Name: 用于测定单细胞材料特性的剪切测定方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 了解剪切测定方案用于量化癌细胞与非癌细胞的力学特性差异，通过微流控设备评估细胞变形性和粘弹性。该方法有助于识别早期癌症诊断的新型生物标志物。

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作者感谢伍斯特理工学院Soboyejo课题组先前的研究人员首次开创了该技术：曹一芳博士、胡敬杰博士和Vanessa Uzonwanne博士。本研究由美国国家癌症研究所（NIH/NCI K22 CA258410，资助对象：M.D.）提供支持。插图使用BioRender.com制作。

1. 单细胞剪切实验的准备工作
<ol>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>在含有 2 mL 培养基的 35 mm × 10 mm 培养皿中接种约 50,000 个悬浮的单细胞。 
		注意：接种前需涡旋振荡悬浮细胞，以打散细胞团块。</li>
		<li>将细胞在 37 °C 条件下孵育，静置 10 至 48 小时，以确保细胞贴壁及细胞骨架蛋白完全形成。 
		注意：应考虑细胞贴壁时间以及增殖和生长速率，以保证细胞充分生长和贴壁，同时避免细胞聚集。这些参数因细胞类型而异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 剪切力实验
<ol>
	<li>剪切力测定黏性流动介质的制备
	<ol>
		<li>为确保流动培养基具有轻微的黏性（0.015–0.02 Pa·s），请测量并向培养基中添加0.05 wt%无毒且无致敏性的甲基纤维素（4 Pa·s）。</li>
		<li>为确保混合均匀，将基础培养基在约60-70 °C 使用磁力搅拌器/加热板。在持续搅拌培养基的同时，缓慢加入甲基纤维素，使其迅速分散，避免甲基纤维素颗粒结块。继续搅拌约15–24小时，以确保形成澄清的培养基+纤维素溶液。 
		注意：避免过度加热溶液。</li>
		<li>使用流变仪测试约0.5–1 mL的代表性流动介质，以测量其黏度。根据仪器读数确定流体黏度，并将该值用于表示剪切流体介质的黏度。μ) 以使用公式（2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剪切装置设置
	<ol>
		<li>设置双注射器（60 mL 或 100 mL）剪切力测定系统，将注射器连接至可编程注射泵，用于黏性培养基的灌注与回抽图1).</li>
		<li>将两个注射器连接到流室上 通过 1/16 英寸管路及管路连接件</li>
		<li>在流路中固定橡胶垫圈，以实现单个细胞沿流动路径的可控且均匀的流动图1）。橡胶垫圈有不同尺寸，具体取决于所需的流动模式（层流或湍流）和期望的观察区域（例如，长度为22.5 mm，宽度为2.5 mm，高度为0.254 mm）（图1).</li>
		<li>将泵设置为以指定流速（例如，1 mL/min）灌注并抽取特定体积的液体（例如，60 mL），并选择相应规格的注射器（例如，60 mL）。 
		注意：应考虑最大灌注和抽吸体积的预设值，以避免发生堵塞或故障。使用公式（2用于计算所需泵剪切速率（假设所需的应力和黏度已知）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预剪切设置
	<ol>
		<li>用制备好的黏性流动介质填充注射器。</li>
		<li>将装有60或100 mL（或根据需要）黏性流动培养基的注射器以及一个空的60 mL注射器分别连接至可编程注射泵的相应位置。 通过 将管路和管路连接器连接至流动室，并将两个注射器与管路相连。</li>
		<li>为便于识别单个细胞并确保流室与培养皿之间连接牢固，需将橡胶垫圈安装到流室上。</li>
