Name: 从皮肤活检中生成患者来源的足细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 了解通过非整合型重编程将皮肤成纤维细胞诱导为人诱导多能干细胞并分化为足细胞的方法。该技术可生成携带患者特异性突变的足细胞，为肾脏疾病建模和个性化医疗提供体外研究模型。

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本工作由埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学临床跨学科研究中心（IZKF）资助，资助编号为 M4-IZKF-F009，授予雅尼娜·穆勒-德莱尔；同时由德国联邦教育和研究部（BMBF）资助，项目名称为 STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS，资助编号为 01GM2202D，授予雅尼娜·穆勒-德莱尔。我们感谢安娜莱娜·克劳斯在拍摄扫描电镜图像方面提供的支持。

Using Skin Biopsies to Generate Patient-Derived Podocytes

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
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<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本基于细胞培养的实验方案结合了将人皮肤成纤维细胞通过附加体型重编程技术转化为患者特异性hiPSCs，并进一步将hiPSCs分化为足细胞的过程。该方案使我们能够研究遗传性肾小球疾病患者足细胞中与突变相关的损伤性改变。通过电穿孔法采用无整合方式重编程皮肤成纤维细胞的方案改编自Bang等人的已发表研究32以及Okita等人的研究33。将hiPSCs分化为足细胞的方案则改编自Musah等人已发表的方案28,34,35。目前已有多篇文献描述了从hiPSCs生成足细胞的方法27,34,35。然而，本文所提供的方案在hiPSCs向足细胞分化的过程中经过优化，成本更低。与Musah等人已发表的方案相比，我们测试了多种包被试剂，包括玻连蛋白（vitronectin）、层粘连蛋白silk-511（laminin silk-511）以及可溶性基底膜基质。玻连蛋白和层粘连蛋白silk-511的使用浓度可从原先的5 µg/mL降低至2.5 µg/mL28,34,35。此外，两种价格昂贵的生长因子BMP7和激活素A（activin A）的浓度也可降低50%，从100 ng/mL降至50 ng/mL。
这使得分化成本更低。第7天的肾单位祖细胞仍处于增殖状态，且此前已证明其具有冷冻保存的可行性。我们在解冻后、最终分化前，将这些细胞在含有达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）和B27的基礎培养基中扩增数天，进一步降低了成本。除分化步骤外，本方案还描述了从皮肤活检组织中培养出成纤维细胞，并通过附加体型重编程方法继而生成患者特异性hiPSCs的过程。via 这两种方法的结合，可实现患者特异性足细胞的生成。因此，本文提供了一套完整且逐步详尽的方案，用于生成患者特异性的hiPSC来源足细胞，此类方案此前尚未如此详细地报道过。
由于整个实验方案涉及多种不同的细胞类型，因此在不同步骤中对所获得的细胞类型进行表征至关重要。细胞需要长时间培养，因此应在不同的传代阶段进行质量控制。在培养hiPSCs时，必须每天更换培养基，并持续监测细胞状态和形态。分化培养基必须通过0.2 µm滤膜过滤以确保无菌。从皮肤活检到获得hiPSC来源的足细胞，整个流程需要数月时间，但可在不同阶段对细胞进行冻存。成纤维细胞、筛选出的hiPSC克隆，以及在肾单位前体细胞分化培养基中培养7天后的增殖性肾单位前体细胞均可冻存，从而建立工作细胞库。
尽管由hiPSC分化而来的健康足细胞会形成明显的初级和次级足突网络（图 5A，B）并表达&#160;典型的足细胞特异性标志物（图6A-C），特征性的裂孔隔膜，如所见 体内，这在传统的二维细胞培养模型中难以模拟。此外，在这种单层培养体系中，无法实现与其他肾小球细胞类型的细胞间通讯。
由于足细胞处于终末分化状态且缺乏增殖能力，因此难以对其进行研究 离体通过条件性永生化足细胞技术，借助插入温度敏感型开关，可克服这一局限性，从而建立一种细胞培养模型：该模型中的细胞在33 °C时增殖，在37 °C时分化。13,14尽管这些ciPodocytes在足细胞研究中具有很高的应用潜力，但仍存在一些局限性，例如标志物表达缺失、去分化的形态特征以及无法形成足突结构。15,16.
由患者来源的体细胞分化出足细胞，可实现对病变足细胞与健康对照细胞的生成及比较 离体这使我们能够研究足细胞特异性基因突变导致的足细胞损伤。此外，利用人诱导多能干细胞（hiPSCs）有望构建三维细胞培养疾病模型，即类器官。43,44将hiPSC分化的足细胞与其他肾小球细胞（如肾小球内皮细胞或系膜细胞）进行共培养，可能有助于深入理解健康状态及肾小球疾病中的细胞间通讯机制。
此外，可对患者特异性的足细胞进行表征和治疗 离体 在高通量分析中，这种个体化方法为研究特定突变的新型治疗靶点以及未来实现个体化医疗提供了可能。

