Name: 根癌农杆菌介导的绿色微藻、寻常小球藻的基因工程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 了解根癌农杆菌介导转化技术，用于绿色微藻寻常小球藻的核基因组基因整合与稳定转化株制备。该方法可推进微藻生物技术领域的基因功能研究与遗传工程应用。

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作者谨此感谢荷兰莱顿大学莱顿生物研究所的 Paul Hooykaas 教授慷慨提供了 pCAMBIA1302 载体和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL1 菌株。作者还感谢 Eva Colic 在培养荧光转化子过程中提供的帮助。本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会以及 Mitacs Accelerate 项目资助。

除非另有说明，所有培养基和溶液在使用前必须进行高压灭菌。所有离心管、移液器吸头等物品在使用前应为无菌或经过高压灭菌。为便于参考，本方案中使用的培养基配方列于表1中。
1. 准备 A. tumefaciens 电转感受态细胞
<ol>
	<li>接种 农杆菌 （AGL-1）转入含有利福平（20 mg/L）的25 mL无菌LB液体培养基摇瓶中-1从冻存的甘油菌种中接种，并在28-30 °C、150 rpm条件下过夜培养。 
	&#8203;注意： 农杆菌 菌株 AGL-1 是（参见 材料表对利福平、氨苄青霉素、氯霉素和链霉素具有抗性，可从多家供应商处获得。</li>
	<li>次日，将过夜培养物0.5 µL加入50 mL经高压灭菌的超纯水中，稀释100,000倍，取10 µL稀释后的培养物涂布于LB平板，于28–30 °C培养1–3天。</li>
	<li>挑取单菌落，于含利福平的LB培养基中，在28–30 °C条件下培养20 mL过夜培养物。</li>
	<li>第二天，将9 mL过夜培养物接种至装有500 mL LB培养基（不含抗生素）的摇瓶中，在28–30 °C下振荡培养，直至OD600 达到 0.5。</li>
	<li>将培养物均匀分装至十个50 mL离心管中，冰上预冷30分钟。将离心机预冷至4 °C。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 4000 x g 离心试管 g 15分钟。随后，用移液器尽可能吸除上清液，并将每管中的沉淀重悬于50 mL预冷的冰水中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 4000 x g 离心细胞 g 孵育15分钟。移除上清液，将沉淀物重悬于每管25 mL冰预冷的水中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 4000 x g 离心细胞 g 孵育15分钟。弃去上清液，每管中用1 mL预冷的10%（w/v）甘油重悬沉淀。</li>
	<li>将所有离心管中的样品合并至一个50 mL离心管中，在4 °C、4000 x g条件下离心细胞 g 15分钟。弃上清，将沉淀重悬于400 µL预冷的10% (w/v)甘油溶液中。细胞浓度应约为1-3 x 1010 cells/mL</li>
	<li>将细胞分装至无菌预冷的微量离心管中，每管50 µL。用液氮速冻后，于-80 °C冰箱中保存。</li>
</ol>
2. 电穿孔 A. tumefaciens
<ol>
	<li>将50 µL AGL-1 A. tumefaciens 感受态细胞加入预冷的0.1 mm电转杯中，再加入2 µL pCAMBIA1302或类似质粒（浓度15 ng/µL）（参见材料表）。</li>
	<li>使用电穿孔仪在2400 V条件下进行电穿孔（200 Ω，电容延长器250 µFD，电容25 µFD，指数衰减，参见材料表）。采用指数衰减模式时，时间常数应&#62;4.5 ms，以确保电穿孔成功。</li>
	<li>立即向电转杯中加入1 mL LB培养基，轻轻吹打混匀。将重悬的1 mL细胞转移至1.5 mL离心管中，在28–30 °C条件下孵育至少1小时以恢复生长。</li>
	<li>将细胞涂布于含有适当抗生素的LB琼脂平板上（例如，pCAMBIA1302使用50 mg/L卡那霉素进行原核筛选）。</li>
	<li>在28–30 °C条件下孵育2–3天。</li>
	<li>挑取单菌落，在含相应筛选抗生素的LB培养基（pCAMBIA1302使用50 mg/L卡那霉素）中过夜培养，并用50%甘油于-80 °C冷冻保存含质粒的菌株，以备后续使用。</li>
