Name: 脊髓切片 的离体 制备，用于脊髓刺激过程中运动神经元的全细胞膜片钳记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解利用膜片钳技术对大鼠脊髓运动神经元进行全细胞记录的方法，以研究脊髓刺激过程中的电生理反应。该方案有助于深入理解脊髓运动调控机制及神经康复原理。

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本研究由&#160;中国国家自然科学基金青年项目（52207254 和 82301657）以及&#160;中国博士后科学基金（2022M711833）资助。&#160;

所有动物实验均已获得机构动物护理和使用委员会的批准&#160;，并且研究均依照相关的动物福利法规进行。
1. 动物准备
<ol>
	<li>动物
	<ol>
		<li>饲养信息：将雄性Sprague-Dawley大鼠（出生后10-14天，P10-P14）饲养于特定病原体阴性环境中。 
		注意：实验环境温度保持在 20 °C ± 2 °C，湿度：50%–60%，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。动物可自由获取食物和水。</li>
		<li>逆行标记运动神经元：在处死前2天，将Fluoro-Gold（FG）注入双侧胫前肌和腓肠肌（2%溶于无菌生理盐水，每块肌肉50 µL），以逆行标记运动神经元。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶液
	<ol>
		<li>配制切割液：混合 120 mM 氯化胆碱、2.6 mM KCl、26 mM NaHCO₃3，1.25 mM NaH2PO4，0.5 mM CaCl2，7 mM MgCl2，1.3 mM 抗坏血酸，15 mM 葡萄糖。用 95% O₂2 和5% CO₂2 （用KOH调节pH至7.4）在解剖和切片前孵育30分钟。用碎冰冷却溶液。</li>
		<li>配制人工脑脊液（ACSF）：混合126 mM NaCl、3 mM KCl、1.2 mM NaH2PO4；1.3 mM MgCl2，2.4 mM CaCl2，26 mM NaHCO₃3，以及 10 mM 葡萄糖。用 95% O₂2 和 5% CO2 孵育前孵育30分钟。</li>
		<li>配制细胞内液：混合126 mM K-Gluconate、2 mM KCl、2 mM MgCl₂、10 mM HEPES、0.5 mM EGTA，用KOH调节pH至7.2，用去离子水配制。2，0.2 mM EGTA，10 mM HEPES，4 mM Na2ATP，0.4 mM Na2GTP、10 mM K-磷酸肌酸和0.5% Neurobiotin（pH 7.25，305 mOsm/Kg）。用碎冰冷却该溶液。</li>
		<li>制备低熔点琼脂糖凝胶：将4 g琼脂糖溶解于100 mL切割液中，使用磁力搅拌子充分溶解。包埋前30 min，将低熔点琼脂糖在微波炉中高火加热1 min，随后转移至39 °C水浴中保温，保持液态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仪器准备
	<ol>
		<li>将碎冰放在灌流托盘上（补充图 1A) 在灌注前10分钟。放置解剖托盘（补充图1B）和切割托盘（补充图1C在-80°C条件下预先将含水带样品过夜保存。</li>
		<li>将带有尼龙网的孵育室提前置于45 °C烘箱中过夜。</li>
		<li>使用低熔点琼脂糖预制一个35°斜面和一个2 mm厚的平台（补充图1D凝胶凝固后，将其置于35 mm培养皿中央，以在后续操作中支撑脊髓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心脏内灌注
	<ol>
		<li>通过腹腔注射2.5%三溴乙醇（160 µL/10 g）对大鼠进行麻醉。通过检测其对外界刺激（如轻捏脚趾）无反应，确认大鼠已完全麻醉。</li>
		<li>确认麻醉适当后，将大鼠仰卧放置，并固定于装有硅胶的培养皿中。</li>
		<li>在剑突后方做一长约5 mm的纵向皮肤切口，随后充分扩张皮下间隙。沿腹侧正中线做一长约2 cm的纵向皮肤切口，从上述切口起始，至胸部顶端结束，以完全暴露胸壁外侧。</li>
		<li>使用有齿镊子提起剑突 （补充图2A）），然后使用精细剪刀剪开膈肌。沿剑突两侧剪断胸骨以打开胸腔并暴露心脏（补充图 2B). 
		注意：需小心保留双侧胸廓内血管，否则可能导致大出血。</li>
		<li>使用无齿镊子提起左心室。沿左心室的长轴方向，将22 G针头插入左心室心尖部。补充图2C同时观察灌注管中是否有节律性的血液搏动，否则可能针头已刺入右心室，导致灌注效果不佳。 
		注意：不应使用有齿镊子，否则可能导致镊子夹持部位额外出血。</li>
		<li>使用精细剪刀剪开右心房（补充图2C），然后在1分钟内以约2 mL/s的速度手动注入100 mL冰冷灌注液。 
		注意：当大鼠肝脏和足掌变苍白，且右心房无血液流出时，表明灌注效果良好。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脊髓解剖（图1)
	<ol>
		<li>将大鼠置于俯卧位，分别于髂前上棘处（约腰椎L4水平）和胸椎弯曲转折点处（约胸椎T6水平）切断脊柱，图1A然后立即将分离出的脊柱放入充氧的冰冻灌注液中，以冲洗残留的血液和脂肪组织；该步骤有助于在后续操作中保持手术视野的清洁。 
		注意：应保留椎旁肌，以便后续使用昆虫针进行脊柱固定。</li>
		<li>立即将分离的脊柱转移至解剖托盘中（图1B）腹面朝下，头端靠近操作者。向解剖托盘中加入50 mL持续充氧的冰冻切割液（图 1B).</li>
		<li>使用四根昆虫针穿过脊柱旁肌肉来固定脊柱（图1B).</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用显微剪从头端开始切断两侧的椎弓根，此操作可称为 &#34;椎板切除术&#34; (图1C）。注意不要损伤脊髓。同时，使用显微有齿镊提起已切断的椎体。</li>
		<li>椎板切除术后，不要立即分离脊髓与椎管。相反，应使用显微剪刀沿背侧中线剪开硬脊膜，以利于细胞间的营养摄取及含氧人工脑脊液（ACSF）的供应。图1D). 
		注意：切勿撕裂硬脑膜，仅允许使用显微剪刀剪开硬脑膜，否则将严重损伤神经根和脊髓实质！</li>