足细胞是一种特化的终末分化肾上皮细胞，与肾小球基底膜（GBM）、肾小球内皮细胞及糖萼共同构成肾脏的肾小球滤过屏障。形态学上，足细胞包括胞体以及由微管驱动的一级膜突起和称为足突的二级突起1,2。肾小球滤过屏障可将血液滤过形成尿液，该屏障由有孔内皮、GBM以及连接相邻足细胞足突的一种特殊类型细胞间连接——足细胞裂孔隔膜——所构成3。在健康状态下，由于分子大小和电荷的限制，大于白蛋白的蛋白质无法通过滤过屏障而被保留4。
细胞骨架或足细胞特异性基因的突变，以及影响足细胞信号通路的循环因子，已知可诱导足细胞足突融合、脱落或凋亡，从而导致蛋白尿和肾小球硬化。其中，细胞骨架重排、足细胞极性的改变或足突损伤伴裂孔隔膜的丢失尤为关键5由于足细胞具有终末分化特性，一旦从肾小球基底膜（GBM）上脱落便难以再生替代。然而，若足细胞仍附着于GBM，则仍可从足突融合状态中恢复，并重新形成相互交错的足突结构。6,7,8进一步了解导致各种肾小球疾病中足细胞损伤的事件，可能为开发这些疾病的治疗手段提供新的治疗靶点。足细胞损伤是多种肾小球疾病（包括局灶节段性肾小球硬化症（FSGS）、糖尿病肾病、微小病变性肾病及膜性肾小球肾炎）的标志性特征，因此需要可靠的足细胞模型 离体 用于研究这些疾病的病理机制及潜在治疗方法的模型9,10. 足细胞可以被研究 离体 通过差速筛分法分离肾小球并进行经典原代细胞培养11然而，由于终末分化的足细胞增殖能力有限，大多数研究人员使用表达SV40大T抗原温度敏感变体的小鼠或人源永生化足细胞系。 Alternatively，也可从携带SV40 Tag永生化基因的转基因小鼠中分离获得永生化足细胞1,12.
CiPodocytes 增殖于 33 °C，但会进入生长停滞并开始分化 37 °C13,14需要牢记的是，使用这些细胞获得的实验数据应谨慎解读，因为这些细胞是通过非自然的基因插入方式产生的。15由于这些细胞携带永生化基因，其细胞生理状态因持续增殖而发生改变12. 近期有研究对通过该方法建立的足细胞系提出质疑，因为小鼠、人和大鼠的条件永生化足细胞（ciPodocytes）在蛋白水平上表达的突触足蛋白（synaptopodin）和肾病蛋白（nephrin）均低于5%，且在mRNA水平上NPHS1和NPHS2的表达量相较于肾小球中的表达也显著降低16此外，大多数足细胞系不表达nephrin17,18Chittiprol 等人还描述了 ciPodocytes 在细胞运动性以及对嘌呤霉素和多柔比星的反应方面存在显著差异16在不同肾小球疾病中，足细胞可从肾小球基底膜脱落并出现在尿液中19,20,21,22可培养存活的尿液足细胞 离体 最多可维持2-3周，但大多数细胞会经历凋亡23,24有趣的是，足细胞不仅存在于肾小球疾病患者的尿液中，也存在于健康个体的尿液中，这很可能发生在其衰老时——此时它们在培养中复制能力有限24此外，尿液来源的足细胞数量有限，且在培养过程中会发生去分化，足突减少，形态改变，最重要的是增殖能力有限。足细胞特异性基因的表达缺失，或在数周内消失，或在不同细胞克隆间表达不一。部分表达足细胞特异性标志物的细胞同时表达肾小管上皮细胞、肌成纤维细胞或系膜细胞的标志物，提示培养的尿源性足细胞存在去分化和/或转分化现象。24,25.
最近有研究报道，通过使用温度敏感型SV40大T抗原和hTERT转导，可从患者和健康志愿者的尿液中建立ciPodocyte细胞系26。在这些细胞中可检测到突触足蛋白（synaptopodin）、巢蛋白（nestin）和CD2相关蛋白的mRNA表达，但所有克隆均未检测到足蛋白（podocin）mRNA。除了尿源性足细胞本身存在的问题外，这些细胞还含有插入的永生化基因，从而带来上述种种弊端。
相比之下，人诱导多能干细胞（hiPSCs）在适当条件下具有强大的自我更新能力，并可分化为多种细胞类型。已有研究表明，hiPSCs 可作为足细胞近乎无限的来源27,28。
本文描述了一种两步法方案，通过皮肤穿刺活检获取患者皮肤成纤维细胞，经表观遗传重编程为hiPSCs，再进一步分化为hiPSC来源的足细胞，从而生成患者特异性的足细胞（图1）。
<img alt="足细胞基因治疗过程、hiPSC重编程示意图、药物筛选、个体化治疗。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：生成患者特异性hiPSC来源足细胞的实验方案。 本图展示了从皮肤活检获取的真皮成纤维细胞出发，通过重编程为hiPSC并进一步分化为足细胞，以生成患者特异性足细胞的流程示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
首先，从皮肤活检穿刺样本中分离培养体细胞真皮成纤维细胞，并通过电穿孔技术将表达转录因子OCT3/4、KLF4、SOX2和c-MYC的质粒导入细胞，采用无整合方法将其重编程为人诱导多能干细胞（hiPSCs）29,30,31。随后挑选并扩增获得的hiPSC克隆。分化过程始于激活WNT信号通路以诱导中胚层谱系，接着生成仍具有增殖能力的肾单位祖细胞。最后，将这些细胞进一步分化为足细胞。在本实验流程中，我们对先前已发表的方案进行了修改与整合，包括Bang等人32和Okita等人33报道的基于附加体的hiPSC重编程方法，以及Musah等人28,34,35提出的hiPSC向足细胞分化的方案。
事实上，通过本方案生成的足细胞在发育出明确的初级和次级足突网络以及表达足细胞特异性标志物（如synaptopodin、podocin和nephrin）方面，其表型更接近体内（in vivo）的足细胞。利用由hiPSC分化而来的足细胞，可在重编程和分化过程中保留患者的遗传背景。这使得能够在近乎无限的细胞数量基础上，进行患者特异性的足细胞疾病建模，并在体外（ex vivo）发现潜在的治疗物质。此外，该方案具有微创性、成本效益高、符合伦理要求，可能为药物开发开辟新的途径。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 无菌滤器</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>用于分化培养基的无菌过滤</td></tr><tr><td>全反式维甲酸</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72262</td><td>分化过程中的添加物</td></tr><tr><td>B27 添加剂（50 倍浓度），无血清</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>用于无血清分化培养基的添加剂</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511 Silk</td><td>biogems</td><td>RL511S</td><td>包被液中使用的细胞外基质试剂的额外选择，用于包被适用于人诱导多能干细胞（hiPSC）培养的细胞培养塑料器皿</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）&amp;nbsp;</td><td>Roth</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 带滤盖细胞培养瓶，T75，250 