Name: 从胚胎小鼠大脑中建立混合神经元和神经胶质细胞培养物以研究感染和先天免疫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 了解如何从胚胎小鼠大脑建立混合神经元和神经胶质细胞培养物，用于研究中枢神经系统病毒感染和先天免疫反应。该方法结合RT-qPCR、显微镜和流式细胞术，可减少动物使用并提高实验效率。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们谨向Edgar实验室和Linington实验室的成员表示感谢，特别是Chris Linington教授、博士&#160;戴安娜·阿尔塞尼，博士&#160;感谢Katja Muecklisch在建立细胞培养过程中提供的建议、有益的评论以及协助培养细胞。特别感谢Muecklisch博士为Cell Profiler分析流程提供了初始方案。本研究由多发性硬化症协会（资助号122）和Yuri与Lorna Chernajovsky基金会资助MP；格拉斯哥大学资助JC和MP；Wellcome Trust（217093/Z/19/Z）和医学研究理事会（MRV0109721）资助GJG。

所有动物实验均符合当地关于动物使用的法律法规，并经格拉斯哥大学本地伦理审查委员会批准。动物饲养于特定病原体阴性环境中，符合英国《1986年动物科学程序法》的要求，并在英国内政部项目许可证的授权下进行。本研究使用实验室自繁的成年C57BL/6J小鼠。建议使用年轻雌性小鼠（8–12周龄），因其妊娠成功率较高；雄性小鼠可多次用于繁殖。图1展示了用于制备混合神经元和胶质细胞培养物的方法示意图。
1. 组织培养耗材的准备
<ol>
	<li>在 II 级生物安全柜内准备含有显微镜盖玻片的培养板和/或培养皿。对所有试剂进行灭菌或高压灭菌，以确保培养期间的无菌状态。</li>
	<li>向每个孔中加入适量体积的 BA-PLL（13.2 µg/mL 聚-L-赖氨酸氢溴化物 [PLL] 溶于硼酸缓冲液 [BA] [50 mM 硼酸，12.5 mM 四硼酸钠，pH 8.5]；参见材料表）（6 孔板每孔 1,000 µL，96 孔板每孔 100 µL；体积详见表 1）。对于含有显微镜盖玻片的 9 cm 直径组织培养皿，加入 20 mL BA-PLL，并轻轻旋转使溶液均匀分布。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 1–2 小时。</li>
	<li>从每个孔或含有显微镜盖玻片的培养皿中移除 BA-PLL 溶液，加入 20 mL 无菌水进行洗涤，轻轻旋转盖玻片后吸去水分。重复此洗涤步骤三次。对于含有盖玻片的培养皿，在最后一次洗涤时保留无菌水，以便于后续取出盖玻片。</li>
	<li>用无菌移液器尽可能吸尽液体，并干燥至少 2 小时至&#160;过夜。</li>
	<li>将包被好的培养板在 4 °C 下保存，最长可保存 2 个月。 
	注意：制备好的含聚-L-赖氨酸的硼酸溶液（BA-PLL）最多可重复使用三次，每次需补充新的 PLL。将 BA-PLL 储存于 4 °C。培养皿需用 BA-PLL 处理，因为 PLL 可使细胞贴附并生长。若不进行此处理，细胞在培养约 1 周后会脱落，无法继续分化。</li>
</ol>
2. E17 胚胎脑的解剖
<ol>
