Name: 猪常态离体肝灌注 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 了解猪常态离体肝灌注技术用于评估高风险肝脏移植物活力并减少肝细胞损伤。该方法为移植前器官修复和再生治疗研究提供了重要的实验平台。

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作者谨向参与这些实验的鲁汶大学医学院的所有研究生表示感谢。

鲁汶大学遵循涉及动物研究的欧盟动物福利指令（Directive 2010/63/EU）。该指令已纳入比利时法律，强调&#34;3R原则&#34;（替代、减少、优化），并确保动物使用的合理性基于潜在的科学收益，且不存在可行的替代方法。本方案中的所有实验均依照欧盟动物福利指令进行，并已获得鲁汶大学动物护理委员会批准（P054/2020）。
1. 动物信息
注意：本研究方案使用3月龄雄性TOPIGS TN70猪，体重约30 kg，肝重为600-700 g。
<ol>
	<li>将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗的节律下，单栏饲养，自由摄食和饮用自来水，同时保持动物之间的视觉、嗅觉和听觉接触。</li>
	<li>确保动物至少在手术前2天到达，以适应周围环境。手术前禁食12小时，但可自由饮水。 
	&#8203;注意：麻醉采用异氟烷维持，镇痛使用芬太尼。在整个麻醉过程中，持续监测心电图、脉搏血氧饱和度、二氧化碳浓度监测和血压。实验为终末性实验；在持续全身麻醉和镇痛状态下，通过放血法处死猪，并同时获取肝脏。</li>
</ol>
2. 灌注装置的准备
<ol>
	<li>一次性灌注套件的安装
	<ol>
		<li>将储液器固定在比肝脏接收容器高约15 cm的固定高度处。</li>
		<li>将泵头连接至离心泵上指定的插槽。将氧气管连接至氧合器。将加热器/冷却器的进出管连接至氧合器上对应的插槽。</li>
		<li>在储液器下方的出流管上安装一个夹管阀。在Y型连接处之后、通向储液器的进流管上安装第二个夹管阀，另一根管路将用于向肝动脉供液。 
		注意：第一个夹管阀将控制进入门静脉的流量。关闭第二个夹管阀将增加流量，从而提高肝动脉内的压力。</li>
		<li>在储液器出流管上第一个夹管阀的远端安装流量传感器。在通向泵头的进流管上安装第二个流量传感器。 
		注意：第一个流量传感器将测量进入门静脉的流量。第二个流量传感器将测量下腔静脉的流出量。</li>
		<li>剪断从氧合器引出的出流管，并按正确方向插入动脉过滤器。 
		注意：从氧合器后端剪断的管路长度不得超过2 cm；若留得过长，在使用37 °C灌注液灌注后管路变软时可能发生弯折。如果仍出现弯折，可通过将动脉过滤器绑在储液器支架上来加以固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>泄漏再循环管路的安装
	<ol>
		<li>灌注套件包含两根管路，每根一端为3/16接口，另一端为1/16接口。将两根管路通过将1/16端插入3/16端的方式连接在一起。将3/16端连接至储液器。</li>
		<li>将管路安装到蠕动泵中，注意旋转方向。设置合适的管路直径，并将转速设为每分钟15–18转（rpm）。将1/16端放入肝脏接收容器中，必要时进行固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连续在线血气分析仪校准
	<ol>
		<li>打开气体分析仪，选择校准。</li>
		<li>核对传感器包装上的正确序列号，然后按确定。</li>
		<li>从校准卡匣中取出动脉传感器支架，将传感器连接至支架，顶部装上蓝色帽，底部装上白色滤膜。</li>
		<li>拧下并取下滤膜下方的白色帽；切勿拧下滤膜本身。松开顶部的蓝色排气帽，但不要取下。将传感器及支架牢固地插入校准卡匣中。</li>
		<li>开始校准。校准完成后，将传感器及支架从校准卡匣中取出。取下底部的白色滤膜，并拧紧顶部的蓝色排气帽。</li>
		<li>将传感器插入灌注套件的取样管路中。在灌注回路完成预充之前，不得启动气体分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回路预充
	<ol>
		<li>将输液管插入500 mL血浆代用品袋中，并连接至储液器。在储液器出流管路上夹上管夹，向储液器中加入300 mL血浆代用品。</li>
		<li>移除管夹，使血浆代用品充满整个回路。</li>
		<li>排除泵头和氧合器中的空气。此时回路已完成预充。开启加热器/冷却器，并将其温度设定为38 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>输液管路的准备
	<ol>
		<li>用50 mL注射器抽取5 mL（25,000 U）浓度为5 U/mL的肝素溶液，再额外抽取25 mL 0.9% NaCl溶液，得到总体积为30 mL的肝素溶液（输注速率：1 mL/h）。</li>
		<li>将5 g牛磺胆酸钠溶解于50 mL 0.9% NaCl溶液中，再将其加入450 mL 0.9% NaCl溶液中，最终获得1%浓度的溶液。共需168 mL（输注速率：7 mL/h）。</li>
		<li>用50 mL注射器抽取2 mL（200 U）浓度为100 U/mL的胰岛素溶液，再额外抽取28 mL 0.9% NaCl溶液，得到总体积为30 mL的胰岛素溶液（输注速率：1 mL/h）。</li>
		<li>抽取10 mL甘氨酸缓冲液（稀释液），加入含有0.5 mg依前列醇的西林瓶中。使用依前列醇套件中提供的微生物过滤器，从已用甘氨酸缓冲液重悬的依前列醇西林瓶中抽取5 mL至50 mL注射器中。再额外抽取25 mL 0.9% NaCl溶液，得到总体积为30 mL的依前列醇溶液（输注速率：1 mL/h）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 麻醉诱导
<ol>
	<li>镇静
	<ol>
		<li>准备一支含有2 mg/kg赛拉嗪和8 mg/kg Zoletil（4 mg/kg替来他明和4 mg/kg唑拉西泮）的注射器、一支含有10 mL 0.9% NaCl的注射器、一个三通阀、一条延长管和一支肌内注射用21 G针头。</li>