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-856</td><td>适用于成纤维细胞培养的细胞培养塑料器皿</td></tr><tr><td>CHIR99021（5 mg）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252917-06-9&amp;nbsp;</td><td>分化过程中的添加物</td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC 认证基质&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>包被液中使用的细胞外基质试剂的额外选择，用于包被适用于人诱导多能干细胞（hiPSC）培养的细胞培养塑料器皿（溶解的基底膜基质）</td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>Countess II FL&amp;nbsp; 自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>冷冻管，2 mL，QuickSeal 螺口盖，白色</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>用于细胞冷冻保存的冻存管</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）&amp;nbsp;</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td>用于成纤维细胞冻存液</td></tr><tr><td>DMEM/F12（1:1）（1 倍浓度）</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>分化培养基的基础培养液</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>成纤维细胞培养基的基础培养液</td></tr><tr><td>EVOS M5000 成像系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>相差显微镜</td></tr><tr><td>优质胎牛血清，灭活（FCS）</td><td>PAN Biotech</td><td>P301902</td><td>用于成纤维细胞培养基、成纤维细胞冻存液及足细胞维持培养基的血清</td></tr><tr><td>fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus，4 mm 间隙，800 &amp;micro;L 容量，无菌</td><td>Fisherbrand</td><td>FB104</td><td>用于成纤维细胞电穿孔/附加体质粒重编程的比色皿（4 mm 间隙）</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Fluoromount-G 封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td>含 DAPI 的封片介质</td></tr><tr><td>针头（0.6 × 30 mm）</td><td>BD Microlance3</td><td>300700</td><td>用于将 hiPSC 克隆分离成小块</td></tr><tr><td>人重组 Activin A 蛋白</td><td>78001.1</td><td>Stem cell technologies</td><td>分化过程中的添加物</td></tr><tr><td>人重组骨形态发生蛋白 7（BMP7）</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td>分化过程中的添加物</td></tr><tr><td>人 VEGF-165 重组蛋白</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394</td><td>分化过程中的添加物</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）（100 倍浓度）</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>足细胞维持培养基的添加剂</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Roth</td><td>X964.1</td><td>用于 hiPSC 培养的无菌检测</td></tr><tr><td>LookOut 支原体 PCR 检测试剂盒</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MP0035-1KT</td><td>商用支原体检测试剂盒</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Diagonal GmbH &amp; Co.KG</td><td>21,102</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 1.5 mL&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 完整试剂盒</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>无血清 hiPSC 培养基的基础培养液</td></tr><tr><td>Nalgene 冷冻容器 Mr.Frosty</td><td>Roth</td><td>AC96.1&amp;nbsp;</td><td>用于确保最佳冷冻条件</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>abcam</td><td>ab 7481</td><td>用于预孵育溶液和抗体稀释液</td></tr><tr><td>Nunc 24 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>142485</td><td>适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿</td></tr><tr><td>Nunc 48 孔板&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿</td></tr><tr><td>Nunc 6 孔板&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>140685</td><td>适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿</td></tr><tr><td>Nunc EasYDish 培养皿 100 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150466</td><td>适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 孔，Nunclon