		<li>抬起脊髓的头端部分，然后小心地切断神经根，保留约1 mm长度（图1E）。将脊髓从椎管中分离后，使用2枚昆虫针将脊髓腹侧朝上固定图1F).</li>
		<li>使用显微剪刀沿腹侧中线剪开硬脑膜（图1F）。剪除多余的神经根，保留约1 mm。 
		注意：神经比脊髓坚韧得多。如果保留的神经根过长（&#62;1 毫米），振动切片机无法完全切断神经根，可能导致脊髓实质发生严重撕裂。</li>
		<li>使用显微剪将腰膨大部位分离成6-7 mm长度（图1G).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在低熔点琼脂糖中包埋
	<ol>
		<li>将腰膨大置于35°斜面上（图1H）背侧朝上，尾端朝下。用吸水滤纸除去组织表面多余的水分（图1H).</li>
		<li>缓慢地将熔化的琼脂糖凝胶倒入含有腰膨大的培养皿中图1I). 
		注意：倾倒速度不宜过快，否则凝胶中会产生气泡。</li>
		<li>将上述培养皿置于冰水混合物中，尽快冷却凝胶，以利于维持细胞活性。</li>
		<li>将凝胶修剪成 15 mm × 10 mm × 10 mm 的立方体，并用超级胶水将其固定在样品台盘上（图1J).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片
	<ol>
		<li>将样品载片放入预冷冻的切片托盘中，然后倒入冰浴的切片液（图1K）。持续通入95% CO2 和5% O₂2 放入切割托盘中。</li>
		<li>设定振动切片机参数：厚度：350 µm；速度：0.14–0.16&#160;mm/s，振幅：1.0&#160;毫米，振动频率：85 Hz。</li>
		<li>每只动物收获2-3个合适的脑片。每片记录1-2个健康的FG+运动神经元，每只动物共记录5-6个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育
	<ol>
		<li>使用盖片镊子夹取一片切片（图1L）并将其放入充满持续充氧人工脑脊液（ACSF）的孵育室中。将孵育室置于32 °C水浴中孵育30分钟，随后在室温（RT）继续孵育30分钟，再进行记录。 
		&#8203;注意：从麻醉到获取第一片脑片的上述操作应在20–30分钟内完成，以最大程度保持细胞活性。每片脑片中的运动神经元可维持活性约6–7小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用 SCS 进行膜片钳记录 (图 2)
<ol>
	<li>准备工作
	<ol>
		<li>以约1-2 mL/min的流速，将持续通入氧气的ACSF灌注到记录室中。通过蠕动泵的控制面板单独调节流速。</li>
		<li>将脑片放入记录室中。使用带有尼龙线的U形铂丝牢固地固定脑片位置。</li>
		<li>使用红外微分干涉差显微镜（IR-DIC）观察脑片。在4倍物镜下，确认背根长度约为1 mm。找到背根进入实质的区域，然后将视野中心移至该区域。</li>
		<li>将脉冲发生器与自制电极连接（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脊髓电刺激（SCS）配置
	<ol>
		<li>通过显微操作系统将SCS的阳极置于背侧中线附近（图2B）。</li>
		<li>通过显微操作系统将SCS的阴极置于背根进入区（DREZ）附近（图2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞定位与成像
	<ol>
		<li>使用IR-DIC配合10倍物镜粗略定位位于腹外侧运动柱的区域，该区域集中了大多数运动神经元。然后将视野中心移至该区域。</li>
		<li>切换至60倍物镜，寻找表面光滑、明亮且细胞核不可见的健康神经元（图2C、F）。</li>
		<li>略微降低红外光强度并打开荧光光源。将滤光片切换至宽波段紫外激发滤光片（图2D、G），以选择合适的荧光金阳性（FG+）运动神经元（图2E、H）。</li>
		<li>使用吸吮电极对背根施加1倍运动阈值的刺激。若在运动神经元中记录到诱发电位（补充图3），则表明背根功能完整；否则应弃用该脑片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膜片钳记录
	<ol>
		<li>用细胞内液填充微电极，并将其插入电极夹持器中。使用显微操作系统将电极缓慢下降至ACSF浴液中。电极电阻范围为5-8 MΩ。</li>
		<li>向电极施加少量正压，以吹走灰尘和细胞碎片。
		<ol>
			<li>降低电极以接近细胞。当电极尖端接触FG+神经元表面时，可在尖端水平观察到膜出现轻微凹陷。此时释放正压。</li>
			<li>然后使用注射器对电极施加轻微负压，产生轻微吸力使细胞膜贴附于玻璃电极尖端。始终注意软件界面上的总电阻，直至电阻值上升至吉欧姆级别（&#62;1 GΩ），此时形成吉欧姆封接（gigaseal）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将膜电位钳制在-70 mV，然后按下放大器软件界面上的快速电容补偿按钮。轻柔施加瞬时负压以破裂细胞膜，随后按下放大器软件界面上的慢速电容补偿按钮。此时即获得良好的全细胞记录构型。</li>
		<li>通过点击软件界面上的IC按钮切换至电流钳模式，记录静息膜电位（RMP）。</li>
		<li>开启SCS，刺激持续1-2秒，刺激幅度为1-10 mA，脉宽和频率分别固定为210 µs和40 Hz。通过逐步增加刺激强度直至首次观察到动作电位（AP），确定运动阈值。</li>
		<li>在电流钳模式下，使用接近阈下电流（rheobase）的5秒去极化电流注入，区分延迟放电型与即时放电型运动神经元10、11、12。即时放电型运动神经元：低阈下电流即可诱发立即且重复的放电，放电频率稳定；延迟放电型运动神经元：高阈下电流诱发重复放电的潜伏期较长，且放电频率逐渐加快（图3）。</li>
		<li>关闭SCS后，继续记录膜电位，以捕捉自发动作电位（AP）的发放。</li>
		<li>在SCS开启和关闭状态下，进行电压钳记录兴奋性突触后电流（EPSC）。刺激参数为1倍运动阈值、210 µs、2 Hz。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Understanding Motor Neuron Responses to Spinal Cord Stimulation