		<li>将针头插入臀肌，注射赛拉嗪和替来他明混合液，并用0.9% NaCl冲洗延长管。15分钟后，猪进入镇静状态。</li>
		<li>称量猪的体重，并将其转运至手术室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>打开呼吸机。</li>
		<li>将猪仰卧位固定于手术台上，并固定四肢。</li>
		<li>使用通气面罩进行预充氧，氧气流量为1.5 L/min O2，1.5 L/min空气，1%异氟烷。</li>
		<li>将血氧饱和度探头连接至猪尾或耳部。连接三个心电图导联以进行持续监测。</li>
		<li>在耳缘静脉插入一支22 G导管，连接至三通阀，并以400 mL/h的速度开始静脉输注（IV）液体（Plasmalyte）。</li>
		<li>将含有50 µg/mL芬太尼的60 mL注射器放入自动注射泵中。先推注1 mL作为负荷剂量，随后以0.16 mL/kg/h的速度开始持续输注。</li>
		<li>移除通气面罩，插入喉镜并抬起会厌。将气管插管插入气管，并充气气囊以防止漏气。用胶带将插管固定在猪的吻部。 
		注意：移除通气面罩时应关闭异氟烷。</li>
		<li>将气管插管连接至呼吸机。 
		注意：呼吸机参数设置：潮气量0.4 L；平均气道压0.5 kPa；气道峰压2.5 kPa；呼气末正压0.5 kPa；呼吸频率15次/分钟；呼气末CO2分压4.7–5.3 kPa。</li>
		<li>将二氧化碳监测仪连接至气管插管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 手术
<ol>
	<li>深静脉导管与动脉导管
	<ol>
		<li>用聚维酮碘消毒手术区域，并在中线两侧铺上手术巾。</li>
		<li>从胸骨顶部左侧向外侧做一条7厘米长的切口&#160;胸锁乳突肌并放置牵开器。</li>
		<li>向侧方游离皮下组织，暴露肌肉，辨认颈外静脉。游离该静脉，如有分支则予以结扎。</li>
		<li>在颈外静脉周围放置两根2/0结扎线，并结扎近头端的结扎线。</li>
		<li>在结扎线远端切开静脉，插入一根12号法国静脉导管。 
		注意：插入前务必用肝素化生理盐水冲洗静脉导管。</li>
		<li>用第二根结扎线固定导管。如果耳静脉中的静脉导管脆弱或过细，应将静脉输液和芬太尼管路切换至深静脉导管；否则，在血液回收至细胞保存装置前，请勿使用该导管。</li>
		<li>游离胸锁乳突肌内侧缘，撤除直角拉钩，打开胸锁乳突肌外侧与气管内侧之间的间隙。</li>
		<li>去除胸腺以暴露颈动脉。对动脉重复步骤 4.1.4。</li>
		<li>将动脉导管向尾侧插入颈动脉并固定。将动脉导管连接至压力监测仪的导管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>主动脉和腔静脉的解剖分离
	<ol>
		<li>从剑突至耻骨联合行正中剖腹切口。 
		注意：在雄性猪中，从阴茎向尾侧方向，在距中线1 cm处做侧向切口，以避免损伤皮下尿道。</li>
		<li>横断脐韧带。放置腹部牵开器。将肠管向左外侧及头侧牵拉，以暴露腹主动脉和下腔静脉。 
		注意：猪的小肠未发生旋转，因此无需游离结肠即可进入腹膜后间隙。</li>
		<li>在髂动脉分叉近头端处游离约3 cm的主动脉，并在主动脉周围放置两根结扎线。 
		注意：主动脉附近有一条较大的淋巴管；操作时需小心避免损伤，以免造成手术视野模糊并增加解剖难度。</li>
		<li>在与主动脉相同水平处游离下腔静脉，并放置两根结扎线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胃十二指肠韧带解剖
	<ol>
		<li>从胃十二指肠韧带的外侧开始解剖，游离胆总管，并用血管套圈环绕。</li>
		<li>将胆管向内侧牵拉，暴露门静脉。切除门静脉外侧的一个大型淋巴结。</li>
		<li>向胰腺方向游离门静脉；此处常有来自胃和胰腺的分支，需结扎并切断。用血管吊带在肝脏侧环绕门静脉，用结扎线在胰腺侧环绕门静脉。将门静脉向侧方牵拉，注意避免压迫闭合。</li>
		<li>辨认肝总动脉，并用血管环将其环绕。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胸主动脉夹层
	<ol>
		<li>向尾侧牵拉肝脏，从肝上腔静脉处向前切开膈肌的中心腱部分。将食管向右侧牵开，暴露胸主动脉。</li>
		<li>从周围组织中分离，注意不要损伤奇静脉。 
		注意：无需完全游离胸主动脉；解剖范围应充分延伸以放置血管夹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞回收装置的准备
	<ol>
		<li>将储液瓶挂在黑色环上，取下单腿接头的盖子，并将管子连接到血样收集储液瓶底部的3/8英寸出口端口。</li>
		<li>打开吸力/抗凝管盖，将其连接至血液收集储液罐顶部边缘的1/4英寸血液入口端口之一。</li>
		<li>将洗涤试剂盒的碗状容器旋转插入，确保听到咔哒声。</li>
		<li>将管子放入蠕动泵和管路分配器中。</li>
		<li>将柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖腺嘌呤（CPDA）-1 血液采集袋挂在支架上，并确保连接紧密。 
		注意：CPDA-1 血袋成分（63 mL）：无水柠檬酸 2.99 g/L；柠檬酸钠二水合物 26.3 g/L；磷酸二氢钠一水合物 2.22 g/L；葡萄糖一水合物 31.9 g/L；腺嘌呤 0.275 g/L。</li>
		<li>将废液袋挂在机器侧面（确保已正确关闭），并连接至清洗试剂盒（黄色盖帽）。</li>
		<li>将两个Y形管（白色管帽）连接到一袋3 L的0.9% NaCl上。</li>
		<li>将带蓝色帽的管子连接到储血器底部的适配管上。启动自体输血系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>主动脉与腔静脉插管
	<ol>