</ol>
3. AMT 的 C. vulgaris
注意：请平行准备C. vulgaris（UTEX 395，参见材料表）和A. tumefaciens的培养物以进行共培养。C. vulgaris的培养物应比A. tumefaciens的培养物提前3天开始。本实验方案根据Kumar等人发表的方法进行了修改7。
<ol>
	<li>准备 C. vulgaris 培养物
	<ol>
		<li>C. vulgaris通常保存在斜面培养基上，或在光照条件下维持对数生长期的液体培养。从OD600 = 1.0的对数生长期培养液中取0.5 mL，涂布于Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP，见表1）琼脂平板（含1.2% w/v 琼脂A）上，在25 °C、光照（50 µE/m2s）条件下培养5天，可获得约5 × 106个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备 A. tumefaciens 培养物
	<ol>
		<li>将甘油保存的A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302菌株接种于含15 mM葡萄糖、20 mg/L&#160;利福平和50 mg/L卡那霉素（见材料表）的10 mL LB培养基中，在摇瓶中于28–30 °C、250 rpm条件下过夜培养。</li>
		<li>取1 mL过夜培养物接种至50 mL含15 mM葡萄糖、20 mg/L&#160;利福平和50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，在28–30 °C、250 rpm条件下培养至OD600达到1.0。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共培养C. vulgaris与A. tumefaciens
	<ol>
		<li>为共培养准备A. tumefaciens培养物：将培养好的菌液转移至50 mL离心管中，在室温下以4000 × g离心30分钟。用移液器吸除上清液，并用诱导培养基洗涤细胞两次。 
		注：所用诱导培养基为pH调至5.5的TAP培养基，添加F/2培养基的微量元素和维生素，并含200 µM乙酰丁香酮（AS，见材料表）。将细胞重悬于诱导培养基中，使OD600 = 0.5。</li>
		<li>为共培养准备C. vulgaris培养物：向含有约5 × 106个细胞的C. vulgaris平板中加入25 mL诱导培养基，转移至50 mL离心管中。在室温下以4000 × g离心15分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将藻类细胞沉淀与200 µL细菌悬液（OD600：0.5）混合，在21–25 °C、150 rpm条件下于旋转摇床上共孵育1小时。</li>
		<li>将混合培养物（200 µL）涂布于添加了15 mM葡萄糖的诱导培养基平板上，在21–25 °C避光条件下培养3天。</li>
		<li>3天后，使用含400 mg/L头孢噻肟或20 mg/L四环素（见材料表）的10 mL TAP培养基收集微藻，并在21–25 °C避光条件下继续培养2天，以清除培养物中的A. tumefaciens。</li>
		<li>取500 µL培养液涂布于选择性培养基平板上，例如含20–70 mg/L潮霉素B（使用pCAMBIA1302时）以及400 mg/L-1头孢噻肟或20 mg/L四环素的TAP培养基。先在21–25 °C避光培养2天，再转移至光照培养箱中。 
		注：抗性菌落将在光照后5–7天出现。</li>
		<li>从转化平板上挑取单菌落，在含400 mg/L头孢噻肟或20 mg/L四环素及20–70 mg/L潮霉素B的TAP琼脂平板上重新划线培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过菌落PCR（cPCR）验证C. vulgaris转化子中的基因整合
<ol>
	<li>使用植物基因组DNA提取试剂盒（参见材料表），从经过至少两次单克隆继代培养的C. vulgaris转化子中提取基因组DNA。以此DNA为模板进行PCR，设计针对T-DNA中mgfp5区域的引物（mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3'，M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3'）。
	<ol>