Delta 处理，平底微孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿</td></tr><tr><td>NutriFreez D10 冷冻保存培养基</td><td>Sartorius</td><td>05-713-1E&amp;nbsp;</td><td>无血清冷冻保存培养基，用于 hiPSC 和肾单位前体细胞的冷冻保存</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>电穿孔培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pCXLE-hMLN</td><td>Addgene</td><td>#27079</td><td>用于附加体质粒重编程的质粒</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4 质粒</td><td>Addgene</td><td>#27077</td><td>用于附加体质粒重编程的质粒</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK 质粒</td><td>Addgene</td><td>#27078</td><td>用于附加体质粒重编程的质粒</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>用于防止细菌污染</td></tr><tr><td>塑料盖玻片</td><td>Sarstedt</td><td>&amp;nbsp; 83.1840.002</td><td>用于 hiPSC 及 hiPSC 来源足细胞的免疫荧光染色</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>商用多聚甲醛（4%），用于细胞固定</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>足细胞维持培养基的基础培养液</td></tr><tr><td>染色室 StainTray 黑色盖</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>用于 hiPSC 解离的酶解细胞脱离溶液</td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（1 倍浓度）</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>用于洗涤和包被</td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 无针头注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>用于过滤灭菌分化培养基</td></tr><tr><td>TC 培养皿 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td>无菌细胞培养塑料器皿，用于皮肤活检切割和成纤维细胞培养</td></tr><tr><td>TC 培养皿 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,900</td><td>无菌细胞培养塑料器皿，用于从皮肤活检中培养出成纤维细胞</td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td>用于预孵育溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>台盼蓝染色液（0.4%），用于 Countess 自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（10 倍浓度）&amp;nbsp;</td><td>Biowest</td><td>X0930-100</td><td>用于成纤维细胞和肾单位前体细胞的解离试剂</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>无动物成分的玻连蛋白（vitronectin ACF）</td><td>Sartorius</td><td>05-754-0002</td><td>包被液中使用的细胞外基质试剂，用于包被适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿</td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐（10 mg）</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>用于防止 hiPSC 在传代过程中发生凋亡</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4&amp;nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60093.1</td><td>多能性标志物，稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60062FI.1</td><td>多能性标志物，稀释比例 1:100</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>增殖标志物，稀释比例 1:300</td></tr><tr><td>突触足蛋白（synaptopodin）</td><td>Proteintech</td><td>21064-1-AP</td><td>足细胞特异性标志物，稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>肾病蛋白（nephrin）</td><td>Progen</td><td>GP-N2</td><td>足细胞特异性标志物，稀释比例 1:25</td></tr><tr><td>足蛋白（podocin）</td><td>proteintech</td><td>20384-1-AP</td><td>足细胞特异性标志物，稀释比例 1:100</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗豚鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21435</td><td>二抗，稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 山羊抗兔 SFX 试剂盒，高度交叉吸附</td><td>Invitrogen</td><td>A31634</td><td>二抗，稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>二抗，稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>二抗，稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>二抗，稀释比例 1:1000</td></tr></tbody></table>