		<li>给予500 IU/kg肝素，循环2分钟。在主动脉周围结扎尾侧结扎线，并插入20 French导管并固定。对下腔静脉重复相同操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为模拟DCD手术过程，通过夹闭胸主动脉一段时间（本实验为60分钟）以诱导热缺血。 
	注意：在热缺血期间，开放下腔静脉和颈静脉引流，开始将血液收集至细胞回收装置。这会导致猪完全失血。通过心电图、脉搏血氧测定、二氧化碳浓度监测和血压测量确认动物死亡。</li>
	<li>灌注肝脏
	<ol>
		<li>在热缺血结束时，通过主动脉插管用2升冰冻（4-6 °C）保存液进行冷冲洗，同时在腹部表面敷冰屑以降温。 
		注意：在冷灌注过程中，所有残留的血液均被冲洗出并收集至细胞回收装置中。</li>
		<li>当冲洗完最初的2 L后，将套管从主动脉中取出，结扎门静脉上的结扎线，并对门静脉进行插管，随后用血管环固定。</li>
		<li>灌注肝脏 通过 门静脉注入另一2升冰冻（4-6°C）保存液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝切除术
	<ol>
		<li>移除腹部的冰块。在靠近胰腺处横断胆管。</li>
		<li>移除门静脉套管并切断门静脉。将肠管向左牵拉，以暴露肝下腔静脉。</li>
		<li>从后腹膜分离下腔静脉，并在肾静脉头侧将其切断。游离肝总动脉至腹腔动脉及其在主动脉的起始处。 
		注意：切开右侧膈脚可改善暴露。</li>
		<li>离断胃十二指肠动脉，并连同主动脉壁补片一并切除腹腔动脉。沿胃小弯上方横断小网膜，直至食管。</li>
		<li>切断左侧三角韧带以游离左肝，于下腔静脉左侧切开膈肌。</li>
		<li>从腹侧向背侧切开右侧膈肌，游离右肝，至下腔静脉肝后段横断处稍尾侧结束。</li>
		<li>切断肝上腔静脉并剪断任何残留的连接组织。肝脏现已游离，将其取出并置于盛有冰水的容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>背桌操作
	<ol>
		<li>称量肝脏。用25 French导管插管门静脉，并用结扎线固定。用14 French加硬导管插管肝动脉，并用结扎线固定。</li>
		<li>插管下腔静脉肝后段，将导管尖端置于肝静脉汇入下腔静脉的水平位置，用结扎线固定。</li>
		<li>在膈肌边缘缝合一圈荷包线，以防止膈肌静脉出血，并结扎肝上静脉。</li>
		<li>排出灌注导管中的空气，用250 mL冷血浆代用品在台面上反向冲洗门静脉。检查是否有渗漏。 
		注意：检查腔静脉插管的流出是否充分。</li>
		<li>门静脉冲洗后，在门静脉套管上夹上管夹，确保无空气进入套管和门静脉。</li>
		<li>排出动脉插管中的空气，经肝动脉灌注250 mL冷血浆代用品。检查有无渗漏，并结扎任何侧支血管。在动脉和下腔静脉插管上放置管夹。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 常温机械灌注
<ol>
	<li>灌注液
	<ol>
		<li>在台面准备期间，将细胞回收机产生的洗涤红细胞加入回路中，以获得30%的目标血细胞比容。启动泵以混合红细胞与血浆代用品。启动连续式气体分析仪。 
		注意：计算所需红细胞体积以达到目标血细胞比容的公式为：(肝脏重量 + 预充体积) × 目标血细胞比容 / 洗涤后血细胞比容。连续式气体分析仪还可提供灌注温度的反馈信息，通常与加热器设定的38 °C一致。</li>
		<li>向灌注液中加入10 mL 10%葡萄糖酸钙、2 mL肝素（10,000 IU）以及750 mg头孢呋辛溶于10 mL 0.9% NaCl的溶液。将手动气体混合器设置为0.5 L/min的气体流速，FiO2为21%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动灌注
	<ol>
		<li>打开压力传感器、流量传感器和用于泄漏再循环的滚压泵。</li>
		<li>将肝脏置于容器中。在门静脉和动脉流入管以及腔静脉流出管上安装管夹，并剪除Y型连接器。</li>
		<li>使用T型连接件将插管与各自的流入和流出管连接。防止空气进入回路。</li>
		<li>在T型连接件上安装三通阀，并连接压力监测管路。对压力管路进行调零，并开始持续压力监测。</li>
		<li>调节夹管阀，几乎完全关闭，以防止超生理流量及内皮细胞应力。</li>
		<li>通过移除门静脉流入管上的管夹来启动灌注。门静脉灌注开始后立即移除腔静脉流出管上的管夹并启动泵。泵速由压力控制，目标是使腔静脉流出压维持在-5 mmHg至-2 mmHg之间。门静脉灌注流量目标为0.75 mL/min/g肝组织。</li>
		<li>当门静脉灌注稳定且腔静脉压力合适时，移除动脉管上的管夹。目标动脉压力为55–60 mmHg，流量约为0.25 mL/min/g肝组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>维持稳定的灌注血流动力学
	<ol>
		<li>用玻璃罩或塑料薄膜覆盖肝脏表面，以防止热量散失。</li>
		<li>如果门静脉流量过高，可通过关闭门静脉流入管上的夹管阀进行调节。</li>
		<li>如果腔静脉压力过于负值，则在下腔静脉内形成真空的风险增加。可通过降低泵速来缓解过度负压。或者，通过增加门静脉的流入量，可向腔静脉提供更多容积，从而降低负性流出压。</li>
		<li>如果动脉压力过低，可通过提高泵速，或关闭通向门静脉储液器的夹管阀，以迫使更多液体流经动脉流入管，从而提升压力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取样
	<ol>
		<li>从腔静脉流出端的三通阀或氧合器与门静脉储液器之间的指定取样管路中获取灌注液样本。</li>
		<li>在整个灌注过程中进行穿刺活检。由于回路中使用了肝素，无凝血功能，因此穿刺孔必须缝合。</li>
		<li>通过在胆管中固定一根8 French的插管收集胆汁。务必结扎胆囊管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Development and Validation of a Porcine Ex Situ Isolated Liver Perfusion Model 