	<li>将一只或多只雌鼠与一只雄鼠共同饲养。每天检查雌鼠是否有黏液栓，以确认是否已交配。 
	注意：任何 &#34;堵塞的&#34; 雌性小鼠需要与雄性小鼠分离，以确保妊娠起始日期准确。可通过称重或肉眼观察来确认是否怀孕。</li>
	<li>在符合当地动物福利指导原则和法律的前提下，使用适当方法于E17阶段处死怀孕小鼠，例如通过升高二氧化碳（CO₂）浓度2浓度、致死性麻醉过量或颈部脱臼。 
	注意：所选方法不得对胚胎造成干扰。本研究中，通过逐渐增加二氧化碳气体浓度对怀孕母体实施安乐死，并通过切断股动脉确认死亡。</li>
	<li>将处死后的怀孕小鼠仰卧置于解剖板上；虽然无需固定，但对于经验不足的研究人员而言，固定可能更便于操作。用镊子夹住腹部中线处皮肤，使用尖头剪刀沿中线从外生殖器向肋骨处剪开皮肤和腹膜，注意避免刺破子宫。
	<ol>
		<li>小鼠子宫具有两个角，每个角通常含有1至5个胚胎。将带有胚胎的子宫从母鼠体内取出，并立即置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从胎盘一侧切开卵黄囊，注意不要损伤胚胎，然后将胚胎从卵黄囊中取出。</li>
	<li>立即处死胚胎并断头，将断头后的头部放入含有不含钙（Ca）的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的培养皿中。2+）和镁（Mg2+)（HBSS-/-）置于冰上。 
	注意：如果需要进行基因分型，可在此阶段切取尾部用于遗传学分析。当预期存在多种基因型时，应将各个胚胎的头部单独保留用于培养。</li>
	<li>使用斜角镊子，将头部侧向放置，朝向左侧。</li>
	<li>用镊子的一端刺穿眼球，同时用另一端牢固地夹住下巴。</li>
	<li>从颈背开始，沿中线轻轻撕开头皮皮肤至吻部前端。</li>
	<li>通过呈白色椭圆形的脊髓进入，使用斜角镊沿中线撬开颅骨，暴露脑组织。</li>
	<li>轻轻剥离朝上一侧的颅骨，暴露脑组织。</li>
	<li>将脑组织从颅骨中取出，待脑完全移出后，处理掉颅骨。</li>
	<li>用镊子去除脑膜，脑膜表现为一层带有密集血管的薄膜。</li>
	<li>将脑组织放入 Bijou 瓶中（参见 材料表) 冰上放置，内含 2 mL HBSS-/-。</li>
	<li>用剩余的脑组织重复步骤 2.6 至 2.13，每个比约瓶最多加入四个脑组织。</li>
	<li>向离心管中加入 250 µL 10x 胰蛋白酶，通过振荡离心管吹打破碎脑组织。在 37 °C 下孵育 15 分钟。 
	注意：从此时起的所有步骤均应在无菌细胞培养罩内进行。</li>
	<li>解冻2 mL大豆胰蛋白酶（SD）抑制剂（Leibovitz L-15，含0.52 mg/mL大豆来源的胰蛋白酶抑制剂，40 µg/mL DNase I，3 mg/mL牛血清白蛋白[BSA] 5号组分；参见 材料表从 -20 °C 取出后置于 37 °C 解冻。</li>
	<li>向每个含有脑组织的离心管中加入 2 mL SD 抑制剂（每管最多含四个脑组织），再次振荡离心管以使其均匀分散。 
	注意：SD抑制剂可降低胰蛋白酶活性，防止样品发生不必要的消化，从而维持细胞活力。</li>