		<li>吸除含有目标细胞的培养皿中的细胞培养基。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗去死细胞和未贴壁的细胞。</li>
		<li>吸除 PBS。</li>
		<li>将流动小室和橡胶垫圈（约34 mm × 9 mm）插入并固定到含有贴壁细胞的培养皿（35 mm × 10 mm）上。</li>
		<li>将装有细胞的微流控灌注室置于培养皿中，然后放置在倒置显微镜载物台上，选用足够高倍的物镜以获得高像素值的高质量图像（通常介于 40x 和 63x 放大倍数）和显示监视器。</li>
		<li>选择 活体成像 （在显示器上的显微镜软件中选择某些软件的延时成像）选项。确保计算机上的显微镜软件具备延时（t）功能，或能够进行视频录制。</li>
		<li>调节显微镜物镜，确保获得足够的对比度和清晰的细胞边缘，这对于剪切后的图像分析至关重要。移动显微镜载物台，使细胞在显示屏幕上清晰可见，并确认为实时动态图像。</li>
		<li>在已安装的流室+培养皿的成像/流经路径内（由垫圈与流室的贴合所形成的区域/路径），选择一个或多个独立的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剪切与成像
	<ol>
		<li>为保持连续均匀的流动，应选择相近的灌注与抽吸速率，并确保流体呈层流状态，通常介于 1 mL/min 和 5 mL/min对于低层流状态，确保雷诺数为 重新 &lt; 100.</li>
		<li>点击 运行 通过剪切泵以恒定速率注入和抽出剪切流体（配制好的黏性培养基）。确保流体灌注过程中无气泡产生，以免对细胞引入额外的、不可控的应力。</li>
		<li>单击开始录制视频 记录 在显微镜下，灌注的剪切流体与目标细胞接触之前，启动显微镜软件。</li>
		<li>继续记录7分钟，或根据所需的应激暴露时间进行记录，直至目标细胞从培养皿底部脱落。点击 停止记录 在运行按预期完成后，于显微镜软件中进行相应操作。</li>
		<li>保存记录并导出为 .tiff 文件. 最好在以下条件下提取图像 每秒1帧 便于分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据处理
<ol>
	<li>数字图像相关程序（图像分析）
	<ol>
		<li>如果显微镜记录以视频文件形式导出，请将其转换为图像帧（建议使用 .tiff 文件格式）。</li>
		<li>将剪切实验记录获得的图像导入 Davis 10.1.2 软件（DIC 软件），通过在后续新图像（变形图像）中定位参考图像中每个像素块（子集），追踪细胞天然结构的运动（图 2）。</li>
		<li>为获得优化的相关性，建议使用 31 × 31 像素 的子集大小、20 像素 的步长（每个子集的变形距离），并选择 差分轨迹求和 选项，该选项可追踪新图像相对于上一图像的变形。相关分析结果为应变-时间曲线图（图 3），可导出为 .csv 文件，供 MATLAB 进一步分析。</li>
		<li>划定所选单个细胞的兴趣区域。在已划定的细胞区域内选择任意点以追踪变形。对于细胞等不规则形状，使用 多边形掩模 来描绘细胞的几何轮廓。</li>
		<li>完成区域划定后，点击 添加应变计，并在已定义的细胞边界内选择细胞上的特定位置（如细胞核或细胞质），绘制单个应变计以进行分析。</li>
		<li>点击 运行 开始应变处理，获取应变随时间变化的数据。</li>
		<li>双击（或右键点击）生成的应变-时间曲线图，选择 将数据导出为电子表格。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 机械性能表征
<ol>
	<li>粘弹性特性表征
	<ol>
		<li>将DIC软件生成的包含应变-时间数据的.csv文件保存到单独的文件夹中，以便MATLAB能够方便地读取。</li>
		<li>运行 MATLAB 并单击 编辑器标签 打开一个编辑器页面，编写代码以逐个单元格读取电子表格。</li>
