Name: 克氏锥虫体外生命周期三个阶段的超微结构扩展显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 了解超微结构扩展显微镜技术用于克氏锥虫体外生命周期三个阶段的高分辨率成像。该方法兼容常规显微镜，可实现纳米级细胞结构的三维重建，为查加斯病病原体研究提供新工具。

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感谢Dolores Campos在Vero细胞培养方面的协助，以及Romina Manarin在T. cruzi培养方面的协助。本工作得到阿根廷国家科学与技术促进局、阿根廷生产性科学与创新部（PICT2019-0526）、国家科学技术研究委员会（PIBAA 1242）以及英国研究理事会 [MR/P027989/1] 的资助。

注意：图1 展示了完整的实验设计。
<img alt="利用凝胶扩增与免疫荧光显微镜分析锥虫生命周期的示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65381/65381fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1: 三重U-ExM工作流程 体外 生活史阶段 T. cruzi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65381/65381fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
1. 多聚-D-赖氨酸包被盖玻片的制备
<ol>
	<li>在培养皿中放置一张 10 cm × 10 cm 的封口膜。将盖玻片浸入 35 mm 玻璃培养皿中的无水乙醇内进行清洗。</li>
	<li>用镊子将盖玻片从乙醇中取出，并用纸巾吸去多余液体。将盖玻片置于封口膜上。</li>
	<li>用显微镜级纸巾吸除残留的乙醇。在盖玻片中央加入 0.1% v/v 的多聚-D-赖氨酸溶液，并用移液枪头将其铺展，覆盖约 80% 的表面。盖上培养皿，于 37 °C 孵育 1 小时。 
	注意：对于 22 mm2 的盖玻片，使用 200 µL 多聚-D-赖氨酸溶液；对于 12 mm 圆形盖玻片，使用 100 µL 多聚-D-赖氨酸溶液。</li>
	<li>用超纯水清洗盖玻片三次。每次清洗后用真空抽吸法去除水分。可在 4 °C 下保存最多 1 周。</li>
</ol>
2. 溶液配制
<ol>
	<li>配制 38% (w/w) 丙烯酸钠 (SA) 储存液。
	<ol>
		<li>在搅拌条件下，缓慢将 19 g SA 加入 31 mL 无核酸酶水中。 
		注意：该溶液黏度很高；移液时需格外小心。</li>
		<li>待 SA 完全溶解后，将其储存于无菌容器中，4 °C 保存，每 6 个月更换一次。 
		注意：根据品牌不同，SA 有时会因混有聚丙烯酸钠而出现污染迹象，在配制储存液时表现为溶液呈淡黄色且浑浊。若出现此情况，请谨慎使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 40% (w/v) 丙烯酰胺 (AA) 储存液和 2% (w/v) N,N'-亚甲基双丙烯酰胺 (BIS) 储存液。将每种化合物溶于超纯水中，并用 0.22 µm 无菌注射器滤器过滤。储存于无菌容器中，4 °C 保存。 
	警告：AA 和 BIS 为高毒性物质。操作时应在通风橱内进行，并佩戴适当的防护装备（手套、防护服、口罩和护目镜）。</li>
	<li>通过将 37% 甲醛 (FA) 溶液 38 µL 与 40% 丙烯酰胺储存液（步骤 2.2）50 µL 加入 912 µL 磷酸盐缓冲液 (PBS；表 1) 中，配制蛋白交联抑制 (CP) 溶液，最终浓度为 1.4% 甲醛和 2% 丙烯酰胺。 
	注意：CP 溶液必须现用现配，移液时务必精确。例如，使用 P1000 移液器吸取 900 µL PBS，使用 P20 移液器吸取剩余的 12 µL PBS。</li>
	<li>配制单体溶液 
	注意：新配制的溶液不可立即使用；需在 -20 °C 至少储存 24 小时后再使用。
	<ol>
		<li>取 38% SA 溶液（步骤 2.1）500 µL、40% AA 溶液 250 µL、BIS 溶液（步骤 2.2）50 µL，以及 10x PBS（表 1）100 µL，混合均匀。</li>
		<li>将上述总体积 900 µL 分装至 10 个 1.5 mL 无菌微量离心管中，每管 90 µL 单体溶液。-20 °C 保存，最多可保存 2 周。 
		注意：由于 SA 溶液黏度高，移液时可能残留在吸头尖端；操作时需小心，确保完全排空。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制变性溶液
	<ol>
		<li>将 350 mM 十二烷基硫酸钠 (SDS) 溶液（用超纯水配制）114.3 mL 与 4 M 氯化钠溶液（用超纯水配制）10 mL 混合，在 250 mL 烧杯中边搅拌边加入 12 g Tris。 
		警告：SDS 为高毒性物质；操作时应在通风橱内佩戴手套、防护服、口罩和护目镜。</li>
		<li>用浓盐酸溶液调节 pH 至 9，用超纯水定容至 200 mL，储存于无菌瓶中，4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 10% 过硫酸铵 (APS) 溶液和 10% TEMED 溶液。
	<ol>
		<li>将 0.1 g APS 溶于 1 mL 超纯水中。</li>
		<li>用超纯水配制 1 mL 10% TEMED 溶液。</li>
		<li>将上述两种溶液分别分装为 100 µL/管至 1.5 mL 无菌微量离心管中，-20 °C 保存，最多可保存 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制多聚甲醛溶液。
	<ol>
		<li>在 60 °C 搅拌条件下，将 2 g 多聚甲醛溶于 40 mL PBS 中。逐滴加入 1 M NaOH，直至溶液由白色变为无色。 
		警告：甲醛为高毒性物质；操作时应在通风橱内佩戴手套、防护服、口罩和护目镜。</li>
		<li>室温冷却后，在终体积 50 mL 条件下用 NaOH 调节 pH 至 7.2。用 0.22 µm 无菌注射器滤器过滤，储存于无菌容器中。</li>