	<li>不进行离心，从每个bijou管中移除2 mL上清液，并小心避免转移细胞团块，将上清液转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>用连接5 mL注射器的19号针头在离心管中将剩余细胞反复吹打两次，以重悬细胞。这将形成一种浓稠的、类似黏液的混合物。
	<ol>
		<li>用21 G针头再重复两次。如果仍有团块残留，用21 G针头再吹打一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用23 G针头将细胞从离心管转移至同一个15 mL离心管（来自步骤2.18）。</li>
	<li>以 200 x 离心 g 室温（RT）孵育 5 分钟。</li>
	<li>使用5 mL血清移液管移除所有上清液，并将其转移至另一支15 mL离心管中，注意不要扰动底部含有目标细胞的松散沉淀。</li>
	<li>再次以 200 x 离心上清液 g 室温下孵育5分钟。 
	注意：此步骤并非必需，但如果需要获得大量细胞或胚胎数量较少时，可执行此步骤以从上清液中尽可能回收更多细胞。</li>
	<li>使用10 mL铺板培养基（PM）（49%达尔伯克改良伊格尔培养基[DMEM]，1%青霉素/链霉素[Pen/Strep]，25%马血清，25%含Ca²⁺的Hank's平衡盐溶液[HBSS]）2+ 和 Mg2+ [HBSS+/+]；参见 材料表），合并并共同重悬两个沉淀，以制备全细胞悬液。</li>
	<li>使用台盼蓝和血细胞计数板或数字细胞计数器对细胞进行计数，并用PM将细胞悬液稀释至浓度为1.8 × 10⁶细胞/mL。6 cells/mL</li>
</ol>
3. 细胞接种
<ol>
	<li>按照 表1 中所述，将所需体积的细胞悬液加入相应的培养容器中：6 孔板每孔 1,000 µL，96 孔板每孔 50 µL，或每张盖玻片 100 µL。</li>
	<li>在 37 °C、5%-7% CO2 条件下孵育 2-4 小时，使用倒置显微镜检查细胞是否已贴壁。</li>
	<li>移除培养基，并补充新鲜的分化培养基（DM+：含 10 µg/mL 胰岛素的 DM-；DM-：DMEM，1% 青霉素/链霉素，50 nM 氢化可的松，10 ng/mL 生物素，2.5 mL 100x N1 培养基添加剂；参见 材料表）。培养基体积详见 表1。使用无菌移液器吸头将漂浮的盖玻片轻轻压下使其贴壁。</li>
</ol>
4. 培养物的维持
注意：这些培养物需每周喂养三次，以支持最佳生长和分化。培养物将在体外培养天数（DIV）达到适宜天数时，处于最适合实验的健康和成熟状态。 体外细胞可在培养条件下维持长达28天，此后培养物会迅速退化。
<ol>
	<li>在DIV12之前，每周三次，通过以下方式更换部分上清液：在6孔板中每孔移除500 µL，在96孔板中每孔移除50 µL，或在含三张盖玻片的培养皿中移除500 µL，然后分别向6孔板每孔加入600 µL、96孔板每孔加入60 µL，或向含盖玻片的培养皿中加入600 µL新鲜DM+培养基（表1）。</li>
	<li>从DIV13开始，每周三次，通过以下方式更换部分上清液：在6孔板中每孔移除500 µL，在96孔板中每孔移除50 µL，或在含三张盖玻片的培养皿中移除500 µL，然后分别向6孔板每孔加入600 µL、96孔板每孔加入60 µL，或向含盖玻片的培养皿中加入600 µL新鲜DM-培养基（表1）。</li>
</ol>