<ol><li>Rowald, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+spinal+cord+neuromodulation+rapidly+restores+trunk+and+leg+motor+functions+after+complete+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis.</a> Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).</li>
<li>Kathe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurons+that+restore+walking+after+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neurons that restore walking after paralysis.</a> Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).</li>
<li>Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+distribution+of+calcium+signals+in+squid+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals.</a> The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).</li>
<li>Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse+by+presynaptic+delayed+rectifier+potassium+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current.</a> The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).</li>
<li>Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraterminal+injection+of+synapsin+I+or+calcium%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+alters+neurotransmitter+release+at+the+squid+giant+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).</li>
<li>Formento, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+spinal+cord+stimulation+must+preserve+proprioception+to+enable+locomotion+in+humans+with+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).</li>
<li>Hari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+facilitates+spike+propagation+through+branch+points+of+sensory+axons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+of+oblique+spinal+cord+slices+for+ventral+root+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525(2016).</li>
<li>Sharples, S. A., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+persistent+and+hyperpolarization-activated+inward+currents+shapes+the+differential+activation+of+motoneuron+subtypes+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development.</a> Elife. 10, e71385(2021).</li>
<li>Bhumbra, G. S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+excitation+between+motoneurones+propagates+across+segments+and+is+purely+glutamatergic%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic.</a> PLoS Biology. 16 (3), e2003586(2018).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, 04046(2014).</li>
<li>Tahir, R. A., Pabaney, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+hypothermia+and+ischemic+stroke%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology+International%22%5BJournal%5D)">Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review.</a> Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+intractable+pain+in+patients+with+implanted+spinal+cord+stimulation+devices+during+the+COVID-19+pandemic+using+a+remote+and+wireless+programming+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 594696(2020).</li>
<li>Yao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+epidural+electrical+stimulation+in+combination+with+serotonin+agonists+improves+intraspinal+metabolism+in+spinal+cord+injury+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats.</a> Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).</li>
<li>Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+terminal+polarization+induced+by+weak+uniform+dc+electric+fields%3A+a+modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%222012+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study.</a> 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).</li>
<li>Espino, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28V%291.1+is+essential+for+proprioceptive+signaling+and+motor+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors.</a> Elife. 11, e79917(2022).</li>
<li>Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+rheostat%3A+Kv2.1+currents+maintain+or+suppress+repetitive+firing+in+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons.</a> The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+R-type+human+Ca%28v%292.3+channel+reveal+conformational+crosstalk+of+the+intracellular+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments.</a> Nature Communications. 13 (1), 7358(2022).</li>
<li>Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+multimodal+neural+transmission+suggests+that+adult+spinal+networks+maintain+an+intrinsic+state+of+readiness+to+execute+sensorimotor+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors.</a> Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).</li>
<li>Manuel, M., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intracellular+recording+of+a+lumbar+motoneuron+and+the+force+produced+by+its+motor+unit+in+the+adult+mouse+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312(2012).</li>
<li>Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomogeneous+volume+conduction+effects+affecting+needle+electromyography%3A+an+analytical+and+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Measurement%22%5BJournal%5D)">Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study.</a> Physiological Measurement. 42 (11), (2021).</li>
<li>Barra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidural+electrical+stimulation+of+the+cervical+dorsal+roots+restores+voluntary+upper+limb+control+in+paralyzed+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys.</a> Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).</li>
<li>Powell, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidural+stimulation+of+the+cervical+spinal+cord+for+post-stroke+upper-limb+paresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis.</a> Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).</li>
<li>Wenger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+neuromodulation+therapies+engaging+muscle+synergies+improve+motor+control+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury.</a> Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).</li>
<li>Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+longitudinal+lumbar+spinal+cord+preparations+to+study+sensory+and+recurrent+motor+microcircuits+of+juvenile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice.</a> Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).</li>
<li>Moraud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+the+neuromodulation+of+spinal+circuits+for+correcting+gait+and+balance+deficits+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury.</a> Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).</li>
<li>Capogrosso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+for+epidural+electrical+stimulation+of+spinal+sensorimotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits.</a> Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).</li>
</ol>