		<li>将溶液分装为 1 mL/管至 1.5 mL 无菌微量离心管中，-20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制多聚甲醛/戊二醛溶液。
	<ol>
		<li>将 0.2 g 多聚甲醛加入 3.5 mL 超纯水中，再加入 50 µL 16 M NaOH 溶液。加热至 60 °C 以溶解多聚甲醛。</li>
		<li>冷却后加入 300 µL 70% 戊二醛，用超纯水定容至 5 mL，最后用 PBS 定容至 10 mL。 
		警告：多聚甲醛和戊二醛均为高毒性物质；操作时应在通风橱内佩戴手套、防护服、口罩和护目镜。</li>
		<li>将溶液分装为 1 mL/管至 1.5 mL 无菌微量离心管中，-20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 寄生虫培养物的制备
<ol>
	<li>培养 T. cruzi 无鞭毛体。
	<ol>
		<li>在T-25培养瓶（25 cm2 生长面积）中使用无菌培养体系，并通过每48–72小时在含10%胎牛血清（FCS；表1）的肝浸液胰蛋白胨（LIT）培养基中传代培养，使培养物保持在对数生长期。</li>
		<li>确保瓶盖紧闭，将培养瓶垂直放置于28 °C条件下培养。每次传代时，使用Neubauer计数板进行细胞计数，监测寄生虫生长情况。 
		注：本研究所用Dm28c菌株在对数期培养物中的无鞭毛体浓度为1–5 × 107 个寄生虫/mL。</li>
		<li>取对数期培养物，用含10% FCS的LIT培养基制备浓度为2 × 106 个无鞭毛体/mL的悬液。在室温（RT）下以5,000 × g 离心10分钟。用PBS洗涤一次或两次后，重悬于200 µL PBS中。</li>
		<li>将悬液接种至预先用聚-D-赖氨酸包被的圆形12 mm盖玻片上（第1节）。室温孵育15–20分钟。继续进行交联抑制步骤（第4节）。 
		注：也可在寄生虫贴附盖玻片前，使用冷甲醇在-20 °C固定7分钟，或使用甲醛/戊二醛溶液在室温固定10分钟。固定后的寄生虫可在4 °C保存最多1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从感染的Vero细胞中获取无鞭毛体。
	<ol>
		<li>将无菌的圆形12 mm盖玻片置于24孔细胞培养板底部。用含2%胎牛血清（FCS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）制备浓度为2 × 105 个Vero细胞/mL的细胞悬液。每孔接种500 µL。 
		注：本研究使用含2% FCS的DMEM，以减缓细胞生长速度。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2 条件下过夜（ON；12–16小时）孵育，确保细胞贴壁。</li>
		<li>孵育后，用500 µL无菌PBS洗涤细胞两次。每孔加入含2% FCS的DMEM 100 µL，按感染复数（MOI）10加入 T. cruzi 上鞭毛体（即每孔一百万个上鞭毛体）。在37 °C、5% CO2 条件下孵育6小时。</li>
		<li>孵育后，用PBS洗涤培养板两次，每孔加入500 µL含2% FCS的DMEM。此时继续进行交联抑制步骤（第4节）。 
		注：感染后2天可通过倒置光学显微镜观察到细胞质内的无鞭毛体（补充图1）。也可在寄生虫贴附盖玻片前，使用冷甲醇在-20 °C固定7分钟，或使用甲醛/戊二醛在室温固定10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从感染的Vero细胞中获取上鞭毛体。
	<ol>
		<li>收集感染上鞭毛体（MOI 1:10；过夜孵育）4天后、Vero细胞单层（30%–40%汇合度）的上清液。 
		注：对于T-25培养瓶，Vero细胞初始接种量为80万个细胞；对于T-75培养瓶，为200万个细胞。</li>
		<li>使用Neubauer计数板测定上鞭毛体浓度。取4 × 106 个上鞭毛体，在室温下以7,000 × g 离心10分钟。</li>
		<li>用PBS洗涤两次后，重悬于200 µL PBS中。将悬液加至经聚-D-赖氨酸包被的圆形12 mm盖玻片上（第1节）。室温孵育10–15分钟。继续进行交联抑制步骤（第4节）。 
		注：也可在寄生虫贴附盖玻片前，使用冷甲醇在-20 °C固定7分钟，或使用甲醛/戊二醛在室温固定10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 进行交联防止处理（第1天）
<ol>
	<li>将贴附有寄生虫或感染细胞的12 mm盖玻片（细胞面朝上）浸入24孔板中，每孔加入0.5 mL CP溶液（步骤2.3）。</li>
	<li>将未使用的孔中加入水以减少蒸发，用封板膜密封孔板，在37 °C孵育5小时。此步骤也可延长至在4 °C过夜孵育。 
	​注意：始终将盖玻片完全浸入溶液中；切勿将固定液直接通过移液枪滴加在盖玻片上。</li>
</ol>
5. 样品凝胶化操作
<ol>
	<li>在培养皿中组装一个加湿室，上方覆盖封口膜，并在滤纸上加水（图2A）。将水加入滤纸后，在 -20 °C 下孵育 20 分钟以冷却。将 TEMED 和 APS 分装样品在冰上解冻 20 分钟（步骤 2.6）。 
	注意：APS 冻融次数不得超过三次。</li>
	<li>将冷却后的加湿室置于冰上（图2A）。从培养箱中取出第4节中准备好的24孔板。用3 mL巴斯德吸管吸除CP溶液，保留少量溶液，否则盖玻片将难以取出。</li>
	<li>用镊子从固定液中取出12 mm盖玻片，并将其放置在滤纸上，使寄生虫面朝上。 
	注意：使用无菌针头轻轻挑起盖玻片，再用镊子夹持，操作更为方便。</li>
	<li>向90 µL单体溶液（步骤2.4）中加入先前解冻的5 µL TEMED和5 µL APS。用涡旋混合器混合不超过2-3秒；无需盖紧管盖。 
	注意：始终先加入TEMED，最后加入APS。若先加APS后加TEMED，会导致凝胶过程过快，无法进行后续操作。</li>
	<li>迅速在加湿室的封口膜上每张盖玻片对应位置滴加一滴35 µL溶液。立即用镊子夹取盖玻片，使其寄生虫面朝下覆盖在液滴上（图2B）。 
	​注意：每次最多处理两张盖玻片；此步骤必须迅速完成，因为溶液会极快地发生聚合。</li>
	<li>将加湿室先在冰上孵育5分钟，然后在37 °C下孵育1小时。同时开启加热金属块并预热至95 °C，以确保下一步所需的正确温度。</li>
</ol>