		<li>使用Q5高保真DNA聚合酶预混试剂盒（参见材料表），进行聚合酶链式反应（PCR），以验证外源基因的整合。 
		注：本研究采用以下反应条件：98 °C 预变性3 min；35个循环（98 °C 变性10 s，57 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min）；72 °C 最终延伸5 min。以pCAMBIA1302质粒为阳性对照，野生型C. vulgaris基因组DNA为阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确认样品中无因A. tumefaciens残留污染而存在的pCAMBIA1302质粒，进行菌落PCR。取少量转化子细胞加入10 µL无菌水中，98 °C 煮沸15 min，以此作为PCR模板。
	<ol>
		<li>设计针对pCAMBIA1302质粒T-DNA区域外一段序列的引物（B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3'，B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3'）。 
		注：本研究采用以下反应条件：94 °C 预变性3 min；30个循环（94 °C 变性30 s，48 °C 退火30 s，68 °C 延伸5 min）；68 °C 最终延伸7 min。以煮沸处理的A. tumefaciens AGL-1（pCAMBIA1302）菌落为阳性对照，煮沸处理的野生型C. vulgaris菌落为阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确认样品中无A. tumefaciens污染，进行菌落PCR。取少量转化子细胞加入10 µL无菌水中，98 °C 煮沸15 min，以此作为PCR模板。
	<ol>
		<li>设计针对AGL-1毒力质粒上virE2基因的引物（virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3'，virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3'）。 
		注：本研究采用以下反应条件：94 °C 预变性3 min；30个循环（94 °C 变性30 s，53 °C 退火30 s，68 °C 延伸3 min）；68 °C 最终延伸7 min。以煮沸处理的A. tumefaciens AGL-1（pCAMBIA1302）菌落为阳性对照，煮沸处理的野生型C. vulgaris菌落为阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将PCR产物与DNA分子量标记物（1 Kbp DNA ladder，参见材料表）一同进行琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增片段的大小16。</li>
</ol>
5. 测定转化子的荧光
<ol>
	<li>将每个转化子从对数期维持培养物或TAP琼脂斜面接种至50 mL TAP培养基中，培养基中添加200 mg/L-1头孢噻肟和25 mg/L-1潮霉素B，使起始OD600 = 0.1。另设一培养组，接种野生型C. vulgaris，仅添加200 mg/L-1头孢噻肟作为阴性对照。于25 °C、150 rpm条件下培养，并提供150 µmol/m2s的光合有效辐射光照（见材料表）。</li>
	<li>每隔24小时，取300 µL样品，使用96孔板读数仪或紫外/可见分光光度计与荧光计（见材料表）测定吸光度和荧光（激发波长488 nm，发射波长526 nm）。采用黑色板配透明底板以实现同步测量。</li>
</ol>
6. 粗蛋白提取、蛋白纯化及SDS-PAGE电泳
<ol>
	<li>将转化子（#50）从对数生长期的维持培养物接种至300 mL TAP培养基中，该培养基添加200 mg/L-1 头孢噻肟和25 mg/L-1 潮霉素B，使初始OD680 = 0.1。另设一培养物，接种野生型C. vulgaris，仅添加200 mg/L-1 头孢噻肟作为阴性对照。于25 °C、150 rpm转速下培养，光照强度为150 µmol/m2s的光合有效辐射光。</li>
	<li>使用5 mL裂解缓冲液（见表1）提取转化子（#50）和野生型菌株的粗蛋白样品，随后进行4分钟超声处理。</li>
	<li>通过5 mL聚丙烯柱（见材料表）利用Ni-NTA树脂纯化粗蛋白样品。</li>
	<li>将15 mL纯化后的蛋白样品冻干，并重悬于1 mL裂解缓冲液中，用于SDS-PAGE分析17。</li>
</ol>