		<li>更改 MATLAB 路径（访问目标文件的文件夹路径），以指向包含待分析数据的文件夹，例如， 用户/用户名/桌面/数据.</li>
		<li>在 MATLAB 编辑器页面中，使用自定义代码访问电子表格数据。例如：a1 = xlsread('data','run1','A4:A183')，其中 a1 代表 标识符, xlsread 是 MATLAB 函数 那个 读取 .csv 文件 （在此情况下，以电子表格形式） 数据 是 文件名，run1 是 工作表名称，以及 A4:A183 是 电子表格数据中A列感兴趣数据的范围 待分析。为获得完整拟合，请分析 x 和 y (时间 和 菌株，分别）。例如： 
		a1=xlsread('data','run1','A4:A183'); 
		b1=xlsread('data','run1','B4:B183'); 
		a1 = x（时间），b1 = y（应变）。</li>
		<li>在 MATLAB 中，单击 应用程序 | 曲线拟合器 | 自定义方程. 清除代表性的自定义方程，并输入粘弹性模型方程 [方程（1)，其中 ε 表示 x 变量，t 表示 y 变量。 
		<img alt="蠕变柔量方程，弹性公式；应力松弛；材料力学分析" src="/files/ftp_upload/65333/65333eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">     (1) 
		此处，ε 表示应变，σ 表示剪切应力， η1 表示黏度，E 表示弹性，t 表示时间，且 τ 表示弛豫时间，用于表征细胞在发生初始形变后恢复至原始形状所需的最长时间。其表达式为 τ = <img alt="流体力学公式中的 η₂/E 符号，与研究分析中的黏度和弹性相关。" src="/files/ftp_upload/65333/65333eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2">，其中 η2 是第二个阻尼器的二级黏度项（图4).</li>
		<li>在自定义方程界面中，将新的变量重新分配给粘弹性参数。（ε， η1，E，σ，t，和 τ = <img alt="流体力学公式中的 η₂/E 符号，与研究分析中的黏度和弹性相关。" src="/files/ftp_upload/65333/65333eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2">) 分别表示 (x, a, b, K, y 和 c)。其中，x 和 y 分别为自变量和因变量。剪切应力（σ）可通过公式（2): 
		<img alt="静态平衡公式，σ=6μQ/wh²，用于描述应力计算的概念。" src="/files/ftp_upload/65333/65333eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3">     (2) 
		此处， μ repr表示剪切流体介质的黏度，Q 为泵的流速， w 和 h 分别为图中流道的宽度和高度 图1C分别。</li>
		<li>点击 选择数据 选择 时间（a1） 和 菌株 (b1) 每组数据。</li>
		<li>确保 自动适配框选项 检查后，当选中数据（x 和 y）时，将自动运行拟合。</li>
		<li>选择合适的方法以收紧边界条件。单击 高级选项 在……之下 方法 类别并选择 非线性最小二乘法. 在……之下 稳健的，选择 关闭，以及在……之下 算法，选择 信赖域将其他所有参数保持不变。</li>
		<li>拟合后得到的新变量（a、b 和 c）分别代表黏弹性特性、黏度、弹性以及松弛时间η1，E，EQUAT），分别表示细胞的（图5).</li>
		<li>寻找拟合的高R平方值（R²）2 &gt; 80%），以确保数据输出可被视为黏弹性模型的真实拟合图3)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