<img alt="细胞在凝胶中的包封；在冰上的培养皿中设置；盖玻片下细胞层的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65381/65381fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：凝胶化步骤细节。（A）湿室的组装。（B）将盖玻片滴加到含有TEMED和APS的单体溶液中以进行凝胶化。（C）用于成像的凝胶组装示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65381/65381fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
6. 变性凝胶化样品并进行各向同性扩增
<ol>
	<li>从4 °C取出变性溶液（步骤2.5）。如果出现沉淀，将其放入热水浴中加热至完全溶解。</li>
	<li>向6孔板的每孔中加入2 mL变性溶液。将步骤5.3中的盖玻片转移至含有变性溶液的6孔板中，在室温下轻轻振荡孵育15分钟，使凝胶从盖玻片上脱落。</li>
	<li>使用金属刮勺小心地将凝胶（从12 mm盖玻片上剥离）转移至含有1 mL变性溶液的1.5 mL无菌微量离心管中。使用管盖锁固定管盖，在加热块中95 °C孵育1小时30分钟。 
	注意：在此步骤中，凝胶开始膨胀；转移至1.5 mL微量离心管时应轻柔操作。 
	警告：孵育后，含有凝胶的离心管温度高达95 °C，可能造成危险。操作前务必佩戴防护手套，并让离心管冷却，以防烫伤或液体喷溅。</li>
	<li>进行第一轮扩增
	<ol>
		<li>使用P1000移液器从含有凝胶的1.5 mL微量离心管中吸除变性溶液。用小刮勺将凝胶转移至含有10 mL超纯水的培养皿中，孵育30分钟。</li>
		<li>使用一次性3 mL巴斯德吸管更换超纯水，在室温下过夜孵育。 
		注意：此时凝胶较为脆弱，操作时应轻柔。</li>
		<li>再次使用一次性3 mL巴斯德吸管更换超纯水。 
		注意：三次每次30分钟的水孵育已足够，但为操作方便，建议将第二次孵育延长至过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 目标蛋白的荧光标记操作（第2天）
<ol>
	<li>使用一次性 3 mL 巴斯德移液管从含有凝胶的培养皿中移除水分。用卡尺测量凝胶直径，以计算膨胀倍数（约为 4 至 5 倍）。</li>
	<li>用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，每次 15 分钟。用剃须刀片将圆形凝胶中心部分切割成约 10 mm × 10 mm 的正方形。每种测试条件使用一个凝胶块。 
	注意：PBS 孵育后凝胶会收缩。凝胶可在 4 °C 的 PBS 中保存最多 1 周。</li>
	<li>将每个凝胶块转移至 12 孔板中，加入 500 µL 用 2% PBS-牛血清白蛋白（BSA）稀释的一抗溶液，在 37 °C 振荡孵育 2 小时 30 分钟。 
	注意：也可选择在 4 °C 过夜（ON）孵育一抗。在 24 孔板中，最小抗体用量为 300 µL。一般原则是，抗体浓度应为常规免疫标记所用浓度的两倍。</li>
	<li>在 6 孔板中，用含 0.1% 吐温-20（polysorbate 20）的 2 mL PBS 振荡洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
	<li>将凝胶转移至 12 孔板中，加入 500 µL 用 PBS 稀释的二抗溶液，其中包含 DAPI 及 10 µg/mL 与目标荧光染料偶联的 NHS 酯，在 37 °C 轻柔振荡孵育 2 小时 30 分钟。 
	注意：一般原则是，抗体浓度应为常规免疫标记所用浓度的两倍。也可选择在 4 °C 过夜（ON）进行此孵育步骤。</li>
	<li>在 6 孔板中，用含 0.1% 吐温-20（polysorbate 20）的 2 mL PBS 振荡洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
	<li>将凝胶转移至含有超纯水的培养皿中，孵育 30 分钟。使用一次性 3 mL 巴斯德移液管更换水两次，操作同步骤 6.4。</li>
</ol>
8. 成像与图像处理（第3天）
<ol>
	<li>使用一次性 3 mL 巴斯德吸管从培养皿中移除水，并用卡尺测量凝胶直径，以计算膨胀因子。</li>
	<li>用剃刀切下一小块约 10 mm × 10 mm 的凝胶，将其放置在 35 mm 玻璃底培养皿上。 
	注意：作为替代方法，可将凝胶置于载玻片和盖玻片之间（无需聚-D-赖氨酸处理）。载玻片两侧应粘附用金刚刀切割的小片载玻片，以形成一个厚度与凝胶相近的腔室。</li>
	<li>在 10 倍或 20 倍放大倍数下检查凝胶方向。为正确对焦，需确保寄生虫朝向盖玻片；否则需将凝胶翻转并重新检查（图 2C）。</li>
	<li>确定正确方向后，用显微镜纸吸干凝胶表面残留水分，然后用经聚-D-赖氨酸包被的盖玻片覆盖凝胶。</li>
	<li>向凝胶上添加一小滴超纯水，以便使用共聚焦显微镜进行观察。 
	注意：为确保成像质量，整个过程中必须保持凝胶方向不变，最终使含有细胞且靠近表面的一侧朝向玻璃底培养皿。当使用 35 mm 培养皿时，在底部盖玻片上添加聚-D-赖氨酸可减少图像采集过程中的凝胶位移。</li>
	<li>图像采集参数
	<ol>
		<li>使用共聚焦显微镜（材料表）配合 63 倍油镜、数值孔径（NA）为 1.4 的物镜对样品进行成像。</li>
		<li>采集 Z 轴层扫图像，Z 轴步宽和每个像素的曝光时间应根据样品、信号强度及采集时间优化情况经验性确定。如需提高有效放大倍数，可使用扫描缩放功能。</li>
		<li>使用图像处理软件（材料表）打开 Z 轴层扫图像。对每个通道，使用Group Z-project选项对层扫图像进行合并，并选择最大强度投影。</li>
		<li>使用Merge Channels工具合并图像，并为各通道选择对应颜色。使用处理软件中的Scale Bar工具添加比例尺。 
		注意：也可根据需要自定义各通道颜色（参见代表性结果中的示例）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Ultrastructural Expansion Microscopy in In Vitro Life Cycle of Trypanosoma cruzi