<ol><li>Dunson, J. R., Bakhtiyar, S. S., Joshi, M., Goss, J. A., Rana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intent-to-treat+survival+in+liver+transplantation+has+not+improved+in+3+decades+due+to+donor+shortage+relative+to+waitlist+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intent-to-treat survival in liver transplantation has not improved in 3 decades due to donor shortage relative to waitlist growth.</a> Clinical Transplantation. 35 (10), e14433(2021).</li>
<li>Monbaliu, D., Pirenne, J., Talbot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+transplantation+using+donation+after+cardiac+death+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver transplantation using donation after cardiac death donors.</a> Journal of Hepatology. 56 (2), 474-485 (2012).</li>
<li>Croome, K. P., Taner, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+landscapes+in+DCD+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Transplantation+Reports%22%5BJournal%5D)">The changing landscapes in DCD liver transplantation.</a> Current Transplantation Reports. 7 (3), 194-204 (2020).</li>
<li>Coffey, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+functional+warm+ischemia+time+on+DCD+liver+transplant+recipients%27+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The influence of functional warm ischemia time on DCD liver transplant recipients' outcomes.</a> Clinical Transplantation. 31 (10), (2017).</li>
<li>Meurisse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+of+liver+transplantations+using+donations+after+circulatory+death%3A+A+single-center+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Outcomes of liver transplantations using donations after circulatory death: A single-center experience.</a> Transplantation Proceedings. 44 (9), 2868-2873 (2012).</li>
<li>Ruck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+trends+in+utilization+and+outcomes+of+DCD+livers+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Temporal trends in utilization and outcomes of DCD livers in the United States.</a> Transplantation. 106 (3), 543-551 (2022).</li>
<li>Nasralla, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+trial+of+normothermic+preservation+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation.</a> Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).</li>
<li>Blondeel, J., Monbaliu, D., Gilbo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+liver+preservation%3A+Are+we+still+missing+pieces+of+the+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Dynamic liver preservation: Are we still missing pieces of the puzzle.</a> Artificial Organs. 47 (2), 248-259 (2022).</li>
<li>Gilbo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+liver+normothermic+machine+perfusion%3A+Methodological+framework+and+potential+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Direct%22%5BJournal%5D)">Porcine liver normothermic machine perfusion: Methodological framework and potential pitfalls.</a> Transplantation Direct. 8 (1), e1276(2021).</li>
<li>Maione, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+isolated+liver+perfusion+for+the+study+of+ischemia+reperfusion+injury%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Porcine isolated liver perfusion for the study of ischemia reperfusion injury: A systematic review.</a> Transplantation. 102 (7), 1039-1049 (2018).</li>
<li>Gilbo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factors+accumulate+during+normothermic+liver+machine+perfusion+regardless+of+donor+type+and+severity+of+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Coagulation factors accumulate during normothermic liver machine perfusion regardless of donor type and severity of ischemic injury.</a> Transplantation. 106 (3), 510-518 (2021).</li>
<li>Butler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+extracorporeal+porcine+liver+perfusion+for+72+hr%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Successful extracorporeal porcine liver perfusion for 72 hr.</a> Transplantation. 73 (8), 1212-1218 (2002).</li>
<li>Eshmuminov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+perfusion+machine+preserves+injured+human+livers+for+1+week%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An integrated perfusion machine preserves injured human livers for 1 week.</a> Nature Biotechnology. 38 (2), 189-198 (2020).</li>
<li>Xu, J., Buchwald, J. E., Martins, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+current+machine+perfusion+therapeutics+for+organ+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Review of current machine perfusion therapeutics for organ preservation.</a> Transplantation. 104 (9), 1792-1803 (2020).</li>
<li>Martins, P. N., Turco, S. D., Gilbo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+therapeutics+during+ex-situ+dynamic+preservation.+a+look+into+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Organ therapeutics during ex-situ dynamic preservation. a look into the future.</a> European Journal of Transplantation. 1, 63-78 (2023).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文中，我们详细介绍了猪肝脏离体常温机械灌注（NMP）的操作经验。该技术的优势包括高度的可转化性和多功能性。猪肝脏NMP既可用于研究并加深对这种增强型保存技术的理解，也可用于模拟移植过程。该系统可对手动控制灌注的各个方面，从而以多种方式调节门静脉和动脉的压力与流量。
为了尽可能接近临床实践，猪的肝切除术以与人类供体相同的方式进行，这意味着需要进行一些离体台上的准备工作。由于这是一个封闭回路系统，在肝脏离体冲洗过程中必须特别注意彻底止血。尽管循环管路允许少量渗漏，但门管区出血过多可能导致溶血增加。准备过程中的另一个关键步骤是下腔静脉流出道插管的位置，因为放置不当可能导致下腔静脉塌陷，从而产生负压，引起流出道阻塞和肝脏充血。因此，采用多孔尖端插管以防止阻塞，并使用伺服调节器控制下腔静脉压力。此外，在再灌注开始时，应在门静脉血流启动数秒后才打开下腔静脉夹，同时应缓慢增加泵速，直至达到理想的流出压。我们还建议将流出道插管固定在肝脏容器上，以确保即使在取活检操作过程中移动肝脏时，流出道插管仍能保持在正确位置。
在离体常温机械灌注（NMP...