<ol><li>Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+advances+in+molecular+biomarkers+for+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).</li>
<li>Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+properties+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Biomechanical properties of cancer cells.</a> Cells. 10 (4), 887(2021).</li>
<li>Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+viscoelastic+properties+and+the+actin+cytoskeletal+structure+of+triple+negative+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).</li>
<li>Onwudiwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+creep+properties+and+the+cytoskeletal+structures+of+non-tumorigenic+breast+cells+and+triple-negative+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).</li>
<li>Ani, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+assay+study+of+single+normal%2Fbreast+cancer+cell+deformation+and+detachment+from+poly-di-methyl-siloxane+%28PDMS%29+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).</li>
<li>Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+and+biophysics+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biomechanics and biophysics of cancer cells.</a> Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+viscoelasticity+of+human+osteosarcoma+cells+using+a+shear+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method.</a> Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+measurement+of+human+osteosarcoma+cell+elastic+modulus+using+shear+assay+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science.+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments.</a> Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).</li>
<li>Onwudiwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeletal+structure+and+the+statistical+variations+of+the+mechanical+properties+of+non-tumorigenic+breast+and+triple-negative+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505(2021).</li>
<li>Kirmizis, D., Logothetidis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+probing+in+the+measurement+of+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics.</a> International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).</li>
<li>Haase, K., Pelling, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+cell+mechanics+with+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society.+Interface%22%5BJournal%5D)">Investigating cell mechanics with atomic force microscopy.</a> Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970(2015).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society.+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li>
<li>Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+heating+in+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Laser-induced heating in optical traps.</a> Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).</li>
<li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+viscosity+and+corticcal+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).</li>
<li>Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biomechanics+toolbox%3A+experimental+approaches+for+living+cells+and+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Materialia%22%5BJournal%5D)">The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules.</a> Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).</li>
<li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+principles%2C+practices%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).</li>
<li>Choi, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+shear+stress+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+by+downregulating+ERK+and+GSK3beta+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities.</a> Breast Cancer Research. 21 (1), 6(2019).</li>
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<li>Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+tumor+mechanical+stresses+promote+cancer+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape.</a> Cells. 11 (23), 3840(2022).</li>
<li>Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).</li>
<li>Krog, B. L., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+the+circulating+tumor+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).</li>
<li>Moose, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+resist+mechanical+destruction+in+circulation+via+RhoA%2Factomyosin-dependent+mechano-adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation.</a> Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).</li>
<li>Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+stiffness+and+topographic+feature+dictate+interfacial+invasiveness+of+cancer+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids.</a> Biofabrication. 15 (1), (2023).</li>
<li>Kashani, A. S., Packirisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+optimize+elasticity+for+efficient+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Cancer cells optimize elasticity for efficient migration.</a> Royal Society Open Science. 7 (10), 200747(2020).</li>
<li>Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microenvironmental+cues+and+mechanical+loading+milieus+in+breast+cancer+cell+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526(2021).</li>
</ol>