Stable Gene Integration in Chlorella vulgaris Using Agrobacterium tumefaciens

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</ol>

未声明任何利益冲突。

转化效率与多个不同参数相关。A. tumefaciens 菌株的选择对农杆菌介导的转化（AMT）至关重要。AGL-1 是已发现的侵染能力最强的菌株之一，因此在植物 AMT 中被常规使用。在诱导培养基中添加葡萄糖（15–20 mM）对提高 AMT 效率也非常重要。考虑到C. vulgaris可在光能自养和异养条件下生长，微藻培养基中通常省略葡萄糖或其他碳源以防止污染。例如，Bold's Basal Medium（BBM）是C. vulgaris光能自养培养最常用的培养基19。然而，由于缺乏A. tumefaciens偏好的有机碳源和铵态氮源（BBM 使用硝态氮），BBM 无法支持该菌的生长20。因此，本研究采用 TAP 培养基，因其含有乙酸作为C. vulgaris的碳源、葡萄糖作为A. tumefaciens的碳源，以及两种物种均可利用的铵态氮源。TAP 琼脂平板还能显著加快C. vulgaris的生长速度，从而缩短 ...

Agrobacterium tumefaciens 是一种革兰氏阴性土壤细菌，具有独特的跨界基因转移能力，因此被誉为&#34;天然的遗传工程师&#34;1。该细菌可通过IV型分泌系统，将肿瘤诱导型质粒（Ti质粒）中的DNA（T-DNA）转移至宿主细胞，导致T-DNA整合到宿主基因组中并实现表达1,2,3,4。在自然条件下，该过程会导致植物产生肿瘤，即通常所说的冠瘿病。然而，在实验室条件下，Agrobacterium 还可将T-DNA转移至多种其他生物体中，包括酵母、真菌、藻类、海胆胚胎，甚至人类细胞5,6,7,8。
利用这一天然系统， Agrobacterium tumefaciens介导的转化（AMT）通过修饰Ti质粒上的T-DNA区域，实现目的基因在宿主细胞核基因组中的随机整合。为此，常用的AMT植物表达载体是pCAMBIA1302。9研究人员可以采用简单的克隆工作流程 E. coli 在将目标载体转入之前 A. tumefaciens 用于后续转移到目标宿主。
绿色微藻是真核生物，与陆地植物有许多相似之处，但其遗传改造极为困难。然而，遗传转化在微藻的基础研究和生物技术研究中均发挥着关键作用。在多种微藻物种中，尤其是 莱茵衣藻，遗传转化 通过 AMT 已成功导入了多种转基因，包括人白细胞介素-2（hIL-2）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2的受体结合域（SARS-CoV-2 RBD）以及两种抗菌肽（AMPs）10,11,12,13其中 普通小球藻一种对培养条件要求较低且生长迅速的绿藻物种，在碳水化合物、蛋白质、营养补充剂、色素及其他高价值化合物的可持续生产方面具有重要意义14然而，目前缺乏用于创制转基因品系的可靠工具 C. vulgaris 阻碍其商业化进程。由于利用AMT的已发表研究工作十分有限， C. vulgaris15，鉴于植物与微藻培养之间存在显著差异，优化AMT方案变得至关重要。
在本研究中，研究人员将绿色荧光蛋白（mGFP5）插入花椰菜花叶病毒（CamV）35S启动子的下游，并添加了组氨酸标签，用作蛋白表达的报告基因。通过潮霉素B筛选转化子，继代培养二十代以上后，转化仍保持稳定。本研究所使用的pCAMBIA1302质粒可轻松改造以容纳任何目的基因。此外，该方法和材料可根据其他具有活性CamV35S启动子的绿藻物种进行调整，因为该启动子可用于潮霉素筛选。

<table><tbody><tr><td>1 Kb Plus DNA 标准品</td><td>FroggaBio</td><td>DM015</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丁香酮</td><td>菲舍尔科技</td><td>D26665G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;</td><td>Gold Biotechnologies</td><td>菌株：AGL-1；Paul Hooykaas 教授惠赠</td><td>基因型：C58 RecA (Rif&lt;sup&gt;R&lt;/sup&gt;/Carb&lt;sup&gt;R&lt;/sup&gt;) pTiBo542DT-DNA</td></tr><tr><td>生物素</td><td>Enzo 生命科学</td><td>89151-400</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>VWR</td><td>BDH9224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>头孢噻肟</td><td>AK Scientific</td><td>J90010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlorella vulgaris&lt;/em&gt;</td><td>德克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养中心</td><td>菌株：UTEX 395</td><td>野生型菌株</td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>C8661-25G</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>EMD Millipore</td><td>CX2185-1</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>VWR</td><td>BDH9234-500G</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell 电穿孔仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1652662</td><td>配备 PC 模块的主机单元。</td></tr><tr><td>GeneJET 植物基因组纯化试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0791</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>VWR</td><td>CABDH3093-2.2P</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>BioBasic</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素 B</td><td>菲舍尔科技</td><td>AAJ6068103</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Gold Biotechnologies</td><td>K-250-25</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>JT Baker</td><td>BAKR2540-01</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>BDH7971-1</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>JT Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&amp;middot;&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>JT Baker</td><td>BAKR3764-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>BDH7257-7</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>默克生命科学</td><td>CA80058-650</td><td></td></tr><tr><td>NaNO&lt;sub&gt;3&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>BDH4574-500G</td><td></td></tr><tr><td>NEBExpress Ni 树脂</td><td>New England BioLabs</td><td>NEB #S1427</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>VWR</td><td>BDH9208-500G</td><td></td></tr><tr><td>pCAMBIA1302</td><td>莱顿大学</td><td>Paul Hooykaas 教授惠赠</td><td>pBR322，Kan&lt;sup&gt;R&lt;/sup&gt;，pVS1，T-DNA（CaMV 35S/Hyg&lt;sup&gt;R&lt;/sup&gt;/CaMV polyA，CaMV 35S 启动子/mgpf5-6xhis/NOS 终止子）</td></tr><tr><td>聚丙烯柱（5 mL）</td><td>QIAGEN</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 未染色蛋白标准品，Strep 标签重组蛋白，1 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>利福平</td><td>默克生命科学</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>SunBlaster LED 条形灯 48 英寸&amp;nbsp;</td><td>SunBlaster</td><td>210000000906</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 4 微孔板紫外/可见光分光光度计&amp;nbsp;</td><td>BioTEK</td><td>S4MLFPTA</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>CAAAJ61714-14</td><td></td></tr><tr><td>TGX Stain-Free FastCast 丙烯酰胺试剂盒，12%</td><td>Bio-Rad</td><td>1610185</td><td></td></tr><tr><td>硫胺素</td><td>TCI America</td><td>T0181-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>菲舍尔科技</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BioBasic</td><td>TG217(G211)</td><td></td></tr><tr><td>维生素 B12（氰钴胺）</td><td>Enzo 生命科学</td><td>89151-436</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>JT Baker</td><td>4382-01</td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium tumefaciens介导的绿色微藻chlorella vulgaris遗传工程