Embryonic Mouse Brain Mixed Cell Cultures to Study Infection and Innate Immunity

<ol><li>Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKovacs%2C+GG+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22">Handbook of Clinical Neurology</a>. 145, Elsevier. 13-23 (2018).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Techniques%22">The Principles of Humane Experimental Techniques</a>. 1, Methuen. (1959).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Thomson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((synapsing+cultures+of+murine+spinal+cord-validation+as+an+in+vitro+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system.</a> The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).</li>
<li>Bijland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+studying+CNS+white+matter%3A+Functional+properties+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches.</a> F1000Research. 8, 117(2019).</li>
<li>Fragkoudis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+and+oligodendrocytes+in+the+mouse+brain+differ+in+their+ability+to+replicate+Semliki+Forest+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurovirology%22%5BJournal%5D)">Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus.</a> Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).</li>
<li>Hayden, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-specific+IgMs+induce+antiviral+responses+in+the+CNS%3A+Implications+for+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135(2020).</li>
<li>Kantzer, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-ACSA-2+defines+a+novel+monoclonal+antibody+for+prospective+isolation+of+living+neonatal+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes.</a> Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).</li>
<li>Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+and+macrophages+in+CNS+homeostasis%2C+autoimmunity%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer.</a> Journal of Immunology Research. 2017, (2017).</li>
<li>Gee, J. R., Keller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+Regulation+of+brain+homeostasis+via+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).</li>
<li>Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+myelination%3A+possible+roles+of+the+immune+proteasome+in+oligodendroglial+homeostasis+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction.</a> Frontiers in Neuroscience. 16, 867357(2022).</li>
<li>Keller, D., Erö, C., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+densities+in+the+mouse+brain%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cell densities in the mouse brain: A systematic review.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83(2018).</li>
<li>Wang, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygenglucose+deprivation+enhancement+of+cell+death%2Fapoptosis+in+PC12+cells+and+hippocampal+neurons+correlates+with+changes+in+neuronal+excitatory+amino+acid+neurotransmitter+signaling+and+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents.</a> Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Chen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+atlas+of+the+developing+prenatal+and+postnatal+mouse+central+nervous+system%2C+with+emphasis+on+prenatal+days+E7.5+to+E18.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5.</a> Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).</li>
<li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+overview+of+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li>
<li>Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+decades+of+new+drug+development+for+central+nervous+system+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Two decades of new drug development for central nervous system disorders.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).</li>
<li>Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+new+approaches+in+CNS+drug+discovery%3A+Why+drugs+have+failed%2C+and+what+can+be+done+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes.</a> Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+%28polydendrocytes%29+in+brain+physiology+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 133(2014).</li>
<li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+brain+organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells%3A+Promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59(2017).</li>
<li>Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+and+actin-containing+filaments+of+normal%2C+preneoplastic%2C+and+neoplastic+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells.</a> Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).</li>
<li>Koch, K. S., Leffertt, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+of+differentiated+adult+rat+hepatocytes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).</li>
<li>Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+the+infiltrating+immune+cells+in+the+brain+of+healthy+individuals%3A+effect+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity+and+Ageing%22%5BJournal%5D)">Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging.</a> Immunity and Ageing. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

中枢神经系统（CNS）是一个复杂的网络，从大脑延伸至脊髓，包含多种细胞类型，主要是神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞1。由于每种细胞在维持中枢神经系统稳态以及对各种刺激产生适当反应中均发挥重要作用9,10,11，因此包含所有这些细胞类型的培养系统是研究大脑如何应对刺激的一种有用且多功能的工具。在体外（in vitro）环境中研究这些细胞及其相互作用的能力，使得大量技术可被灵活应用于解决多种实验问题。我们概述了一种快速高效的方法，用于从小鼠产前脑组织中分离并培养主要的中枢神经系统细胞类型，该方法可模拟成年小鼠脑中的各个细胞群体12。
既往建立的中枢神经系统（CNS）培养方案使用E13.5时期的脊髓组织4,<...

加深对中枢神经系统（CNS）的理解，对于改善多种神经炎症性和神经退行性疾病治疗方案至关重要。中枢神经系统由大脑、脊髓和视神经中相互连接的复杂细胞网络构成，主要包括神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞以及其固有免疫细胞——小胶质细胞1。体外（in vitro）研究方法通常可显著减少开展有意义研究所需使用的小鼠数量；然而，由于中枢神经系统的复杂性，仅依靠细胞系无法重现体内（in vivo）的真实情况。混合神经细胞培养体系为研究神经（免疫）学问题提供了一个高度有价值的实验模型，符合“替代、减少、优化”（3Rs）原则2,3。
Thomson 等人描述了一种使用产前脊髓细胞的细胞培养方法，这些细胞可分化为上述所有主要的中枢神经系统细胞类型4。该体系还具有突触形成、有髓鞘的轴突以及郎飞结。这种培养方法的主要局限性在于，由于来源于脊髓，无法有效模拟大脑，且从胚胎第13天（E13）脊髓中获得的细胞数量有限。因此，这限制了可研究的实验条件数量。本研究旨在开发一种新的细胞培养体系，以重现大脑的特征，并提高细胞产量，从而减少对实验动物的需求。
以Thomson等人的研究为基础，我们开发了一种完全来源于孕鼠脑组织的细胞培养模型。这些培养物具有与脊髓培养物相同的细胞群体、相互连接性及处理方式，但相比之下髓鞘化程度较低。然而，拥有一个中枢神经系统（CNS） 体外 细胞产量约为三倍的模型效率更高，所需小鼠数量更少，胚胎处理时间也更短。我们针对多种下游应用和不同规模优化了这一独特的培养体系，包括使用玻璃盖玻片进行显微镜分析，以及各种规格的塑料孔板，如适用于高通量研究的96孔板。