从皮肤活检样本中生成患者来源的足细胞

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

足细胞是位于肾小球滤过屏障尿液侧的上皮细胞，参与肾小球选择性滤过功能。足细胞特异性基因的突变可导致局灶节段性肾小球硬化（FSGS），许多其他原发性和继发性肾病也累及足细胞。由于其高度分化的特性，足细胞的原代细胞培养模型十分有限。&#160;因此，通常使用条件性永生化细胞。然而，这些条件性永生化足细胞（ciPodocytes）存在若干局限性：细胞在培养过程中可能发生去分化，尤其是在达到汇合状态时；此外，多种足细胞特异性标志物的表达水平极低甚至完全不表达。这使得ciPodocytes在生理学、病理生理学及临床研究中的应用价值受到质疑。本文介绍一种通过皮肤穿刺活检获取人源足细胞（包括患者特异性足细胞）的实验方案：首先将皮肤成纤维细胞经附加体型重编程为人诱导多能干细胞（hiPSCs），再进一步定向分化为足细胞。这些足细胞在形态和功能上均接近 体内 足细胞在形态学特征方面表现更佳，例如足突的形成以及足细胞特异性标志物的表达。最后但同样重要的是，这些细胞保留了患者的基因突变，从而实现了更优的 离体 用于以个体化方法研究足细胞疾病及潜在治疗物质的模型。