作者声明无竞争性财务利益。

剪切力检测方法通过构建拟态的力学生物学环境，模拟细胞与其周围力学微环境的相互作用以及对机械应力的响应，已系统性地揭示了一系列细胞力学特性，这些特性的模式显示出在不同癌细胞系中保守存在的物理异常特征3,4,5,7,8。该方法结合了基础流体力学与物理学原理，用于表征细胞独特的力学性质，并为多种难治性癌症的检测提供了潜在的材料或力学生物标志物3,4。
剪切力测定技术存在一定的局限性。由于某些细胞类型生长和增殖迅速，维持单细胞培养具有挑战性，这使得单个细胞的观察与分析变得困难。不同细胞系之间的细胞对压力的耐受性及其响应可能存在异质性，因此需要使用大量细...

研究癌细胞与非癌细胞之间的生物物理差异，可为新型诊断和治疗手段提供机遇1。了解生物力学/机械生物学差异如何影响肿瘤进展及治疗耐药性，将为靶向治疗和早期诊断开辟新的途径2。
已知癌细胞的力学特性与正常细胞存在差异（例如细胞膜和核膜的黏弹性）3,4,5，但目前仍缺乏用于在活细胞中测量这些特性的稳健且可重复的方法6。剪切实验方法通过将单个细胞暴露于流体剪切应力下，并分析其对施加应力的个体响应和抵抗能力，从而量化细胞的力学特性3,4,5,7,8,9。尽管已有多种方法和技术被用于表征单个细胞的力学特性，但这些方法往往会对细胞材料特性产生影响：i) 原子力显微镜（AFM）相关的压痕深度、复杂的探针几何形状或基底硬化可能导致细胞膜穿孔或损伤10,11；ii) 光学捕获过程中诱导细胞光损伤12,13；或 iii) 微吸管抽吸引发复杂的应力状态14,15。这些外部效应会导致细胞黏弹性测量结果的准确性存在显著不确定性6,16,17。
为解决这些局限性，本文所述的剪切力检测方法提供了一种高度可控且简便的方法，用于模拟体内生理流动，同时不会影响细胞材料的特性。该检测中的流体剪切应力代表了细胞在体内因肿瘤间质液或循环血液中的流体所经历的机械应力18,19,20。此外，这些流体应力可促进癌细胞的多种恶性行为，包括进展、迁移、转移和细胞死亡19,21,22,23&#160;，这些行为在致瘤性与非致瘤性细胞之间有所不同。此外，癌细胞的力学特性发生改变（即，它们通常比同一器官内的正常细胞更&#34;柔软&#34;），使其能够在恶劣的肿瘤微环境中持续存在，侵入周围正常组织，并转移至远端部位24,25,26。通过构建一种伪生物环境，使细胞经受生理水平的流体剪切应力，从而实现一种生理相关且对细胞无损伤的过程。细胞对所施加流体剪切应力的响应使我们能够表征细胞的力学特性。
本文提供了一种剪切力测定实验方案，可用于深入研究在施加剪切应力条件下癌细胞与非癌细胞的力学特性及行为。细胞对外部力的响应具有弹性和黏性特征，因此可被理想化为一种黏弹性材料3该技术分为以下几类：（i）分散的单细胞培养，（ii）流体剪切应力的可控施加，（iii） 原位 细胞行为的成像与观察（包括对压力和形变的抵抗能力）、(iv) 细胞应变分析以确定形变程度，以及 (v) 单个细胞黏弹性特性的表征。通过探究这些力学性质与行为，可将复杂的细胞力学生物学过程转化为可量化的数据。该方法的实验方案可用于系统记录并比较不同类型恶性与非恶性细胞。对这些差异进行量化，有望建立用于诊断和治疗的生物标志物。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1×[-] 碳酸氢钠</td><td>Corning</td><td>25-053-ci</td><td>用于细胞培养中细胞从基质上的解离</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Falcon by Corning</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon by Corning</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>任意</td><td></td><td>用于无菌细胞培养</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）1×</td><td>Corning</td><td>10-013-cv</td><td>或其他适用于细胞培养的培养基。本实验使用 DMEM 培养 U87 细胞</td></tr><tr><td>手套</td><td>任意</td><td></td><td>用于无菌细胞培养</td></tr><tr><td>Heracell Vios 160i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>51033770</td><td>用于细胞培养过程中的孵育</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>任意</td><td></td><td>用于无菌细胞培养</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>任意</td><td></td><td>用于无菌细胞培养</td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td>任意</td><td></td><td>用于无菌细胞培养</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica/任意</td><td></td><td>用于无菌细胞培养</td></tr><tr><td>不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS），1×</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>任意</td><td></td><td>用于无菌细胞培养</td></tr><tr><td>移液管吸头</td><td>任意</td><td></td><td>用于无菌细胞培养</td></tr><tr><td>Precision GP 10 液体培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;剪切力实验&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL 烧杯</td><td>任意</td><td></td><td>用于配制含甲基纤维素的高黏度 DMEM 剪切流体</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流动腔室 + 橡胶垫圈</td><td>Glycotech</td><td>31-001</td><td>圆形流动腔室套件（适用于 35 mm 组织培养皿）</td></tr><tr><td>混合流变仪</td><td>HR-2 Discovery Hybrid Rheometer</td><td></td><td>用于测定剪切流体的黏度</td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>任意</td><td></td><td>用于配制含甲基纤维素的高黏度 DMEM 剪切流体</td></tr><tr><td>磁力搅拌板</td><td>任意</td><td></td><td>用于配制含甲基纤维素的高黏度 DMEM 剪切流体</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>任意</td><td></td><td>用于提高流动培养基中 DMEM 的黏度</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD Scientific Geminin 88 plus</td><td>788088</td><td>用于编程控制液体的注入与抽出</td></tr><tr><td>注射器、管路和连接件</td><td></td><td></td><td>用于剪切装置的搭建</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABAQUS 软件</td><td>Simulia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字图像相关软件</td><td>LaVision, Germany</td><td>DAVIS 10.1.2</td><td></td></tr><tr><td>成像软件</td><td>Leica/任意显微镜配套软件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB_R2020B</td><td></td></tr></tbody></table>