<table><tbody><tr><td>10x 胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T4549-100ML</td><td>用于组织消化</td></tr><tr><td>140 mm 组织培养皿</td><td>Fisher</td><td>11339283</td><td>每1个140 mm培养皿中放置8个35 mm培养皿</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td>用于收集细胞形成沉淀，以便重悬于铺板培养基中</td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710012040</td><td>用于样品吹打</td></tr><tr><td>21 G 针头</td><td>BD</td><td>304432</td><td>用于样品吹打</td></tr><tr><td>23 G 针头</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>用于样品吹打</td></tr><tr><td>35 mm 组织培养皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>每1个35 mm培养皿中铺3个PLL包被的盖玻片</td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Fisher</td><td>15869152</td><td>用于样品吹打</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>用于细胞铺板，进行RT-qPCR和流式细胞术</td></tr><tr><td>7 mL Bijoux 管</td><td>Fisher</td><td>DIS080010R</td><td>用于放置脑组织</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>用于高通量检测的细胞铺板</td></tr><tr><td>ACSA-2 抗体，抗小鼠，PE标记</td><td>Miltenyi</td><td>130-123-284</td><td>用于星形胶质细胞的流式细胞术染色</td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Dumont</td><td>0108-5/45-PO</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td>用于DM+/-培养基</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>用于配制硼酸缓冲液</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 标记抗小鼠CD24抗体，克隆M1-69</td><td>Biolegend</td><td>101825</td><td>用于神经元和星形胶质细胞的流式细胞术染色</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 标记抗小鼠CD45抗体，克隆30-F11</td><td>Biolegend</td><td>103139</td><td>用于小胶质细胞的流式细胞术染色</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 标记抗小鼠/人CD11b抗体，克隆M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101243</td><td>用于小胶质细胞的流式细胞术染色</td></tr><tr><td>BSA 第V组分</td><td>Sigma</td><td>A3059-10G</td><td>用于SD抑制剂</td></tr><tr><td>CNP</td><td>Abcam</td><td>AB6319</td><td>成熟少突胶质细胞标记物</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0149</td><td>用于显微镜观察的细胞铺板</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Sigma</td><td>S3146-1EA</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>DMEM 高糖，含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td>用于DM+/-培养基及铺板培养基</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermofisher</td><td>18047019</td><td>用于SD抑制剂，可使用此产品或Sigma的另一种DNase</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td>用于SD抑制剂，可使用此产品或Thermofisher的另一种DNase</td></tr><tr><td>eBioscience 可固定活力染料 eFluor 780</td><td>Thermofisher</td><td>65-0865-14</td><td>活/死细胞染色</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Dumont</td><td>0102-SS135-PO</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>星形胶质细胞标记物</td></tr><tr><td>含钙镁的HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269-500ML</td><td>用于铺板培养基</td></tr><tr><td>不含钙镁的HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9394-500ML</td><td>用于盛放脑组织</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco</td><td>26050-070</td><td>用于铺板培养基</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>用于DM+/-培养基</td></tr><tr><td>Iba1</td><td>Alpha-Laboratories</td><td>019-1971</td><td>小胶质细胞标记物</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td>用于DM+培养基</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 培养基</td><td>Gibco</td><td>11415-049</td><td>用于SD抑制剂</td></tr><tr><td>MBP</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA409S</td><td>髓鞘标记物</td></tr><tr><td>小鼠CCL5/RANTES DuoSet ELISA试剂盒</td><td>BioTechne</td><td>DY478-05</td><td>用于定量96孔板上清液中CCL5浓度的ELISA试剂盒</td></tr><tr><td>N1 培养基添加剂</td><td>Sigma</td><td>N6530-5ML</td><td>用于DM+/-培养基</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Merck</td><td>MAB353</td><td>神经干细胞/前体细胞标记物</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Thermofisher</td><td>PA578499</td><td>神经元胞体标记物</td></tr><tr><td>NG2</td><td>Sigma</td><td>AB5320</td><td>未成熟少突胶质细胞标记物</td></tr><tr><td>O4 抗体，抗人/小鼠/大鼠，APC标记</td><td>Miltenyi</td><td>130-119-155</td><td>用于少突胶质细胞的流式细胞术染色</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>用于DM+/-培养基及铺板培养基</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>用于配制硼酸/聚-L-赖氨酸溶液以包被盖玻片</td></tr><tr><td>SMI31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>轴突标记物</td></tr><tr><td>四硼酸钠</td><td>Sigma</td><td>221732-100G</td><td>用于配制硼酸缓冲液</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermofisher</td><td>15596026</td><td>用于细胞裂解以进行RT-qPCR</td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T9003-100MG</td><td>用于SD抑制剂</td></tr></tbody></table>

