致，显示PMA相较于fMLP可诱导最强的ROS生成反应。

向含有钙离子和镁离子的 200 微升 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中加入约 0.75 毫克干酵母。接着，将混合物置于恒温混匀仪中，在 100 摄氏度、500 转/分钟的条件下孵育至少 15 分钟。孵育结束后，取 5 微升酵母悬液加入 45 微升 0.2% 台盼蓝染液中。

使用血细胞计数板对酵母细胞进行计数。用含钙和镁的HBSS将初始悬液的浓度调整至每微升33,000个酵母细胞。随后，轻轻混匀，并将先前制备的活化中性粒细胞5微升转移至另一无菌微量离心管中，与5微升酵母细胞悬液混合。

立即将六微升多形核中性粒细胞与酵母菌悬液转移至洁净玻片的三个孔中，每孔两微升，并将玻片置于湿化孵育盒中孵育40分钟。经快速全染法染色后，在显微镜下观察细胞。尽管100纳摩尔fMLP和16微摩尔抗菌肽均诱导酵母菌吞噬作用增加，但与对照组相比，差异仅在双重刺激条件下达到统计学显著性，该条件显著增强了吞噬作用。

通过向基于阻抗的实时细胞分析仪（RTCA板）的下室中加入160微升趋化因子来建立趋化梯度。对于阴性对照和空白对照，向下室中加入含钙和镁的160微升Hank's平衡盐溶液（HBSS）。安装上室，并加入25微升含钙和镁的HBSS。

在室温下孵育至少一小时，以形成趋化梯度。接着，轻轻混匀，并将60 µL先前制备的活化多形核中性粒细胞转移至上室。然后，向空白孔中加入60 µL含钙和镁的HBSS。

将 RTCA 板放入分析仪中，并设置其软件每 60 秒测量一次细胞指数，持续两小时。利用获得的数据拟合曲线。实时细胞迁移结果显示 100 纳摩尔 fMLP 对中性粒细胞具有趋化作用。

轻轻混匀后，取4 µL先前制备的待评估活化中性粒细胞体系，加入洁净玻片的两个孔中。将玻片置于37 °C恒温湿化孵育箱中孵育30分钟。向其中一个孔加入1 µL DNase I，在37 °C下继续孵育20分钟。

使用快速全染法染色后，在显微镜下进行观察。对全染法染色的中性粒细胞进行定性分析显示，对照组和fMLP组未见任何NET释放的迹象，而PMA激活则诱导了网状结构的形成，且该结构可被DNase I处理降解。抗菌肽对中性粒细胞的作用结果显示，此类刺激可能能够诱导NET释放，因为载玻片上呈现的网状结构可被DNAse I降解。