<ol><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
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<li>Dos Santos Pacheco, N., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+auxin-inducible+degron+system+with+ultrastructure+expansion+microscopy+to+accelerate+the+discovery+of+gene+function+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling auxin-inducible degron system with ultrastructure expansion microscopy to accelerate the discovery of gene function in Toxoplasma gondii.</a> Methods in Molecular Biology. 2369, 121-137 (2021).</li>
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作者声明无利益冲突。

超分辨率扩展显微技术是一种通过对生物样本进行物理性膨胀至原始尺寸数倍大小，从而获得高分辨率图像的技术。U-ExM 实验方案包含多个关键步骤，必须谨慎操作以获得最佳结果4。首先，样本需用 CP 试剂固定，并包埋于可膨胀的水凝胶基质中。CP 溶液中的甲醛会与丙烯酰胺的自由共价键发生反应，以防止其与样本形成非特异性结合。在本方案中，我们不建议在 CP 步骤前对细胞进行额外固定，因为这会降低膨胀倍数；但对于某些细胞器（如膜性细胞器）而言，预先固定仍是必要的15。值得一提的是，已有研究报道，为避免化学固定可能引起的某些人工假象，可在样本扩增前采用冷冻固定作为替代方法16。
接下来，通过施加一系列缓冲液使水凝胶膨胀并延展，从而实现样本的物理扩展。扩增后，使用荧光探针对样本进行染色，并利用共聚焦显微镜成像。需要注意的是，固定剂、水凝胶基质和缓冲液条件的选择会显著影响最终结果，因此必须仔细优化这些参数，以获得高质量的图像...