建立来自小鼠胚胎脑组织的神经元与胶质细胞混合培养体系以研究感染与先天免疫

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

中枢神经系统（CNS）模型必须重现所存在的复杂互联细胞网络 体内 中枢神经系统主要由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞组成。随着减少和替代动物使用的努力不断加强，已开发出多种 体外 已开发出细胞培养系统以研究细胞的固有特性，从而推动针对中枢神经系统（CNS）感染和疾病治疗策略的发展。尽管某些研究问题可通过基于人类细胞的培养系统（如诱导性多能干细胞）来解决，但人源细胞在可获得性、成本和伦理方面仍存在局限性。本文介绍一种从胚胎小鼠脑组织中分离和培养细胞的独特方案。所获得的混合神经细胞培养物可模拟大脑中存在的多种细胞群体及其相互作用。 体内与现有的类似方法相比，该方案更能模拟大脑的特性，且可获得更多的细胞，从而能够从一只怀孕小鼠中开展更多实验条件的探究。此外，该方案操作相对简便，且具有高度可重复性。这些培养体系已针对多种实验规模进行了优化，可用于基于96孔板的高通量筛选、24孔板的显微镜分析，以及用于流式细胞术和逆转录-定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析的6孔板培养。该培养方法是一种强有力的工具，可在兼具中枢神经系统（CNS）部分复杂性的同时，以其操作便利性来研究感染与免疫过程 体外 方法

显微镜检查 
在玻璃盖玻片上培养的细胞适用于显微镜分析。为了观察细胞培养物的发育过程，从DIV0（细胞贴壁后）至DIV28的多个时间点，用4%多聚甲醛（PFA）固定盖玻片上的细胞。细胞染色用于免疫荧光成像，方法如前所述5，采用三种不同的染色组合：NG2（未成熟少突胶质细胞）和nestin（神经干细胞/前体细胞）作为发育标志物，SMI31（轴突）、MBP（髓鞘）和NeuN（神经元胞体）作为神经元标志物，或CNP（少突胶质细胞）、GFAP（星形胶质细胞）和Iba1（小胶质细胞）作为胶质细胞标志物（图2）。
使用 CellProfiler 流程（基于 ′,6-二脒基-2-苯基吲哚阳性（https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1））对各类细胞进行定量。每个独立数据点均来自每个时间点三个盖玻片上平均10张图像的统计结果。对于小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，计算其占4′,6-二脒基-2-苯基吲哚阳性（DAPI+）细...