肝移植是治疗终末期肝衰竭的唯一确定性手段；然而，其成功受到等待移植患者数量与潜在供体器官可获得性之间长期失衡的限制1为了扩大供体来源，过去十年中供体标准逐步放宽，包括高龄供体、肝脏脂肪变性以及循环死亡后捐献（DCD）2,3在DCD手术过程中，肝脏在撤除生命支持治疗、宣布死亡至器官获取之间不可避免地会经历一段热缺血时间。 原位 冷却与保存，加重缺血-再灌注损伤（IRI）4因此，DCD肝脏与早期移植物功能障碍及胆道并发症的发生率增加相关。5,6.
对于这些高风险供体肝脏，采用静态冷保存进行常规保存无法为缺血-再灌注损伤（IRI）提供足够的保护。因此，诸如常温机械灌注（NMP）等替代性保存策略已受到广泛关注。在常温机械灌注过程中，肝脏被连接 离体 连接至独立回路，并在体温条件下用含氧且富含营养的灌注液进行灌注。临床试验表明，常温机械灌注可减少肝细胞损伤，表现为转氨酶释放峰值降低以及早期移植物功能障碍减少7然而，关于常温机械灌注期间肝细胞生物学特性的研究仍十分有限8.
动物模型在肝移植的发展过程中发挥了关键作用。与啮齿类动物模型相比，猪被认为具有更高的转化价值，因为猪的肝脏在解剖结构和生理特性上与人类接近，器官大小和胆汁成分均相似。然而，猪肝移植模型劳动强度大，难以标准化，且经济成本显著更高。
猪肝常温机械灌注可用于实现不同目的，可应用于模拟移植 离体 使用全血为基础的灌注液时，在以去除白细胞的红细胞为基础的灌注液中保存供体肝脏，以评估可预测肝功能的潜在生物标志物 离体 移植前，或作为研究再生治疗的平台9,10,11.
采用猪肝脏常温机械灌注（NMP）模型存在挑战，而有关手术及灌注相关技术细节的描述尤为匮乏。在我们的研究实验室中，我们采用了Butler等人最初描述的NMP装置。12 开发并验证一种24小时猪模型 离体 一种可用于肝脏移植物移植前保存及模拟移植的离体肝脏灌注模型。本文中，我们描述了一步骤详尽的实验方案；相关的方法学框架及潜在注意事项已在其他文献中发表9.