由脊髓刺激（SCS）调节的运动信息最终汇聚于运动神经元。因此，以运动神经元为研究对象可能简化实验设计，并更直接地揭示SCS的神经调节机制。为了同时记录多种刺激特征和细胞反应，膜片钳技术是研究单细胞水平电生理特性的有效方法。然而，该方法仍存在一些技术难点，包括如何维持细胞活性、如何快速将脊髓从骨性结构中分离，以及如何成功利用SCS诱导动作电位（APs）。因此，本研究旨在帮助研究人员迅速掌握关键操作技能，避免潜在的技术陷阱，并尽早将注意力集中于实验设计而非方法学本身。
为了获得良好的细胞活力，应始终注意以下细节：（1）保持脊髓处于冰冻温度至关重要，因为低温可以抑制细胞死亡并减缓代谢速率，从而在灌注、解剖和切片过程中保护神经元免受机械损伤13；（2）使用显微剪刀精细地去除硬脊膜可增强神经元从周围溶液中摄取营养物质的能力。切勿直接撕除硬脊膜，否则将严重损伤脊髓。此外，若忘记清除硬脊膜，后续切片过程可能会变得困难，因为刀片可能无法完全切断硬脊膜，导致剩余的脊髓从琼脂糖中被撕出，从而导致切片失败。（3）与传统的横切片相比，斜切片可增加灰质面积，使...