膨胀显微技术（ExM）由 Boyden 等人于 2015 年首次提出1。该技术是一种成像方案，可使常规显微镜实现突破衍射极限的空间分辨率。这种更高分辨率的获得源于样本的物理性放大。为实现这一点，将荧光标记的分子交联至水凝胶中，随后通过水使水凝胶发生各向同性的膨胀。由于这种膨胀，信号在三个维度上几乎实现各向同性的分离。该方法使用低成本化学试剂，借助常规（共聚焦）显微镜即可实现约 65 nm 的空间分辨率，相比标准共聚焦显微镜的分辨率（约 250 nm）提高了约四倍1。
推动扩展显微镜技术在多个生物学领域广泛应用的下一个里程碑，是将传统抗体用于免疫荧光标记的改进方法2。对最初发表的ExM方案的另一项改进是蛋白质组放大分析技术（magnified analysis of the proteome, MAP）3。该方法在样品与水凝胶浸润前引入高浓度丙烯酰胺和多聚甲醛，以防止蛋白质内部及之间的交联，从而更好地保留样品中的蛋白质含量和亚细胞结构。另一种替代方案则通过降低固定剂（甲醛/多聚甲醛和丙烯酰胺）的浓度，优化了分离细胞器整体超微结构的保存效果，该方法被称为超微结构扩展显微镜技术（ultrastructure expansion microscopy, U-ExM）4。
为了获得更高的分辨率，已有研究报道将扩展显微镜技术（ExM）与超分辨率显微技术相结合，包括受激辐射耗尽显微镜（stimulated emission depletion microscopy）或单分子定位显微镜（single-molecule localization microscopy），以实现低于20 nm的分辨率5。
ExM 的应用已在神经科学和细胞骨架研究领域被广泛报道6，但针对寄生性原生生物的研究尚不多见。本实验室首次报道了U-ExM在 T. cruzi7该基础方案主要基于此前的U-ExM相关研究报告 弓形虫（Toxoplasma gondii），疟原虫（Plasmodium） ssp.，以及 布氏锥虫8,9,10,11.
扩展显微技术（ExM）最大的优势之一是其模块化特性，这使其能够灵活地适应不同的生物样本。该实验方案可分为多个步骤（如固定、防止交联或凝胶化），用户可根据实验需求轻松调整各个步骤。此外，该流程还可进行修改，以增强与特定模式生物的兼容性，或实现特定的分辨率。因此，ExM 在先进与非先进的光学系统中均具有巨大潜力，确保了其未来更广泛的应用前景。
恰加斯病（Chagas disease），又称美洲锥虫病，是由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起的一种原生动物寄生虫病，流行于拉丁美洲。该寄生虫的生活史复杂，在哺乳动物宿主中经历两个发育阶段，在昆虫宿主（锥蝽科Triatominidae家族成员）中也经历两个阶段，后者是该病的生物传播媒介。恰加斯病属于世界卫生组织列出的被忽视热带病之一，是拉丁美洲重大的经济和社会问题。流行病学研究估计，全球约有800万人感染恰加斯病，每年死亡人数超过10,000人。这些数据凸显了恰加斯病在全球范围内作为公共卫生问题的重要性。近年来，该病的地理分布发生了变化，由于人口迁移增加，许多感染者现已居住在全球各大城市地区，而不再局限于最初发现该病的拉丁美洲农村地区12。
T. cruzi 在其生命周期中表现出不同的发育阶段，这些阶段可完全在体外（in vitro）进行模拟。无鞭毛体（epimastigotes）是存在于昆虫媒介中的增殖形态，其细胞体中央区域有一个球形细胞核，动基体（一种动质体类特有的含线粒体DNA的结构）呈杆状，位于细胞核前方，并具有一条游离的鞭毛。锥鞭毛体（trypomastigotes）为感染性非增殖形态，具有细长的细胞核、位于后端的圆形动基体，以及一条沿寄生虫全长附着于质膜的鞭毛。细胞内增殖形态为前鞭毛体（amastigotes），其细胞核位于中央区域，动基体呈杆状，位于细胞体前部，鞭毛退化。该寄生虫对不同环境的适应能力正是这些形态变化的体现。此外，这一生命周期涉及对称分裂以及多种过渡性发育阶段13。在分化过程中，锥虫科原虫的细胞骨架发挥着关键作用。该结构由定位于质膜下方、有序排列的稳定微管组成的皮层下微管束构成，形似束带。此外，这些生物体内还存在副鞭毛棒（paraflagellar rod），这是一种晶格状结构，与鞭毛轴丝平行并与其相连14。在整个细胞周期的不同阶段，精确的细胞骨架组织和核结构变化依赖于锥虫科原虫特有的独特基因调控机制，使其成为细胞生物学研究中极具价值的模型系统。
鉴于其尺寸较小 T. cruzi 以及其他原生动物寄生虫，U-ExM 为分析这些重要病原体的结构特征提供了极佳的工具。如前所述，该技术在 T. cruzi 首次由Alonso博士验证7本报告详细阐述了一套完整的U-ExM实验流程，重点介绍在不同生活周期阶段对细胞骨架蛋白进行免疫定位的方法 T. cruzi此外，我们优化了N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）的使用，这是一种全蛋白质组标记物，可使我们标记多种寄生虫结构。此外，一个 体外 描述了获取寄生虫三个阶段的方法。