本方案介绍了一种从胚胎第17天小鼠脑组织中制备中枢神经系统细胞培养物的独特方法，适用于神经（免疫）学研究。该模型可通过多种实验技术进行分析，包括实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、显微镜检查、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术。

中枢神经系统（CNS）模型必须重现体内存在的由相互连接的细胞构成的复杂网络。中枢神经系统主要由……

我项目最终的研究问题是，探索如何调控中枢神经系统先天免疫反应以抵御病毒感染。目前，我们正在研究其对强效抗病毒蛋白——干扰素β的反应。一个实验难点是需要获得足够数量的细胞，以进行深入细致的研究。每个结果都需要使用多种技术进行验证，而这不幸会导致大量动物被处死。由于这种新型培养技术能够产生大量细胞，因此仅从一只怀孕小鼠即可研究多种不同的实验条件。此外，在可能的情况下使用体外替代方法也能显著减少动物所遭受的痛苦。该方法严格遵循“3R原则”，减少了实验动物的使用并优化了其实验方案。这种培养方法可结合多种检测手段，如ELISA、定量PCR、显微镜观察和流式细胞术，用于回答多种不同的科研问题。本技术可帮助其他研究人员进一步减少并优化动物实验的使用。我们希望借此增进对天然抗病毒反应的理解，并通过调控该反应来防御机会性病毒的感染，例如人多瘤病毒2型（常称为JC病毒）——进行性多灶性白质脑病（PML）的主要致病因子，而PML可能是用于治疗多发性硬化症（MS）及其他疾病时所使用的免疫抑制药物引发的严重副作用。首先将一只处死的怀孕小鼠仰卧置于解剖板上。用镊子夹住腹部中线，再用一把锋利的剪刀沿中线从外生殖器向上经皮肤和腹膜剪至肋骨区域。取出含有胚胎的子宫并立即置于冰上。小心切开胎盘侧的卵黄囊，取出胚胎。然后将去头的胚胎头部放入含有无钙、无镁 HBSS 的冰盘中。将头部放入直径35毫米的培养皿中，朝向左侧。用镊子边缘刺穿一只眼睛，另一侧牢固夹住下巴。沿中线从颈背部轻轻撕开头皮至吻部。使用斜角镊子从白色椭圆形脊髓处插入，沿中线撬开颅骨以暴露脑组织。轻轻将颅骨从两侧剥离。然后将脑组织从颅骨中取出，并丢弃颅骨。使用镊子去除脑膜。将脑组织放入含有两毫升无钙无镁 HBSS 的小离心管中。向小离心管中加入 250 微升 10 倍浓度的胰蛋白酶。通过振荡离心管使脑组织充分混匀，随后在37摄氏度下孵育15分钟。接着，向每个离心管中加入2毫升大豆胰蛋白酶抑制剂。振荡以使抑制剂均匀分散。不进行离心，将每个 Bijou 瓶中的上清液各取两毫升转移至 15 毫升离心管中。使用连接在 5 毫升注射器上的 19 号针头，将悬液吸取两次，以吹打 Bijou 瓶中残留的细胞。再用 21 号针头重复吸取两次。使用23G针头将细胞从离心管转移至含有细胞上清液的15毫升离心管中。在室温下以200×g离心5分钟。使用5毫升移液管将所有上清液转移至新的15毫升离心管中，注意不要扰动沉淀。重复离心操作。向含有两次离心步骤所得沉淀物的离心管中加入 10 毫升涂布培养基，并充分混匀，制成完整的悬浮液。用台盼蓝对细胞进行染色，并使用血细胞计数板或细胞计数仪进行计数。将所需体积的小鼠E17胚胎脑细胞悬液加入培养板孔中以完成铺板。在37摄氏度、5%至7%二氧化碳条件下孵育细胞2至4小时。吸去培养基后，向每个孔中加入新的分化培养基。使用无菌移液器吸头压下任何漂浮的盖玻片。每周三次吸去部分上清液，并补充新鲜的分化培养基以维持培养。通过NG2和巢蛋白（nestin）的免疫荧光染色作为发育标志物，SMI31、MBP和NeuN作为神经元标志物，以及CNP、GFAP和Iba1作为胶质细胞标志物，对培养物进行观察。神经嗜性塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus）感染培养物后影响了少突胶质细胞和神经元。对感染细胞进行qRT-PCR分析显示，在经干扰素β处理的培养物中，趋化性细胞因子Ccl5的mRNA表达上调。ELISA 研究显示上清液中 Ccl5 增加，表明 mRNA 表达与蛋白质表达之间存在相关性。单细胞悬液的流式细胞术分析显示，70% 的细胞保持存活。细胞中存在大量小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞，而少突胶质细胞数量最少。