脊髓电刺激（SCS）可有效恢复脊髓损伤（SCI）后的运动功能。Andreas Rowald 等人报道，SCS 能够在单日内恢复下肢运动功能和躯干功能1。探索 SCS 促进运动功能恢复的生物学机制，是当前开发更精确 SCS 策略的关键且热门的研究方向。例如，Grégoire Courtine 团队证明，脊髓中兴奋性 Vsx2 中间神经元和 Hoxa10 神经元是响应 SCS 的关键神经元，且细胞特异性的神经调控可在 SCI 后恢复大鼠的行走能力2。然而，目前很少有研究关注 SCS 在单细胞尺度上的电学机制。尽管已知超阈值直流刺激可在经典的枪乌贼实验中引发动作电位（AP）是公认的事实3,4,5，但脉冲式交流电刺激（如 SCS）如何影响运动信号的产生仍不清楚。
鉴于脊髓内神经回路的复杂性，为研究脊髓电刺激（SCS）的电学机制，选择合适的细胞群体至关重要。尽管SCS通过激活本体感觉通路来恢复运动功能6，但运动神经元才是整合本体感觉信息传入信号后执行运动指令的最终功能单位7。因此，直接研究SCS下运动神经元的电学特性有助于我们理解脊髓运动调控的内在机制。
众所周知，膜片钳技术是细胞电生理记录的金标准方法，具有极高的时空分辨率8因此，本研究描述了一种利用膜片钳技术研究运动神经元对脊髓电刺激（SCS）电生理反应的方法。与脑部膜片钳相比9脊髓的膜片钳实验较为困难，原因如下：（1）脊髓由容积狭小的椎管保护，需要极为精细的显微操作，并在冰浴条件下严格维持，以获得较好的细胞活性。（2）由于脊髓过于细长，难以固定于切片托盘上，因此应将其浸入低熔点琼脂糖中，待凝固后修整成块再进行切片。
因此，该方法提供了在解剖脊髓的同时维持细胞活性的技术细节，从而顺利研究脊髓刺激（SCS）对运动神经元的电生理机制，并避免不必要的试验和错误。

<table><tbody><tr><td>腺苷-5&amp;rsquo;-三磷酸镁盐</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>氯化胆碱</td><td>Sigma</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片镊子</td><td>VETUS</td><td>36A-SA</td><td>夹取组织切片</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>RWD Life Science</td><td>S12006-10</td><td>剪开膈肌</td></tr><tr><td>荧光光源</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>U-HGLGPS</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Gold</td><td>Fluorochrome</td><td>Fluorochrome</td><td>标记运动神经元</td></tr><tr><td>鸟苷-5&amp;prime;-三磷酸钠盐水合物</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>红外CCD相机</td><td>Dage-MTI</td><td>IR-1000E</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>K-葡萄糖酸盐</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>MP-200</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter instrument</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀&amp;nbsp;</td><td>Jinzhong</td><td>wa1020</td><td>椎板切除术</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>电生理显微镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>带齿显微镊</td><td>RWD Life Science</td><td>F11008-09</td><td>抬起被切割的椎体</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>V900182</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸钠</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>电生理用物镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>LUMPLFLN60XW</td><td>工作距离 2 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>渗透压测定仪&amp;nbsp;</td><td>Advanced&amp;nbsp;</td><td>FISKE 210</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器&amp;nbsp;</td><td>Axon&amp;nbsp;</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳数据采集器</td><td>Axon&amp;nbsp;</td><td>Digidata 1550B</td><td></td></tr><tr><td>pH计&amp;nbsp;</td><td>Mettler Toledo&amp;nbsp;</td><td>FE28</td><td></td></tr><tr><td>切片固定锚</td><td>Multichannel system</td><td>SHD-27H</td><td></td></tr><tr><td>脊髓刺激器</td><td>PINS</td><td>T901</td><td></td></tr><tr><td>带齿镊子</td><td>RWD Life Science</td><td>F13030-10</td><td>抬起剑突</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>宽波段紫外激发滤光片</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>U-MF2</td><td></td></tr></tbody></table>