<table><tbody><tr><td>Alaris GH Plus 注射泵</td><td>BD Care Fusion</td><td>80023 UN 01-G</td><td></td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>Dr&amp;auml;ger</td><td>Titus</td><td></td></tr><tr><td>动脉导管 Cavafix Certo</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>BRAU4152557</td><td></td></tr><tr><td>血气分析仪</td><td>Radiometer</td><td>ABL815</td><td></td></tr><tr><td>10% 葡萄糖酸钙</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>570/13596667/1214</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳图监测仪</td><td>Dr&amp;auml;ger</td><td>Scio</td><td></td></tr><tr><td>自体血回收装置</td><td>Medtronic</td><td>AutoLog</td><td></td></tr><tr><td>离心泵 Biomedicus</td><td>Medtronic</td><td>85315 REV 3.0</td><td></td></tr><tr><td>离心机 Rotina 420R Hettich</td><td>VWR</td><td>521-1156</td><td></td></tr><tr><td>定制灌注管路</td><td>Medtronic</td><td>M323901C</td><td></td></tr><tr><td>一次性自体血回收装置套件</td><td>Medtronic</td><td>ATLS24</td><td></td></tr><tr><td>DLP 单级直型静脉插管 20F</td><td>Medtronic</td><td>66120</td><td></td></tr><tr><td>依前列醇</td><td>GlaxoSmithKline Belgium, Wavre, Belgium</td><td>Flolan</td><td></td></tr><tr><td>芬太尼-Janssen 0.05 mg/mL</td><td>Janssen</td><td>HK-08700</td><td></td></tr><tr><td>血流传感器 BioPro TT</td><td>Em-Tec</td><td>12271</td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛</td><td>VWR</td><td>VWRK4078.9005</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C 超低温冰箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>U570-86</td><td></td></tr><tr><td>冰箱</td><td>Liebherr</td><td>CUP 3513</td><td></td></tr><tr><td>Geloplasma</td><td>Fresenius-Kabi, Bad Homburg, Germany</td><td>freeflex</td><td></td></tr><tr><td>热交换器</td><td>St&amp;ouml;ckert-Shiley, Sorin group</td><td>16-02-1950</td><td></td></tr><tr><td>肝素 5000 IE/mL</td><td>Leo Pharma, Ballerup, Denmark</td><td>HeparinLeo</td><td></td></tr><tr><td>肝动脉插管</td><td>Medtronic</td><td>BIO-MEDICUS 12F</td><td></td></tr><tr><td>IGL-1 器官保存液</td><td>Institut Georges Lopez</td><td>IGL-1/1000/D</td><td></td></tr><tr><td>在线血气分析仪</td><td>TERUMO</td><td>Calibrator 3MCDI 540/CDI 500</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素 200 IU Actrapid</td><td>Novo Nordisk, Dagsvaerd, Denmark</td><td>MEDI-00018</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 1000 mg/g 吸入用蒸气</td><td>Chanelle Pharma</td><td>Iso-Vet</td><td></td></tr><tr><td>静脉导管 BD Insyte-W 20 G</td><td>BD</td><td>381334</td><td></td></tr><tr><td>液氮罐</td><td>KGW Isotherm</td><td>S22</td><td></td></tr><tr><td>Mersilene 250CM M3 USP2/0 无针结扎包</td><td>JNJ medical</td><td>F4503</td><td></td></tr><tr><td>Mersilene 250CM M3.5 USP0 无针结扎包</td><td>JNJ medical</td><td>F4504</td><td></td></tr><tr><td>Mersilene 5X70CM M3.5 USP0 无针</td><td>JNJ medical</td><td>EH6935H</td><td></td></tr><tr><td>Mersilene 6X45CM M3 USP2/0 无针</td><td>JNJ medical</td><td>EH6734H</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 1000 &amp;micro;L</td><td>Socorex</td><td>82,51,000</td><td></td></tr><tr><td>监护仪</td><td>Siemens</td><td>SC 8000</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte Viaflo</td><td>Baxter</td><td>Plasmalyte Viaflo</td><td></td></tr><tr><td>门静脉插管</td><td>CALMED LABS</td><td>18F RV-40018</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>St&amp;ouml;ckert-Shiley, Sorin group</td><td>22-06-2000</td><td></td></tr><tr><td>压力伺服调节器</td><td>Medtronic</td><td>BM 9505-2</td><td></td></tr><tr><td>Prolene 4-0</td><td>JNJ medical</td><td>EH7151H</td><td></td></tr><tr><td>滚压泵</td><td>Cobe Century USA</td><td>468048-000 REV C</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 8.4%</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>362 2339</td><td></td></tr><tr><td>牛磺胆酸钠</td><td>Sigma Aldrich, Burlington, USA</td><td>86339</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 24 号</td><td>Swann Morton</td><td>0211</td><td></td></tr><tr><td>静脉导管，三腔；12FR</td><td>ARROW</td><td>AK-12123-F</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl Vio 250CM M2 USP3/0 无针大包装</td><td>JNJ medical</td><td>V1205G</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪 2%</td><td>VMD Livestock pharma</td><td>XYL-M 2%</td><td></td></tr><tr><td>Zinacef 头孢呋辛 750 mg</td><td>GlaxoSmithKline Belgium, Wavre, Belgium</td><td>NDC 0173-0353-32</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 100</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 100</td><td></td></tr></tbody></table>