establishing-mixed-neuronal-glial-cell-cultures-from-embryonic-mouse

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

从胚胎小鼠大脑中建立混合神经元和神经胶质细胞培养物以研究感染和先天免疫

本文介绍了在原代培养中获得富集的小鼠少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的方法，这些细胞可分化为成熟的少突胶质细胞（OLs）。此外，本文还描述了一种通过将小鼠OPCs接种于小鼠背根神经节神经元（DRGNs）的神经突网络上，以建立小鼠髓鞘形成共培养体系的技术。...

从出生后小鼠组织中分离富集的少突胶质细胞培养物及少突胶质细胞/神经元髓鞘形成共培养物

我们提供一种无需使用饲养层胶质细胞的从小鼠胚胎脑中培养高纯度海马神经元的方案。...

从小鼠胚胎中分离与培养海马神经元

该视频展示了从新生小鼠脑组织中分离和培养细胞的方法。该方法包括对脑组织进行酶消化和机械解离，随后在不含神经元生长因子的培养基中进行培养，以获得混合的胶质细胞群体。...

从新生小鼠脑组织中获取混合胶质细胞培养物

本视频展示了一种从成年小鼠脊髓组织中分离和培养原代混合胶质细胞的技术。该方案包括对组织进行酶消化，随后去除破碎的细胞膜和髓鞘碎片，以获得单细胞悬液。然后将细胞接种于适合混合胶质细胞生长的优化培养基中进行培养。...

建立源自小鼠脊髓的原代混合胶质细胞培养

我们展示了一种用于直接研究肠神经系统中神经元和胶质细胞组分的细胞培养方案。该方法通过取自成年小鼠肌间神经丛的神经元/胶质细胞混合培养，在盖玻片上建立培养体系，从而能够利用电生理学、免疫组织化学等方法对单个神经元和胶质细胞的功能进行检测。 等等.

一个 体外 成年小鼠肌间神经丛分离肠神经元和胶质细胞的制备

本文详细描述了一种从单只成年小鼠的脑室下区和齿状回同时生成神经前体细胞培养物的实验方案，该培养物可采用贴壁单层培养或神经球培养的形式。...

一只小鼠，两种培养：从单只小鼠的两个神经发生区分离与培养成年神经干细胞

神经病理性疼痛的发生涉及脊髓胶质细胞的病理性改变。一种源自成年脊髓组织并用于研究这些细胞的可靠胶质细胞培养体系 体外...

成年小鼠脊髓组织原代混合胶质细胞培养物的制备

尽可能充分地在体外实验中模拟体内条件并非易事。使用原代细胞培养是理解完整生物体中细胞生物学的重要一步。本方案详细介绍了如何成功培养和培育小鼠胚胎小脑神经元。...

从小鼠胚胎小脑分离神经元的原代培养

本文介绍了一种从小鼠中枢神经系统体外分离多种胶质细胞群体的实验方案。该方法可分离出不同区域的小胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞以及星形胶质细胞，以便在多种培养体系中分别研究各类细胞的表型特征。...

从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞

本方案描述了一种小胶质细胞-神经元共培养体系，该体系由从小鼠胚胎第15-16天分离的原代神经元细胞以及从出生后第1-2天新生小鼠脑组织中获取的原代小胶质细胞建立而成。...

生成并共培养小鼠原代小胶质细胞与皮层神经元

了解如何从胚胎小鼠大脑建立混合神经元和神经胶质细胞培养物，用于研究中枢神经系统病毒感染和先天免疫反应。该方法结合RT-qPCR、显微镜和流式细胞术，可减少动物使用并提高实验效率。

建立来自小鼠胚胎脑组织的神经元与胶质细胞混合培养体系以研究感染与先天免疫

探索更多视频