通过结合表观遗传重编程与定向分化的分步操作方案，可获得携带患者在足细胞相关基因中突变的足细胞。这使得能够分析疾病特异性的足细胞改变。 离体在整个方案的不同细胞阶段，患者的遗传背景均得以保留。此外，通过使用由hiPSC诱导分化的足细胞，可克服终末分化且无增殖能力的足细胞细胞数量不足的局限性。尽管从皮肤成纤维细胞扩增并诱导生成hiPSC来源的足细胞需要数月时间 通过 将细胞重编程为hiPSCs并进一步分化为足细胞的过程中，可在该实验方案的三个不同步骤冷冻保存细胞（图2）。成纤维细胞、hiPSCs 以及在肾单位前体细胞分化培养基中分化 7 天后的肾单位前体细胞均可进行冻存。因此，可建立工作细胞库并开展大规模实验。
<img alt="游离型重编程示意图，包含hiPSCs及足细胞分化；显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：通过相差显微镜观察本实验方案的各个步骤。(A) 扩展生长的真皮成纤维细胞。(B) 重编程后hiPSC克隆的形成。(C) 筛选后的hiPSC培养物。(D) 分化2天后的中胚层细胞。(E) 在肾单位前体细胞分化培养基中分化14天后的肾单位前体细胞。(F) 终末分化的hiPSC来源的足细胞。标尺代表300 µm (A,B,D-F) 和150 µm (C)。雪花图标标示了可能的冻存步骤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
由于生成的hiPSC来源的足细胞需经历一个涉及细胞类型和形态剧烈变化的长周期实验流程，因此必须对细胞进行表征。细胞形态（如大小和形状）以及生长行为可通过相差显微镜进行观察。成纤维细胞呈细长的纺锤形表型，大小为150 µm至300 µm（图2A）。重编程后，出现直径约50 µm的小型hiPSC克隆。这些克隆具有清晰的边界，hiPSC表现出较高的核质比和增殖速率（图2C）。由于足细胞为终末分化的细胞，随着分化进程的推进，其增殖速率逐渐降低，细胞形态转变为直径约300 µm的星形足细胞，并具有明显的足突结构（图2F）。
融合度是hiPSC培养中的一个关键指标，当细胞集落生长过于密集时，可能出现自发分化（图3）。在传代前，必须通过刮除培养皿上受影响区域的方式将这些集落清除。
<img alt="细胞培养显微镜图像，六种类型：细胞形态，300 μm 比例尺。光学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：不同质量的hiPSCs示例。 成功（A）重编程的hiPSC克隆和（B）筛选后的hiPSCs的相差显微图像，以及（C）自发分化、（D,E）非hiPSC克隆和（F）密度过高的hiPSC培养物。比例尺为300 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
本方案中不同类型的细胞必须通过特定标志物的表达进行验证。重编程后，人诱导多能干细胞（hiPSCs）恢复多能性，并表达诸如SSEA4、OCT3/4和Ki67等增殖及多能性标志物（图4）38,39,40。已知重编程过程以及hiPSCs的长期培养和分化可能导致核型异常，或诱发突变41。因此，应通过G显带分析和全外显子组测序，在不同传代阶段对培养细胞的遗传背景进行长期监测。
<img alt="免疫荧光分析：细胞标志物 Ki67、OCT3/4、SSEA4；显微镜图像，比例尺 100 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：通过免疫荧光染色对生成的 hiPSCs 进行表征。 通过染色检测生成的 hiPSCs 中的增殖标志物 Ki67（A），以及多能性标志物（B）OCT3/4 和（C）SSEA4。比例尺为 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
形态学上，hiPSC 分化而来的足细胞呈星形，与 ciPodocytes 相比，具有明显更发达的初级和次级足突网络（图 5）。hiPSC 分化而来的足细胞表达足细胞特异性的标志蛋白，如突触足蛋白（synaptopodin）、肾病蛋白（nephrin）和足蛋白（podocin）（图 6A-C）42。
<img alt="健康供体来源的hiPSC分化足细胞与ciPodocytes的相差显微镜和扫描电镜图像，显示细胞形态差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：hiPSC来源的足细胞与ciPodocytes的形态学比较。通过相差显微镜（A,C）和扫描电子显微镜（B,D）比较（A,B）健康供体来源的hiPSC分化足细胞与（C,D）ciPodocytes的细胞形态及伪足结构。比例尺代表150 µm（A,C）和20 µm（B,D）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
因此，不仅可对来自健康供体的 hiPSC 分化足细胞进行比较，还可对来自具有足细胞特异性基因突变患者的 hiPSC 分化足细胞进行比较，从而实现对患者突变的个体化特征分析 离体.
<img alt="iPSC 分化来源的 cPodocytes 蛋白表达；突触足蛋白、肾足蛋白、足蛋白；显微镜图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6hiPSC来源的足细胞和ciPodocytes中足细胞特异性标志物的表征 比较（A-C健康供体来源的hiPSC分化足细胞D-F) 关于足细胞特异性标志物蛋白——synaptopodin（A,D），nephrin（B，E)，以及足蛋白（podocin）C，F。比例尺表示 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
表1. 本研究中使用的所有细胞培养基和溶液的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本文描述了一种两步法方案，用于从皮肤成纤维细胞生成患者特异性的足细胞 通过 通过附加体型重编程获得人诱导性多能干细胞（hiPSCs）及其向足细胞的后续分化