猪常温离体肝脏灌注

Porcine Normothermic Isolated Liver Perfusion

猪的肝脏模型 离体 常温机械灌注（NMP）在移植研究中正日益得到广泛应用。与啮齿类动物相比，猪肝脏在解剖结构和生理特性上更接近人类，其器官大小和胆汁成分均与人类相似。NMP通过在肝脏血管系统中循环一种温暖、含氧且富含营养物质的基于红细胞的灌注液，使肝移植物维持在接近生理状态的条件下。NMP可用于研究缺血-再灌注损伤以及保存肝脏 离体 移植前评估肝脏在植入前的功能，并为器官修复与再生提供平台。或者，可采用基于全血灌注液的常温机械灌注（NMP）来模拟移植过程。然而，该模型费时费力，技术难度高，且经济成本昂贵。
在此猪的常温机械灌注（NMP）模型中，我们使用经历热缺血损伤的肝脏（对应于循环死亡后捐献）。首先，实施全身麻醉并进行机械通气，随后通过夹闭胸主动脉60分钟以诱导热缺血。经腹主动脉和门静脉插入导管，用低温保存液对肝脏进行冲洗。冲洗出的血液使用细胞回收装置洗涤，以获得浓缩的红细胞。肝切除术后，将导管插入门静脉、肝动脉和肝下腔静脉，并连接至预先充填血浆扩容剂和红细胞的闭合灌注回路。灌注回路中包含一个中空纤维氧合器，并连接热交换器，以维持38 °C时氧分压（pO₂）在70–100 mmHg。通过动脉持续灌注实现常温机械灌注 通过 通过门静脉连接静脉储液器。持续监测血流、压力和血气值。为评估肝损伤，在预设时间点采集灌注液和组织样本，并收集胆汁 通过 胆总管中的导管

本灌注方案利用肝脏血流的自我调节能力，实现长达24小时的稳定血流动力学条件，并模拟门静脉和肝动脉中生理性的血流分布。图1展示了灌注回路的示意图。图2A显示了稳定的血流分布，门静脉和肝动脉分别贡献了约75%和25%的总肝血流量（在下腔静脉水平测量）。图2B显示肝内血管阻力保持稳定。门静脉的阻力低于肝动脉，与正常的生理状态相似。
稳定且持续的灌注配合充分的氧合可确保肝脏功能在24小时内得到保存。图3A显示，灌注液中天冬氨酸转氨酶（肝损伤标志物）的释放水平在灌注开始后6–12小时内达到稳定状态。此外，灌注液的pH值由肝脏自身调节，并维持在正常范围内，无需添加碳酸氢盐进行补充（图3B）。灌注液中的乳酸在灌注开始后1小时内即可清除至正常水平（图3C</st...