的 离体 脊髓刺激期间运动神经元全细胞膜片钳记录用脊髓切片制备

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

脊髓电刺激（SCS）可有效恢复脊髓损伤（SCI）后的运动功能。由于运动神经元是执行感觉运动行为的最终功能单元，直接研究SCS下运动神经元的电反应有助于我们理解脊髓运动调控的内在机制。为了同时记录多种刺激特征和细胞反应，膜片钳技术是一种在单细胞水平研究电生理特性的有效方法。然而，实现这一目标仍存在一些复杂的技术难点，包括维持细胞活性、快速将脊髓从骨性结构中分离，以及利用SCS成功诱导动作电位。本文提供了一种详细的膜片钳实验方案，可用于高时空分辨率下研究运动神经元对脊髓电刺激的电反应特性，帮助研究人员在熟练掌握脊髓分离和细胞活性维持技术的同时，顺利开展SCS对运动神经元电学机制的研究，避免不必要的试错过程。

得益于精细操作过程中严格的低温维持补充图1，补充图2，和 图1），细胞活力良好，足以进行后续的电生理记录。为了尽可能模拟临床场景，我们采用显微操作技术将脊髓刺激（SCS）的阴极和阳极分别置于背侧中线附近和背根进入区（DREZ）附近（图2)，可启动脊髓背角的神经信号，传递至运动柱背外侧区域的运动神经元。在本研究中，我们使用FG标记直径为20-50 µm如图所示 图2D，G，我们有把握地确认健康的 FG+ 神经元为运动神经元——脊髓环路的终端。该标记方法为研究脊髓电刺激（SCS）如何影响放电模式奠定了基础。延迟放电与即时放电运动神经元的电生理特性列于 补充表1 和 补充表 2. 计算主动和被动特性的方法见于 补充文件 1.
当脊髓切片接受SC...