用于测定单细胞材料特性的剪切实验方案

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

异常的生物力学特性是癌症生物学的一个显著特征，受到广泛研究。细胞的力学性质与材料的力学性质相似。细胞对应力和应变的抵抗能力、弛豫时间以及弹性等性质均可被测定，并与其他类型细胞进行比较。量化癌细胞（恶性）与正常细胞（非恶性）的力学特性，有助于研究人员进一步揭示该疾病的生物物理基础。尽管已知癌细胞的力学特性始终不同于正常细胞，但目前尚缺乏一种标准的实验方法，用于从培养细胞中推导这些力学性质。
本文概述了一种用于量化单个细胞力学特性的实验方法 体外 使用流体剪切实验。该实验的原理是将流体剪切应力施加于单个细胞，并通过光学手段实时监测细胞随之发生的形变。随后，利用数字图像相关（DIC）分析对细胞的力学特性进行表征，并将合适的黏弹性模型拟合至DIC分析所得的实验数据。总体而言，本文所述方案旨在为难治性癌症的诊断提供一种更有效且更具针对性的方法。

结合数字图像相关法（DIC）与黏弹性模型的剪切实验方案可成功量化单个细胞的力学特性 体外该方法已在人和小鼠细胞系上进行测试，包括正常人乳腺细胞（MCF-10A）3,4,9转移性较低的三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-468）3三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）3人骨肉瘤细胞7,8，以及最近研究的胶质母细胞瘤细胞（图3）。从剪切实验记录中提取的图像帧的微分干涉差（DIC）能够成功生成与蠕变应力响应相容的应变-时间数据（图3），可拟合至一个粘弹性模型（图4</str...