<table><tbody><tr><td>0.22 微米 PES 无菌注射器滤器</td><td>膜溶液</td><td>SFPES030022S</td><td></td></tr><tr><td>1 L 烧杯</td><td>肖特杜伦</td><td>10005227</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL SPINWIN 微型离心管</td><td>塔尔森</td><td>T38-500010</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 一次性无菌注射器</td><td>NP</td><td>66-32</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 无菌血清移液管</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP211010</td><td></td></tr><tr><td>12毫米盖玻片</td><td>Merienfeld GmbH</td><td>01 115 20</td><td>圆形盖玻片</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP011012</td><td></td></tr><tr><td>22毫米盖玻片</td><td>Corning</td><td>2845-22</td><td>方形盖玻片</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP-011-024</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 烧杯</td><td>肖特杜伦</td><td>C108.1</td><td></td></tr><tr><td>3 mL巴斯德吸管</td><td>Deltalab</td><td>200037</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>Matsunami 玻璃载片</td><td>D11130H</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2&amp;prime;-苯基吲哚二盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>5 ml 无菌血清移液管</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010005</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1610101</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td>APS</td></tr><tr><td>ATTO 647 NHS 酯</td><td>BOC Sciences</td><td>F10-0107</td><td>用于全蛋白质组标记</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Telstar</td><td>生物 II A/P</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA</td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Sanyo</td><td>MCO-15A</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养皿</td><td>塔尔逊斯</td><td>460095</td><td>90 mm 直径</td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12100046</td><td>粉末</td></tr><tr><td>电子数显卡尺</td><td>雷达</td><td>游标卡尺</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Supelco</td><td>1,00,98,31,000</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Internegocios SA</td><td>FCS FRA 500</td><td>无菌且热灭活</td></tr><tr><td>Fiji 图像处理软件包</td><td>ImageJ</td><td></td><td>doi:10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>甲醛 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>FA</td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>马里恩费尔德优质</td><td>PM-3400300</td><td>60 mm 直径</td></tr><tr><td>D(+)葡萄糖</td><td>Cicarelli</td><td>716214</td><td></td></tr><tr><td>70% 戊二醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7776</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG二抗 Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的山羊抗兔IgG二抗</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>115-095-003</td><td></td></tr><tr><td>量筒</td><td>Nalgene</td><td>3663-1000</td><td></td></tr><tr><td>刻度玻璃烧瓶</td><td>Glassco</td><td>GL-274.202.01</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>加热模块</td><td>IBR</td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>血红素</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 36.8-38.0%</td><td>Ciccarelli</td><td>918110</td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td>康宁</td><td>1167U68</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Tecno Dalvo</td><td>TOC130</td><td></td></tr><tr><td>肝浸液</td><td>Difco</td><td>226920</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器和加热器</td><td>实验助手</td><td>HP-3000</td><td></td></tr><tr><td>金属刮勺</td><td>SALTTECH</td><td>200 mM</td><td></td></tr><tr><td>金属镊子</td><td>马里恩费尔德优质</td><td>PM-6633002</td><td></td></tr><tr><td>甲醇 absolut</td><td>Cicarelli</td><td>897110</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>塔尔森</td><td>500010-N</td><td></td></tr><tr><td>显微镜专用纸 KimWipes</td><td>Kimtech Science</td><td>B0013HT2QW</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 水系统</td><td>默克密理博</td><td>IQ-7003</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗α微管蛋白单克隆抗体 DM1A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗PFR单克隆抗体</td><td>纯化的抗体</td><td></td><td>由 Dr. Ariel Silber（USP）捐赠</td></tr><tr><td>N,N&amp;acute;-methylenebisacrylamide</td><td>ICN</td><td>193997</td><td>BIS</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Cicarelli</td><td>834214</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Boeco</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>p1000 移液器</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN P1000</td><td></td></tr><tr><td>p1000 移液器吸头</td><td>塔尔森</td><td>TAR-521020B</td><td></td></tr><tr><td>p20 移液器</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN P20</td><td></td></tr><tr><td>p20 移液器吸头</td><td>塔尔森</td><td>TAR-527108</td><td></td></tr><tr><td>p200 移液器</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN P200</td><td></td></tr><tr><td>p200 移液器吸头</td><td>塔尔森</td><td>TAR-521010Y</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>pH / 氧化还原电位（ORP） / &amp;deg;C米尺</td><td>HANNA Instruments</td><td>HI 2211</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸 0.1%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Cicarelli</td><td>867212</td><td>KCl</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Printex</td><td>BS 2982:1992</td><td></td></tr><tr><td>密封膜 &quot;Parafilm M&quot;</td><td>贝米斯</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408220-25G</td><td>SA</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Cicarelli</td><td>929211</td><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Cicarelli</td><td>750214</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>BioRad</td><td>1610302</td><td>SDS</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Merk</td><td>1-06498</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004380</td><td></td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>康宁</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>卫生纸</td><td>精英</td><td></td><td></td></tr><tr><td>雷公藤多苷</td><td>默克</td><td>1106760500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1610719</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Biopack</td><td>2003-07</td><td>聚山梨酯20</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Silfab</td><td>N33-A</td><td></td></tr><tr><td>Vero 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1587</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>龙实验室</td><td>MX-S</td><td></td></tr></tbody></table>

体外生命周期三个阶段的克氏锥虫超微结构膨胀显微技术

Ultrastructural Expansion Microscopy in Three In Vitro Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi

本文介绍了超结构扩展显微技术（U-ExM）在Trypanosoma cruzi中的应用，该技术可通过物理方式扩大细胞或组织样本，从而提高显微成像的空间分辨率。该方法使用现成的化学试剂和常规实验设备即可完成。
恰加斯病是一种由T. cruzi引起的广泛存在且亟待解决的公共卫生问题。该疾病在拉丁美洲流行，并由于人口迁移增加，已成为非流行地区的重要问题。T. cruzi通过属于猎蝽科（Reduviidae）和半翅目（Hemiptera）的吸血昆虫媒介传播。感染后，T. cruzi无鞭毛体在哺乳动物宿主细胞内增殖，并分化为上鞭毛体，即不具复制能力的血液形态。在昆虫媒介体内，上鞭毛体转化为前鞭毛体，并通过二分裂方式进行增殖。生活史各阶段之间的转化需要细胞骨架发生广泛重组，这一过程可通过多种细胞培养技术在实验室中完全重现。
本文详细描述了在Trypanosoma cruzi的三个体外生命周期阶段中应用U-ExM的技术方案，重点优化了细胞骨架蛋白的免疫定位。我们还优化了N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）的使用，这是一种全蛋白质组标记物，使我们能够标记不同的寄生虫结构。