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

根癌农杆菌介导的转化（AMT）是操控植物基因组的一种常用工具。然而 A. tumefaciens 表现出向多种物种进行基因转移的能力。许多微藻物种缺乏将目的基因稳定整合到其核基因组的成熟方法。为了充分利用微藻生物技术的潜在优势，简单高效的基因组操作工具至关重要。本文提出了一种针对工业微藻物种优化的AMT操作流程 Chlorella vulgaris，利用报告基因绿色荧光蛋白（mGFP5）和潮霉素B抗性标记。通过在含有潮霉素B和头孢噻肟的Tris-乙酸-磷酸盐（TAP）培养基上平板培养筛选突变体。mGFP5的表达量进行定量分析 通过 经过十代以上的继代培养后仍保持荧光，表明T-DNA盒已稳定转化。该方案可可靠地获得多个转基因植株 C. vulgaris 两周内形成菌落，使用市售的pCAMBIA1302植物表达载体。

为了展示使用上述方法实现成功的转化，C. vulgaris 分别与含有 pCAMBIA1302 质粒的 AGL-1 共培养，或不含有质粒的 AGL-1（野生型），并接种于添加了潮霉素B和头孢噻肟的 TAP 琼脂平板上（图1A）。最左侧的平板显示能够在潮霉素B/头孢噻肟平板上生长的转化菌落，中间的平板显示野生型 AGL-1 无法在潮霉素B/头孢噻肟平板上生长。最右侧的平板显示在未使用选择压力（仅含头孢噻肟）的情况下，C. vulgaris 转化子和野生型均能生长。将单菌落划线接种至含潮霉素B和头孢噻肟的 TAP 琼脂平板上（图1B）。从最右侧平板中挑取逃逸菌落（图1B）接种至含潮霉素B和头孢噻肟的 TAP 液体培养基中（图1C）。由于 T-DNA 随机整合后表达水平存在差异，最初在潮霉素B浓度梯度为 25–70 mg/L 的平板上筛选转化子。从每个平板中选取一个菌落，...

本方案概述了以下方法的使用 根癌农杆菌介导的转化（AMT），用于将目的基因整合到绿色微藻的核基因组中 普通小球藻，从而产生稳定的转化子。

Agrobacterium tumefaciens介导的绿色微藻Chlorella vulgaris遗传工程

农杆菌介导的转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, AMT）是一种广泛用于植物基因组操作的工具。然而，农杆菌（A. tumefaciens）表现出……

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了解根癌农杆菌介导转化技术，用于绿色微藻寻常小球藻的核基因组基因整合与稳定转化株制备。该方法可推进微藻生物技术领域的基因功能研究与遗传工程应用。

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