本方案概述了对癌细胞系和非癌细胞系机械特性的定量分析方法 体外癌细胞与正常细胞在力学特性上的保守差异可作为一种生物标志物，可能对疾病的预后和诊断具有重要意义。

不规则的生物力学特性是癌症生物学的一个显著特征，目前正受到广泛研究。细胞的力学特性与……相似

癌症的物理特征是癌症研究中相对较新且令人兴奋的课题。我们的研究旨在具体表征癌细胞与非癌细胞的力学特性，以更深入地理解癌细胞在体内耐受剪切力并侵入免疫系统的物理机制。我所在研究领域的最新进展是微流控装置和高通量技术的应用。因此，在这项研究中，大规模地研究了细胞的变形能力以及细胞的黏弹性特性，同时也致力于发现新的生物标志物，例如细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白的调控，用于癌症的早期诊断。当前该领域面临的主要实验挑战包括肿瘤微环境的复杂性、研究的规模与通量、临床转化、标准化与可重复性，以及多模态数据的整合。基于我以往和当前的研究，我在该领域取得的一些重要发现是：癌细胞与正常细胞可通过其对机械应力的响应加以区分；而细胞抵抗机械应力的程度依赖于其结构完整性，这种结构完整性在相当程度上由细胞内丝状肌动蛋白等细胞骨架蛋白及其他结构蛋白的存在所决定。本方案提供了一种简单、可重复且非破坏性的方法，用于在力学层面表征培养细胞。相比之下，原子力显微镜（AFM）和光镊等其他技术则需要较高的操作技术门槛，且通量相对较低。通过应用剪切力检测技术，我们将显著推进单细胞力学特性的表征，并有助于多种跨领域研究，例如罕见病诊断、个体化诊断与治疗，以及单细胞药物相互作用的监测。开始实验前，需先制备用于剪切力实验的黏性流动培养基。具体操作为：使用磁力搅拌器或加热板将基础培养基在60至70摄氏度下预热约10至20分钟。在持续搅拌培养基的同时，缓慢加入甲基纤维素，以促进甲基纤维素颗粒快速分散，避免结块。让此过程持续约 15 至 24 小时，以确保培养基与纤维素充分混合均匀。为安装剪切装置，需将橡胶垫圈连接至流路中，以固定流室与培养皿之间的连接，并确保单细胞的流动处于受控且均匀的状态。橡胶垫圈有多种尺寸，可根据所需的流体剖面和观察区域进行选择。接下来，建立剪切力测定系统，该系统由60或100毫升的双注射器组成，连接至可编程的注射泵，用于黏性培养基的灌注与回抽。将制备好的黏性流动培养基装入一支注射器中，并将其连接至注射泵相应的接口位置，然后将另一支空注射器连接至注射泵的另一个注射器接口位置。使用一根1/16英寸的管路和管路连接器将两个注射器连接到流室。设置泵以指定流速注入和抽出一定体积的液体，并选择相应的注射器。屏幕上显示了一个程序示例。从培养皿中吸除细胞培养基，以准备进行剪切。接着将流动室与橡胶垫圈插入并固定在含有贴壁细胞的培养皿上。将装配好的含细胞的微流控流动室置于倒置显微镜载物台上，并连接至显示显示器。现在，该装置已准备好对单个细胞施加流体剪切应力，并通过光学手段监测细胞的形变情况。要执行单细胞剪切实验方案，请使用预先组装好的剪切装置，该装置包含一个安装好的微流控流动室，放置于含有目标细胞的培养皿上。将整个装置置于倒置显微镜上，并配备足够高倍率的物镜和显示监视器。调节显微镜物镜，确保具有足够的对比度和清晰的细胞边缘。移动显微镜载物台，使细胞在显示监视器上清晰可见，并呈现为实时图像。在已安装的流动室和培养皿的成像或流动路径内，选择一个细胞或多个独立的细胞。为保持连续且均匀的黏性介质流动，应选择相近的灌注和抽吸速率。确保流体呈层流状态流动，雷诺数（Re）应小于100。点击剪切泵上的“运行”按钮，以连续速率注入和抽出剪切流体。确保在液体灌注过程中无气泡产生。在显微镜下，于灌注的剪切液接触目标细胞之前，点击软件上的“Record”开始录制视频。持续录制七分钟，或根据所需应力暴露时间进行录制，直至目标细胞从培养皿底部脱落为止。当运行按预期完成时，在显微镜软件中点击“停止录制”。软件将自动保存图像和视频，可使用U盘拷贝用于进一步分析。建议以每秒一帧的速率将图像提取为TIFF文件，以便于分析。使用数字图像相关（DIC）软件进行数字图像相关分析时，将剪切实验记录获得的图像导入DIC软件，建议采用TIFF文件格式。为实现优化的相关性计算，选择“差分和”选项，该选项可追踪新图像相对于上一图像的变形情况。选择子集大小为31 × 31像素，步长为20像素。确定所选单个细胞的兴趣区域。对于细胞等不规则形状，使用多边形掩膜来勾勒细胞的几何形态。在已勾勒的细胞内选择任意点以追踪形变。完成映射后，通过点击“添加应变片”并在已定义的细胞边界内选择特定位置（如细胞核或细胞质），绘制单个应变片以进行分析。点击“开始”以启动应变处理，获取应变随时间变化的数据。由此相关性分析生成的应变-时间曲线图可导出为 CSV 文件，以便在 MATLAB 中进行进一步分析。双击或右键单击生成的应变-时间曲线图，然后选择导出数据。从剪切实验记录中提取的图像帧所获得的数字图像相关（DIC）结果成功生成了与蠕变应力响应兼容的应变-时间数据。采用剪切实验技术的研究结果显示，癌细胞通常比正常细胞更具机械顺应性且黏性更低。从正常细胞状态到轻度转移状态，再到高度转移状态，随着癌症进展的加剧，细胞的刚度和黏度均呈下降趋势。然而，这些细胞类型的应力松弛时间并未表现出显著差异。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

用于测定单细胞材料特性的剪切测定方案

开发了一种用于在剪切流动的流速-流速梯度平面内进行小角中子散射测量的剪切池，并用于表征复杂流体。该装置可在流速梯度方向上实现空间分辨测量，适用于剪切带状材料的研究。应用范围包括胶体分散体系、聚合物溶液以及自组装结构的表征。...