如果实验方案正确执行（图1），样品将呈现为平坦且半透明的凝胶，可在水中膨胀至原来体积的4–4.5倍（图3A）。这种膨胀可实现约70 nm的有效分辨率，具体数值可能因最终膨胀倍数和所使用的成像系统而有所差异。在完成第二次膨胀过程并使用共聚焦显微镜进行图像采集后，我们观察到膨胀倍数约为4.5。为量化该膨胀效果，我们在步骤7.1前后对凝胶进行了测量。此外，我们使用α-微管蛋白抗体对未膨胀和已膨胀的前鞭毛体进行了标记（图3B）。
使用细胞骨架标记物（如抗微管蛋白抗体）染色时，我们在上鞭毛体、前鞭毛体和无鞭毛体中均观察到该蛋白正确地定位于皮下微管束及鞭毛轴丝结构中，凸显了该技术在三种形态中的应用价值 体外 生活史阶段 T. cruzi (图3C）。此外，使用 DAPI 染色时，细胞核内染色质的凝聚状态可以被清晰地区分（插...

本研究展示了一种详细的三相超结构扩展显微镜操作方案 体外 生活史阶段 克氏锥虫，恰加斯病的病原体。我们包含了细胞骨架蛋白和全蛋白质组标记的优化技术。

我们在此描述了超结构扩展显微技术（U-ExM）在克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）中的应用，该技术可提高空间分辨率……

本方案详细描述了针对引起恰加斯病的病原体——克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）体外生命周期中三个阶段的超微结构膨胀显微镜技术。该方案为当前的超分辨率成像和电子显微镜技术提供了一种替代方法，其优势在于可兼容大多数生物学实验室及仪器核心设施中常见的常规显微镜。本方法采用大多数研究实验室普遍掌握的技术，获得可用于三维重建的图像。该方案有助于研究锥虫科生物中的纳米级结构，能够对细胞群体进行检测，并以高分辨率对目标细胞的整个体积进行成像。该方法特别适用于细胞周期和分化过程中短暂存在阶段的特定类型细胞。为了获得更高的分辨率，我们将结合扩张显微技术（ExM）与超分辨率显微技术，以实现低于20纳米的分辨率。首先，从添加了10% FCS的LIT培养基中对数期培养物制备克氏锥虫上鞭毛体悬液。将悬液在室温下以5,000 G离心10分钟。用PBS洗涤沉淀物两次，然后重悬于200微升PBS中。将悬液接种于经多聚-L-赖氨酸（Poly-D-Lysine）包被的圆形12毫米盖玻片上，室温孵育15至20分钟，随后进行防止交联处理。收集感染上鞭毛体（trypomastigotes）后第四天的Vero细胞单层培养物的上清液。使用Neubauer细胞计数板测定上鞭毛体的浓度。将细胞悬液在室温下以 7,000 G 离心 10 分钟。用 PBS 洗涤并重悬细胞后，将细胞悬液转移至多聚赖氨酸包被的盖玻片上，在室温下孵育 10 至 15 分钟，然后进行交联抑制。为了从感染的 Vero 细胞中获得无鞭毛体，需在 24 孔组织培养板底部放置一片无菌的 12 毫米圆形盖玻片。接下来，将Vero细胞悬浮于添加了2% FCS的DMEM培养基中，每孔接种500 µL细胞悬液。将培养板孵育过夜，以确保细胞贴壁。随后，用500 µL无菌PBS洗涤细胞两次。将克氏锥虫上鞭毛体加入细胞中，并如前所述孵育六小时。首先，向24孔板的每孔中加入0.5毫升交联抑制溶液。然后，将带有贴壁寄生虫的12毫米多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片浸入溶液中。向空孔中加入水以减少蒸发，用封板膜密封后孵育。为使样品凝胶化，首先在培养皿中组装一个湿室：将封板膜覆盖在滤纸上，然后用水润湿滤纸，并在零下20摄氏度孵育20分钟以使其冷却。将冷却的湿盒置于冰上。接下来，使用一支3毫升的巴斯德吸管，从24孔板的孔中吸除交联阻止溶液。然后，用镊子取出盖玻片，将其放置在滤纸上，使寄生虫面朝上。取90 µL单体溶液于离心管中，再分别加入5 µL解冻的TEMED和5 µL APS。涡旋混合2至3秒。将35 µL该混合液滴加到每张盖玻片的封片膜上，立即用镊子将盖玻片盖在液滴上，使寄生虫面朝下。将湿盒先置于冰上孵育5分钟，然后在37摄氏度下孵育1小时。首先，用移液器将2毫升变性液加入六孔板的每个孔中。将含有克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的凝胶化盖玻片转移至变性液中，并在轻柔振荡条件下孵育。为促进凝胶脱离，使用金属刮勺将凝胶小心转移至含有1毫升变性溶液的1.5毫升微量离心管中。将管盖拧紧后，于加热块上孵育。使用 P1000 移液器从微量离心管中吸取变性溶液。用金属刮勺将凝胶转移至含有 10 毫升超纯水的培养皿中，静置 30 分钟。使用 3 毫升一次性巴斯德移液器更换培养皿中的超纯水，使凝胶在室温下浸泡过夜。第二天，使用卡尺测量凝胶的直径以计算膨胀倍数。样品呈平面状半透明凝胶，在水中膨胀了4至4.5倍。开始荧光标记前，先用PBS洗涤含有寄生虫的膨胀凝胶圆片。使用剃刀将圆片中心切割成 10 × 10 毫米的方块。随后，将每个方块转移至 12 孔板中，并在含 2% PBS 和 BSA 的稀释一抗溶液 500 µL 中振荡孵育。接着，将凝胶方块置于含有 2 mL PBS 缓冲液（含 0.1% 吐温 20）的 6 孔板中，振荡孵育 10 分钟。将凝胶转移至12孔板后，加入500微升含DAPI及终浓度为10微克/毫升的NHS酯偶联所需荧光染料的PBS缓冲液。在37摄氏度下轻柔振荡孵育2.5小时。随后如前所述，用含聚山梨酯20的PBS缓冲液洗涤凝胶三次，再将凝胶转移至含有超纯水的培养皿中，孵育30分钟。将一块10 × 10 毫米的膨胀凝胶置于35 毫米的底部培养皿上。在10倍或20倍放大倍数下检查寄生虫的方向。使用63倍油镜物镜（数值孔径为1.4）在共聚焦显微镜下对样品进行成像。获取Z轴层扫图像（Z-stacks），设定每个Z轴步进的宽度以及通过实验确定的每像素曝光时间，然后根据需要使用扫描缩放功能调整有效放大倍数，以获取信号强度并优化采集时间。使用图像处理软件打开Z轴层扫图像，并针对每个通道选择“Z轴投影分组”（group Z project）选项对层扫图像进行合并，随后选择最大强度投影（maximum intensity projection）。使用“合并通道”工具合并图像。在处理软件中，使用“比例尺”工具为每个通道选择颜色并添加比例尺。初次扩增实现了70纳米的有效分辨率，而二次扩增的扩增倍数约为4.5倍。使用细胞骨架标记物对克氏锥虫的三个体外生命周期阶段进行染色，显示了该蛋白在微管皮层和鞭毛轴丝中的定位。经DAPI染色后，染色质凝聚状态可被清晰区分。在上鞭毛体中，α-微管蛋白标记物的免疫定位与全蛋白质组标记重叠，表明抗α-微管蛋白抗体与FITC染色的基体已发生分裂。全蛋白质组标记有助于鉴定寄生虫在所有生命周期阶段的不同结构。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