足细胞是位于肾小球滤过屏障尿液侧的上皮细胞，参与构成该屏障的选择性滤过功能。

我们描述了一种通过附加体型重编程将皮肤成纤维细胞转化为人诱导性多能干细胞，进而生成人足细胞的实验方案。与永生化足细胞相比，这些细胞在足细胞足突结构及足细胞特异性标志物表达方面更接近体内足细胞。足细胞是终末分化的细胞。因此，这些细胞不再增殖，导致在细胞培养中对足细胞进行原代分析受到限制。尽管通过使用条件性永生化足细胞解决了细胞数量有限的问题，但这些足细胞表现出去分化的表型和行为，使其在基础研究中的应用受到质疑。借助诱导性多能干细胞，可以在体外几乎无限地生成具有典型足细胞形态的足细胞，包括明显的足突结构以及足细胞特异性标志物的表达。利用患者特异性的干细胞分化为足细胞时，可以在体外研究这些细胞的疾病特异性改变。例如，最初的皮肤活检取自一名患有遗传性足细胞疾病的患者。通过本方案生成的足细胞是携带患者基因突变的个性化病变细胞。因此，这些细胞代表了一种改进的体外模型，可用于以个体化方法研究足细胞疾病及潜在的治疗物质。首先，取含有成纤维细胞培养基的皮肤活检管。移除培养基，并用五毫升无菌预热的PBS洗涤皮肤钻孔活检样本三次。使用无菌镊子将皮肤穿刺活检组织转移至10厘米的细胞培养皿中，用无菌手术刀将其横向切成三到四片，保留表皮和真皮。将每一片组织转移至无菌的35毫米塑料细胞培养皿中，并轻轻按压使其贴附于培养皿底部。静置5至10分钟，待液体蒸发，活检组织即牢固附着于细胞培养塑料表面。使用1,000微升移液器，将一毫升成纤维细胞培养基逐滴加入活检组织周围，使终体积达到三毫升。将样品在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育七天，期间不换液也不移动培养皿。孵育结束后，更换为新鲜的预热成纤维细胞培养基。最后，使用相差显微镜观察皮肤活检组织周围长出的梭形成纤维细胞，并在培养后冻存选定的细胞。首先，取一培养瓶已培养的成纤维细胞。用适合hiPSC培养的10厘米细胞培养板，每板加入4毫升冷包被液进行编号，于37摄氏度孵育1小时。随后，吸除成纤维细胞的培养基，并用每瓶四毫升的预温 PBS 洗涤细胞。吸去 PBS，每瓶加入四毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 摄氏度下孵育 5 至 7 分钟以解离成纤维细胞。使用相差显微镜观察细胞脱落情况，必要时轻敲培养瓶侧面，使细胞从塑料表面脱落。将脱离的细胞转移至一个50毫升的锥形管中，并用6毫升预热的成纤维细胞培养基清洗空的培养瓶。收集并合并剩余细胞至锥形管中。随后在20摄氏度下以200 ×g离心5分钟。吸去上清液，将细胞沉淀重悬于三毫升新鲜预热的 PBS 中。计数细胞。取 1.5 × 10⁶ 个成纤维细胞转移至新的锥形管中，并用 PBS 补充至五毫升刻度线。在20摄氏度下，以200 g离心5分钟。弃去上清液。将细胞沉淀重悬于5 mL电穿孔培养基中，再次离心。在此期间，吸出已包被的10厘米细胞培养皿中的包被液，并加入7毫升预热的成纤维细胞培养基。离心结束后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于电穿孔缓冲液中，细胞浓度为每250微升含1.5 × 10⁶个细胞。将250微升细胞悬液转移至间距为4毫米的电穿孔比色皿中。接下来，通过将每种质粒各四微克加入至电穿孔培养基中，总体积为50微升，制备质粒转染混合物。将转染混合物转移至电穿孔杯中。轻轻弹击混匀，并以280伏进行一次电穿孔脉冲。最后，将150微升电穿孔后的成纤维细胞转移至已准备好的10厘米细胞培养皿中。在各个方向轻轻晃动培养皿三次，以均匀分散细胞，并过夜培养。成纤维细胞呈现长梭形表型，大小为150至300纳米。重编程后，会出现直径50微米的小型hiPSC克隆，具有清晰的边界。hiPSC的特征是核质比高且增殖速率加快。首先，取电转染后的成纤维细胞培养板，在10倍至20倍物镜的相差显微镜下观察hiPSC克隆的形成。直径为300微米、边界清晰且核质比高的hiPSC克隆适用于挑取。挑取前，用100微升包被液包被适用于hiPSC培养的96孔板的孔，于37摄氏度孵育1小时。孵育期间，用记号笔在细胞培养皿底部标记出目标克隆。在96孔板的最终制备过程中，移除包被液，并向每孔中加入100微升含有10微摩尔ROCK抑制剂Y27632的预热hiPSC培养基。接着，用预热的PBS洗涤细胞，并在挑取前加入新鲜的、含有10微摩尔ROCK抑制剂Y27632的预热hiPSC培养基，以去除死细胞。使用规格针挑取hiPSC克隆，并通过在每个克隆上绘制网格的方式将克隆分割成小块。随后，使用相差显微镜检查菌落是否已成功分割成小块。最后，用100微升移液器将菌落转移至预先准备好的96孔板中，移液时保持移液器垂直位于菌落上方。将细胞置于37°C和5%二氧化碳条件下静置过夜，使其贴壁。次日，将培养基更换为 200 微升新鲜的 hiPSC 培养基，以去除 ROCK 抑制剂 Y27632，并将培养板放回培养箱中。观察 96 孔板，标记出成功挑取的克隆孔。此时，已标记的克隆可进行扩增并冻存。展示了成功重编程的hiPSC集落、被筛选出的hiPSC、自发分化的集落、非hiPSC集落以及密度过高的hiPSC培养物的相差图像。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从皮肤活检中生成患者来源的足细胞

