体外生命周期三个阶段的克氏锥虫超微结构膨胀显微技术

本方案详细描述了针对引起恰加斯病的病原体——克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）体外生命周期中三个阶段的超微结构膨胀显微镜技术。该方案为当前的超分辨率成像和电子显微镜技术提供了一种替代方法，其优势在于可兼容大多数生物学实验室及仪器核心设施中常见的常规显微镜。本方法采用大多数研究实验室普遍掌握的技术，获得可用于三维重建的图像。

该方案有助于研究锥虫科生物中的纳米级结构，能够对细胞群体进行检测，并以高分辨率对目标细胞的整个体积进行成像。该方法特别适用于细胞周期和分化过程中短暂存在阶段的特定类型细胞。为了获得更高的分辨率，我们将结合扩张显微技术（ExM）与超分辨率显微技术，以实现低于20纳米的分辨率。

首先，从添加了10% FCS的LIT培养基中对数期培养物制备克氏锥虫上鞭毛体悬液。将悬液在室温下以5,000 G离心10分钟。用PBS洗涤沉淀物两次，然后重悬于200微升PBS中。

将悬液接种于经多聚-L-赖氨酸（Poly-D-Lysine）包被的圆形12毫米盖玻片上，室温孵育15至20分钟，随后进行防止交联处理。收集感染上鞭毛体（trypomastigotes）后第四天的Vero细胞单层培养物的上清液。使用Neubauer细胞计数板测定上鞭毛体的浓度。

将细胞悬液在室温下以 7,000 G 离心 10 分钟。用 PBS 洗涤并重悬细胞后，将细胞悬液转移至多聚赖氨酸包被的盖玻片上，在室温下孵育 10 至 15 分钟，然后进行交联抑制。为了从感染的 Vero 细胞中获得无鞭毛体，需在 24 孔组织培养板底部放置一片无菌的 12 毫米圆形盖玻片。

接下来，将Vero细胞悬浮于添加了2% FCS的DMEM培养基中，每孔接种500 µL细胞悬液。将培养板孵育过夜，以确保细胞贴壁。随后，用500 µL无菌PBS洗涤细胞两次。

将克氏锥虫上鞭毛体加入细胞中，并如前所述孵育六小时。首先，向24孔板的每孔中加入0.5毫升交联抑制溶液。然后，将带有贴壁寄生虫的12毫米多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片浸入溶液中。

向空孔中加入水以减少蒸发，用封板膜密封后孵育。为使样品凝胶化，首先在培养皿中组装一个湿室：将封板膜覆盖在滤纸上，然后用水润湿滤纸，并在零下20摄氏度孵育20分钟以使其冷却。

将冷却的湿盒置于冰上。接下来，使用一支3毫升的巴斯德吸管，从24孔板的孔中吸除交联阻止溶液。然后，用镊子取出盖玻片，将其放置在滤纸上，使寄生虫面朝上。

取90 µL单体溶液于离心管中，再分别加入5 µL解冻的TEMED和5 µL APS。涡旋混合2至3秒。将35 µL该混合液滴加到每张盖玻片的封片膜上，立即用镊子将盖玻片盖在液滴上，使寄生虫面朝下。

将湿盒先置于冰上孵育5分钟，然后在37摄氏度下孵育1小时。首先，用移液器将2毫升变性液加入六孔板的每个孔中。将含有克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的凝胶化盖玻片转移至变性液中，并在轻柔振荡条件下孵育。

为促进凝胶脱离，使用金属刮勺将凝胶小心转移至含有1毫升变性溶液的1.5毫升微量离心管中。将管盖拧紧后，于加热块上孵育。

使用 P1000 移液器从微量离心管中吸取变性溶液。用金属刮勺将凝胶转移至含有 10 毫升超纯水的培养皿中，静置 30 分钟。使用 3 毫升一次性巴斯德移液器更换培养皿中的超纯水，使凝胶在室温下浸泡过夜。

第二天，使用卡尺测量凝胶的直径以计算膨胀倍数。样品呈平面状半透明凝胶，在水中膨胀了4至4.5倍。开始荧光标记前，先用PBS洗涤含有寄生虫的膨胀凝胶圆片。

使用剃刀将圆片中心切割成 10 × 10 毫米的方块。随后，将每个方块转移至 12 孔板中，并在含 2% PBS 和 BSA 的稀释一抗溶液 500 µL 中振荡孵育。接着，将凝胶方块置于含有 2 mL PBS 缓冲液（含 0.1% 吐温 20）的 6 孔板中，振荡孵育 10 分钟。

将凝胶转移至12孔板后，加入500微升含DAPI及终浓度为10微克/毫升的NHS酯偶联所需荧光染料的PBS缓冲液。在37摄氏度下轻柔振荡孵育2.5小时。随后如前所述，用含聚山梨酯20的PBS缓冲液洗涤凝胶三次，再将凝胶转移至含有超纯水的培养皿中，孵育30分钟。

将一块10 × 10 毫米的膨胀凝胶置于35 毫米的底部培养皿上。在10倍或20倍放大倍数下检查寄生虫的方向。使用63倍油镜物镜（数值孔径为1.4）在共聚焦显微镜下对样品进行成像。

获取Z轴层扫图像（Z-stacks），设定每个Z轴步进的宽度以及通过实验确定的每像素曝光时间，然后根据需要使用扫描缩放功能调整有效放大倍数，以获取信号强度并优化采集时间。使用图像处理软件打开Z轴层扫图像，并针对每个通道选择“Z轴投影分组”（group Z project）选项对层扫图像进行合并，随后选择最大强度投影（maximum intensity projection）。

使用“合并通道”工具合并图像。在处理软件中，使用“比例尺”工具为每个通道选择颜色并添加比例尺。初次扩增实现了70纳米的有效分辨率，而二次扩增的扩增倍数约为4.5倍。

使用细胞骨架标记物对克氏锥虫的三个体外生命周期阶段进行染色，显示了该蛋白在微管皮层和鞭毛轴丝中的定位。经DAPI染色后，染色质凝聚状态可被清晰区分。在上鞭毛体中，α-微管蛋白标记物的免疫定位与全蛋白质组标记重叠，表明抗α-微管蛋白抗体与FITC染色的基体已发生分裂。

全蛋白质组标记有助于鉴定寄生虫在所有生命周期阶段的不同结构。