本文所述的猪肝脏常温机械灌注（NMP）模型可成功用于研究NMP作为一种器官保存策略、活力评估工具以及器官修复平台。该模型具有较高的转化价值，但在技术上具有挑战性且劳动强度大。

猪源肝脏离体常温机械灌注（NMP）模型在移植研究中正日益广泛应用。与啮齿类动物不同，猪……

本研究的目的是通过加深对常温机械灌注（NMP）的理解，改善高风险肝脏移植物的保存效果。NMP能够对移植物进行再 conditioning、移植前评估，并为再生治疗提供平台。近期的临床试验表明，常温机械灌注可减少肝细胞损伤，而移植物评估有助于提高器官利用率。然而，目前对肝脏细胞在NMP期间的生物学行为仍知之甚少。动物模型在肝移植的发展过程中发挥了关键作用。在我们的实验室中，我们建立并验证了一种猪离体肝脏灌注模型，该模型可用于研究常温机械灌注（NMP）作为一种器官保存策略，同时模拟移植过程。与啮齿类动物模型相比，本模型的主要优势在于具有更高的转化价值。此外，我们的装置允许研究人员调节所有独立参数，从而实现对灌注过程的完全控制。我们目前的研究重点是灌注液成分和损伤程度对肝脏移植物在常温机械灌注期间固有免疫反应的影响。未来，我们希望探索将常温机械灌注（NMP）作为再生治疗的平台，例如通过给予干细胞旁分泌因子的方式实现。首先，将一根22号导管插入已镇静猪只的耳缘静脉。将导管连接至三通阀，并以每小时40毫升的速度静脉滴注Plasma-Lyte以诱导麻醉。从胸骨上端左侧外侧至胸锁乳突肌处，做一个7厘米长的切口。放置牵开器后，找到颈外静脉，结扎其任何分支并游离该静脉。在颈外静脉周围放置两根2-0结扎线，结扎近头端的结扎线。在已结扎线的尾侧切开静脉，插入一根12 French静脉导管。暴露颈动脉并重复结扎后，将动脉导管向尾侧插入颈动脉，并用2-0号线固定。沿中线从剑突至耻骨联合做切口。横断脐韧带，放置腹部牵开器。将肠管向左外侧和头侧牵拉，以暴露主动脉和下腔静脉。随后游离主动脉在髂动脉分叉头侧的自由段约三厘米，并在该处放置两根结扎线环绕主动脉。在同一水平游离下腔静脉，并环绕其放置两根结扎线。从胃十二指肠韧带的外侧开始，游离胆总管并用血管环环绕。切除门静脉外侧的一个较大淋巴结，并横断一支从胃通向胰腺的血管分支以游离该静脉。在肝脏侧用血管环、在胰腺侧用结扎线分别环绕门静脉。将门静脉向外侧牵拉，确保其未被闭合。找到肝总动脉，并用血管环将其环绕。此时，所有肝门结构均已辨认清楚。将食管向右侧牵拉，暴露胸主动脉。向猪体内给予每千克500单位肝素后，在主动脉远端结扎，随后将一根20法式导管插入主动脉并固定。通过夹闭胸主动脉约60分钟以诱导热缺血，模拟DCD（心脏死亡后捐献）状态。用冰冻保存液冲洗主动脉插管后，在腹部表面放置冰屑以使其降温。冲洗完成后，移除主动脉插管，用结扎线在门静脉周围打结，将插管插入门静脉并通过血管环固定。经门静脉以两升冰冻保存液冲洗肝脏。接下来，将肠管向左牵拉，暴露肝下腔静脉。将腔静脉从腹膜后组织中游离出来，并在肾静脉上方将其切断。然后向上游离肝总动脉，直至腹腔动脉和腹主动脉。接下来，结扎并切断胃十二指肠动脉，连同主动脉的一小片组织一并切除腹腔动脉。切断肝上腔静脉及其他任何残留的连接组织后，取出游离的肝脏并称重。使用25法式导管插管已称重肝脏的门静脉，并用结扎线固定。接下来，使用14号加强型套管插管肝动脉并固定。插管肝下腔静脉并固定。插管胆管，并用荷包缝线固定。通过使用250毫升冷血浆扩容剂反向冲洗门静脉，排除灌注插管中的空气并检测是否泄漏。将切除的猪肝放入容器中。接下来，使用三通连接器将插管分别连接至流入和流出管道。在三通接头处安装三通旋塞，并将其连接至压力管路。将胆管插管置于矿物油下的容器中，开始灌注。门静脉约占肝脏总血流量的75%，而肝动脉约占肝脏总血流量的25%。观察到肝内血管阻力稳定，门静脉的阻力低于肝动脉。稳定且一致的灌注导致天门冬氨酸氨基转移酶在6至12小时内释放水平保持平稳。灌注液的pH值由肝脏自我调节，并维持在正常范围内。灌注开始一小时后观察到灌注液中的乳酸被清除，胆汁分泌维持达24小时。套管在左腔静脉位置放置不当会导致流出受阻，使门静脉阻力增加一倍，进而导致门静脉血流减少，并代偿性地增加肝动脉血流。流出道梗阻还与肝内出血和肝细胞坏死相关，灌注液中天冬氨酸转氨酶浓度升高即表明了这一点。

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科研

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医学

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