在本视频中，我们介绍了通过在特定化学条件下诱导细胞分化，从诱导性多能干细胞中获得人类肾脏足细胞的实验方案。所获得的足细胞可用于肾毒性测试和疾病模型研究。...

从诱导性多能干细胞衍生人类肾脏足细胞：一种从干细胞定向分化成熟肾脏足细胞的实验方案

关键词：诱导性多能干细胞，肾脏足细胞，定向分化，干细胞分化，肾小球，足细胞标志物，PAX2，WT1，NEPHRIN，SYNPO，细胞培养，肾脏发育

本文的目的是提供一种全面且详细的方案，介绍如何利用表皮角质形成细胞和去活性的人类真皮生成基因修饰的人类类器官皮肤。...

利用去细胞化人真皮生成基因修饰的类器官皮肤培养物

我们提出了一种实验方案，用于诱导多能干细胞来源的角质形成细胞和成纤维细胞的分化，并利用这些角质形成细胞和成纤维细胞构建三维皮肤类器官。该方案包含建立人源化小鼠模型的额外步骤。本文所介绍的技术将有助于推动皮肤科领域的研究进展。...

由脐带血来源的诱导多能干细胞生成三维皮肤类器官

本文介绍了一种化学成分明确的人肾足细胞高效（&gt;90%）分化方案，该方案由诱导性多能干细胞衍生而来，无需基因操作或亚群筛选。本方案可在26天内获得目标细胞类型，适用于肾毒性检测和疾病模型研究。...

在化学成分明确条件下诱导人诱导多能干细胞定向分化为成熟肾足细胞

本文介绍了一种构建个性化器官芯片系统的方案，该系统通过整合由人诱导多能干细胞分化而来的基因匹配的上皮细胞和血管内皮细胞，模拟肾脏肾小球滤过屏障的结构与功能。这种生物工程系统可推动肾脏精准医学及相关应用的发展。...

由人诱导多能干细胞构建的等基因肾小球芯片

从特定组织类型中解离细胞需要优化组织解离的参数，以获得大量具有活性且可培养的细胞。Miltenyi gentleMACS...

从小鼠神经组织制备单细胞悬液

介绍了一种从人皮肤中快速、高效分离活体成年上皮干细胞的方法。该方法利用酶消化皮肤胶原基质，随后拔取毛囊，并分离单细胞悬液或组织碎片用于细胞培养。...

从成人皮肤中分离和培养表皮干细胞

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

蛋白质可折叠成天然结构，也可错误折叠形成不溶性淀粉样蛋白。有利于错误折叠途径的条件可导致不同类型的淀粉样纤维形成。本文所述方法可实现天然蛋白质向淀粉样蛋白的快速转化 体外.

天然蛋白质快速生成淀粉样蛋白 体外

本文介绍一种基于表观遗传重编程的实验方案，可将人类胚胎干细胞（hESCs）定向诱导为均一的骨骼肌前体细胞群体；在允许性培养条件下，这些前体细胞可形成具有收缩功能的三维肌纤维簇（肌球体），从而重现人类骨骼肌的生物学特征。...

通过表观遗传重编程由人胚胎干细胞生成肌球体

了解通过非整合型重编程将皮肤成纤维细胞诱导为人诱导多能干细胞并分化为足细胞的方法。该技术可生成携带患者特异性突变的足细胞，为肾脏疾病建模和个性化医疗提供体外研究模型。

从皮肤活检样本中生成患者来源的足细胞

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