克氏锥虫体外生命周期三个阶段的超微结构扩展显微镜

在本方案中，使用荧光标记的 T. cruzi 被注入透明的斑马鱼幼鱼体内，并观察了寄生虫的运动性 体内...

建立幼体斑马鱼作为研究动物模型 克氏锥虫 运动性 在体 内

的 克氏锥虫 恰加斯病的病原体可引起长期无症状感染，随后突然发展为临床上可识别的病理状态。以下研究方案描述了一项短期的基于家庭的流行病学研究，旨在揭示 T. cruzi...

雄性和雌性美洲锥虫向未感染配偶的性传播

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统在克氏锥虫（Trypanosoma...

使用 CRISPR/Cas9 系统将基因敲除直接引入克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的无鞭毛体阶段

我们描述了一种高通量比色法，用于检测引起恰加斯病的病原体——克氏锥虫（Trypanosoma...

体外药物筛选靶向表达β-半乳糖苷酶的克氏锥虫全生命周期阶段

本实验方案描述了光片荧光显微镜结合自动化软件辅助的方法，用于在完整且已透明化的器官和组织中可视化并精确定量增殖态与休眠态的Trypanosoma...

完整透明器官中克氏锥虫感染细胞、休眠型无鞭毛体及T细胞的定量三维成像

本方案详细描述了在Trypanosoma...

揭示用于药物疗效研究的恰加斯病小鼠模型体内生物发光成像

MamA 是一种独特的与磁小体相关的蛋白质，已被证明参与磁小体的活化过程。本文介绍了从M. magneticum AMB-1中纯化 MamA...

磁小体相关蛋白 MamAΔ41 的纯化：来自 M. magneticum 菌株 AMB-1

本文介绍了一种用于观察线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans早期胚胎发育的延时显微成像

造血干细胞与祖细胞（HSPCs）与骨髓微环境之间相互作用的性质尚不明确。通过定制的硬件改装和多步骤采集方案，可结合双光子显微镜与共聚焦显微镜进行成像 离体...

体内 成年小鼠颅骨骨髓中造血干细胞与祖细胞的四维追踪

本文描述了一种简便且低成本的冷冻固定方法，用于通过透射电子显微镜观察悬浮细胞。...

冷冻蚀刻：用于透射电子显微镜下悬浮细胞超微结构与免疫定位研究的工具

了解超微结构扩展显微镜技术用于克氏锥虫体外生命周期三个阶段的高分辨率成像。该方法兼容常规显微镜，可实现纳米级细胞结构的三维重建，为查加斯病病原体研究提供新工具。

体外生命周期三个阶段的克氏锥虫超微结构膨胀显微技术

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