利用1-2平面流动-小角中子散射测量流动条件下材料的微观结构

该流动黏附实验为T细胞与上皮细胞相互作用提供了一个简单且高影响力的模型。通过注射泵产生剪切应力，并利用共聚焦显微镜采集图像以进行定量分析。这些研究的目标是在流动条件下有效量化T细胞的黏附情况。...

剪切应力下T淋巴细胞-黏附分子相互作用研究的黏附力检测方法

本文介绍了一种在流体剪切应力条件下培养内皮细胞并进行基因表达分析的工作流程。该流程包括一种物理装置，可在受控环境中同时容纳和监测多个流动腔室，并采用外源性参照RNA进行定量PCR分析。...

使用多个平行板流动腔对暴露于剪切应力下的内皮细胞进行基因表达分析

本文描述了一种高通量微流控生物反应器与荧光显微镜联用的方法，用于分析剪切应力对表达绿色荧光蛋白的铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

剪切应力对活细胞分析的影响 铜绿假单胞菌 使用自动化高通量微流控系统

本方案描述了患者来源类球体的生成及后续分析，包括增殖定量、细胞毒性检测、流式细胞术、免疫荧光染色和共聚焦成像，以评估候选药物作为抗肿瘤治疗剂的潜力。该方案有助于精准医疗，可为每位患者及疾病阶段确定特定药物。...

用于靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选的生理性患者来源三维球体

我们描述了一种在溶液中利用锥板黏度计对血小板表面受体施加均匀剪切力的方法。该方法也可更广泛地用于对其他细胞类型和细胞碎片施加剪切力，且无需针对特定的配体-受体对。...

通过锥板黏度计法检测人血小板及细胞表面受体的均匀剪切力测定

本文介绍一种利用基于电子学的微流控平台——机械节点孔传感（mechano-NPS）技术，对单个细胞进行机械表型分析的方法。该平台在测量细胞弹性与黏性等生物物理特性的同时，可保持每秒1至10个细胞的中等通量。...

机械-节点-孔传感：一种用于多参数单细胞黏弹性测量的快速无标记平台

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。...

同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

我们描述了一种分离和培养人隐静脉内皮细胞（hSVECs）的方案。同时提供了详细的方法，用于施加剪切应力和拉伸力，以研究hSVECs中的机械应力。...

人隐静脉内皮细胞的分离及其在可控剪切应力与拉伸条件下的暴露

该方法通过检测细胞断裂固定化配体呈递DNA双链的倾向性，以报告细胞相对牵引力。断裂的荧光寡核苷酸被递送至细胞内，并通过流式细胞术进行分析，记录细胞的力学历史。该技术可实现细胞力生成的高通量测量，适用于细胞力学表型分析。...

基于DNA张力探针破裂及递送入细胞的高通量流式细胞术细胞机械表型检测

本文介绍一种通过胶原酶A和胰蛋白酶序贯消化从小鼠完整角膜获取高质量单细胞悬液的实验方案。该方法获得的单细胞具有较高的RNA完整性和活性，适用于单细胞RNA测序和流式细胞术等下游应用。y.

从小鼠角膜获取单细胞悬液的实验方案

了解剪切测定方案用于量化癌细胞与非癌细胞的力学特性差异，通过微流控设备评估细胞变形性和粘弹性。该方法有助于识别早期癌症诊断的新型生物标志物。

用于测定单细胞材料特性的剪切实验方案

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