本方案描述了一种利用膜片钳技术以高时空分辨率研究运动神经元对脊髓刺激（SCS）电反应的方法，该方法可帮助研究人员同时提高分离脊髓和维持细胞活性的技术水平。

脊髓刺激（SCS）可在脊髓损伤（SCI）后有效恢复运动功能。由于运动神经元是控制运动的最终执行单元……

脊髓刺激可帮助患者在损伤后恢复运动功能。运动神经元是执行感觉运动行为的最终单元。研究运动神经元的电反应有助于理解脊髓运动调节的内在机制。膜片钳是细胞电生理记录的金标准方法，具有极高的时空分辨率。因此，本研究描述了一种利用膜片钳技术在单细胞水平上同时记录多个神经元不同刺激特征及其细胞反应的方法。与脑组织的膜片钳记录相比，脊髓膜片钳更具挑战性，因为脊髓被椎管良好保护且体积微小。因此，本方案提供了快速显微解剖脊髓以及严格保持冰冻状态以获得更佳细胞活性的技术细节。膜片钳技术能够独特地揭示突触传递机制，并通过脊髓刺激来理解动作电位及编码模式活动。在暴露麻醉大鼠心脏后，使用精细剪刀剪开右心房，并在一分钟内以每秒约2毫升的速度注入100毫升冷灌注液。将大鼠置于俯卧位，在髂前上棘和胸椎弯曲转折点处切断脊柱。立即将分离的脊柱放入充氧的冰冻灌流液中，以冲洗残留的血液和脂肪组织。随后将分离的脊柱转移至解剖托盘中，背侧朝上，头端靠近操作者。用50毫升持续充氧的冰冻切割液填充托盘。在解剖显微镜下，使用显微剪从头端开始剪断两侧的椎骨椎弓根。接下来，用显微剪沿背侧中线小心切断硬脑膜。小心抬起脊髓的头端部分，切断神经根，保留约一毫米。脊髓从椎管分离后，用两枚昆虫针将腹侧朝上固定。修剪多余的神经根，保留约一毫米完整。然后使用显微剪将腰膨大分离至六到七毫米的长度。解剖脊髓并分离腰膨大后，将腰膨大置于35度斜面上，背侧朝上，尾侧朝下。用吸水滤纸吸去组织表面多余的水分。将熔化的琼脂糖凝胶小心倒入含有腰膨大的培养皿中。将培养皿置于冰水混合物中，以确保凝胶迅速冷却。将凝胶塑造成15 × 10 × 10毫米的立方体，并使用超级胶水将其固定在样本盘上。将振动切片机的参数设置为：切片厚度350微米，切片速度0.14至0.16毫米每秒，振幅1毫米，振动频率85赫兹。接着，使用盖玻片镊子夹取一片切片，放入盛有持续充氧人工脑脊液的孵育槽中。首先，将制备好的脊髓切片置于记录槽内。然后将显微操作系统的阳极置于背侧中线附近，阴极置于背根进入区附近，以准确定位脊髓刺激器。现在切换至60倍物镜，以识别一个健康的神经元，其表面应光滑明亮，无可见细胞核。略微降低红外光强度，打开荧光光源，并将光滤镜调整为宽波段紫外激发模式。现在选择一个适当的 Fluoro-Gold 阳性运动神经元，逐渐降低电极直至接近该神经元。当移液管接触到其表面时，在尖端水平观察是否有微小的膜凹陷，并释放之前施加的正压。然后使用注射器向移液管施加负压，并等待软件界面上的电阻值上升至吉欧姆（gigaohms）。将膜电位钳制在负70毫伏。按下放大器软件界面上的快速电容补偿按钮。然后施加短暂的负压以击穿细胞膜，并按下放大器软件界面上的慢速电容补偿按钮。进行脊髓刺激，持续一到两秒，刺激强度保持在1至10毫安之间。通过逐步增加刺激强度，直至观察到首个动作电位，以此确定运动阈值。在电流钳模式下，于阈下水平附近施加持续五秒的去极化电流注入，以区分延迟放电与即时放电的运动神经元。关闭脊髓刺激后，继续记录膜电位，以捕捉自发的动作电位发放。当脊髓刺激的幅度升高时，膜电位随之增加，并且每10到20次刺激脉冲就会触发一次动作电位。在脊髓刺激关闭后，神经元会在短时间内产生一系列自发的动作电位。随后，静息膜电位恢复至负65毫伏。

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脊髓切片 的离体 制备，用于脊髓刺激过程中运动神经元的全细胞膜片钳记录

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视网膜切片中光诱发的全细胞兴奋性突触电流记录

对黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录，可分析发育中肌肉和神经元的电学特性，并表征谷氨酸能神经肌肉接头以及中枢胆碱能和GABA能突触的功能性突触形成过程。...

电生理记录在 果蝇 胚胎

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本方案描述了进行全细胞膜片钳记录的基本操作步骤。该技术可用于研究 神经元的电学行为，且在脑切片中进行时，可评估仍相对完整地整合于保存较好的脑环路中的神经元的多种功能。...

脑片中的全细胞膜片钳记录

我们展示了如何制备幼鼠脊髓的斜切片。该制备方法可用于刺激腹根。...

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脊髓胶状质神经元全细胞膜片钳记录用急性脊髓切片的制备

本方案描述了在同时进行经脊髓直流电刺激的条件下，对大鼠腰段运动神经元进行体内细胞内记录的方法。该方法使我们能够在脊髓阳极或阴极极化之前、期间和之后，测量运动神经元的膜特性并记录其节律性放电活动。...

在体条件下对经脊髓直流电刺激期间类型明确的大鼠脊髓运动神经元进行细胞内记录

本方案描述了大鼠坐骨神经全组织的制备方法 离体...

坐骨神经的制备 离体 神经生理学

了解利用膜片钳技术对大鼠脊髓运动神经元进行全细胞记录的方法，以研究脊髓刺激过程中的电生理反应。该方案有助于深入理解脊髓运动调控机制及神经康复原理。

的离体脊髓刺激期间运动神经元全细胞膜片钳记录用脊髓切片制备

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