Name: 在自由移动和头部固定的动物中使用微棱镜对已识别的神经种群进行长期成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 学习利用微棱镜透镜对头部固定和自由移动的动物进行神经种群长期成像，以比较不同行为状态下的神经活动。该方法有助于研究皮层感觉信息处理动态，为理解自然条件下的神经机制提供重要技术支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Charu Reddy女士和Matteo Carandini教授（Cortex实验室）在手术方案方面的建议以及提供转基因小鼠品系。感谢Norbert Hogrefe博士（Inscopix公司）在手术开发过程中提供的指导和帮助。感谢Andreea Aldea女士（Sun实验室）在手术设备搭建和数据处理方面的协助。本工作由Moorfields眼科慈善基金会资助。

Multilayer Imaging with Microprism in Head-Fixed and Freely Moving Animals

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Vaziri, A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+the+optical+dimension+in+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Reshaping the optical dimension in optogenetics.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+at+pre-+and+postsynaptic+sites+of+layer+2%2F3+cells+in+developing+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).</li>
<li>Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cellular+imaging+of+mouse+visual+cortex+during+operant+behavior+and+passive+viewing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing.</a> Front Cell Neurosci. 4, 3(2010).</li>
<li>Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+field+of+view+two-photon+mesoscope+with+subcellular+resolution+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging.</a> Elife. 5, 14472(2016).</li>
<li>Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDAR-dependent+emergence+of+behavioral+representation+in+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex.</a> Cell Rep. 32 (4), 107970(2020).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo.+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Seaton, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-component+structural+plasticity+mediated+by+%CE%B1CaMKII+autophosphorylation+on+basal+dendrites+of+cortical+layer+2%2F3+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones.</a> J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li>
<li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li>
<li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures%3A+Imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li>
<li>Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minicolumn+hypothesis+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The minicolumn hypothesis in neuroscience.</a> Brain. 125, 935-951 (2002).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+fluorescence+microscopy+for+imaging+brain+activity+in+freely-behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals.</a> Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).</li>
<li>Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+cortical+Ca2%2B+imaging+in+freely+moving+mice+with+prism+probes+and+miniaturized+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. (124), e55579(2017).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical%2C+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+behavioral+experiments+in+head-fixed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice.</a> PLoS One. 9 (2), 88678(2014).</li>
<li>Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+imaging+of+cortical+dynamics+during+sensory+perception+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior.</a> J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+denoising%2C+deconvolution%2C+and+demixing+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data.</a> Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> Elife. 7, 28728(2018).</li>
<li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+deep-brain+imaging+in+mouse+using+visible-light+optical+coherence+tomography+through+chronic+microprism+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window.</a> Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).</li>
<li>Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+elastic+propagation+of+cortical+seizures+in%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Reliable and elastic propagation of cortical seizures in.</a> Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).</li>
<li>Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+micro-organization+of+grid+cells+revealed+by+cellular-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging.</a> Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).</li>
<li>Barson, D., Hamodi, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mesoscopic+and+two-photon+imaging+of+neuronal+activity+in+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits.</a> Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).</li>
<li>Paquelet, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+activity+and+network+properties+of+dorsal+raphe+nucleus+serotonin+neurons+during+emotionally+salient+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors.</a> Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+microelectrode+arrays+integrated+with+microprisms+for+electrophysiology+and+simultaneous+two-photon+imaging+across+cortical+layers%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+rapid+plasticity+in+hippocampal+CA1+representations+during+novel+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences.</a> Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+two-photon+microscopy+for+enlarged+field-of-view%2C+multi-plane+and+long-term+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging.</a> Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).</li>
<li>Engelbrecht, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-compact+fiber-optic+two-photon+microscope+for+functional+fluorescence+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo.</a> Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-%CE%BC+Periscope%2C+a+tool+for+multilayer+optical+recordings%2C+optogenetic+stimulations+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both.</a> Elife. 10, 72894(2021).</li>
<li>Stibůrek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((110+%CE%BCm+thin+endo-microscope+for+deep-brain+in+vivo+observations+of+neuronal+connectivity%2C+activity+and+blood+flow+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics.</a> Nat Commun. 14 (1), 1897(2023).</li>
</ol>

作者声明无竞争性财务利益或利益冲突。

在此，我们展示了在同一神经元群体中观察并直接比较固定头部和自由活动条件下神经元活动的能力。尽管我们在此以视觉皮层的应用为例进行演示，但该方案可适用于多种其他脑区，包括皮层区域和深部核团24,25,26,27,28，也可适配于其他数据采集和行为学实验装置29,30。
在本方案中，记录关键步骤非常重要，因为这些步骤有助于获得最佳的数据。首先，在进行z轴扫描时，必须始终保持亮度的一致性。如前所述，光线穿透的组织越深，散射越严重；因此，通过增加增益，激光将具有更强的功率，从而能够更深地穿透组织并激发我们的感兴趣区域（ROIs）。然而，不建议从足以激发深层组织中ROIs的增益开始z轴扫描，因为这会导致皮层表面荧光结构的过度曝光和光毒性，并可能使表面组织发生漂白。因此，选择相对指数梯度选项，可使软件计算出在z轴扫描每一步所需的稳定功率梯度，以实现最佳成像效果。其次，另一个关键步骤是确保在第一次单光子成像会话中保存所采集视频的平均图像，这有助于长期稳定地匹配细胞群。通过该平均图像，操作者可在后续成像会话中与原始图像进行比对，以确保细胞群和数据采集的连续性。
值得注意的是，轻量型微型双光子显微镜已由各方独立设计完成31,32，可在自由活动的动物中实现高分辨率成像。尽管这代表了高分辨率成像领域的一项令人振奋的进展 在体 成像时，受限的视野（FOV）以及高度专业化的设计使得普通终端用户难以应用。我们所描述的方法整合了多个可从商业供应商处 readily 获得的成熟平台，因而具有较高的可及性。理论上，该方法也可替换为与开源微型显微镜和通用双光子显微镜兼容的定制化自组装微棱镜33,34.
尽管如此，该方案仍面临一些挑战，例如微棱镜植入的准确性问题，因为操作误差可能导致无效的视野（FOV），进而影响数据质量。由于不同成像模式采用不同的物镜，因此在多种成像方式之间保持一致的视野也具有挑战性。然而，由于微棱镜的XY轴位置固定，视野的变化主要发生在Z轴方向；因此，可通过两种成像模式中均存在的特定解剖标志（如血管、皮层组织中的伪影以及相同的神经元）来同步视野。此外，至关重要的是需进行图像配准，以对齐并识别不同成像模式下的相同神经元。另一个需要注意的挑战是在两种成像模式的数据采集过程中尽量减少GCaMP组织的光漂白。因此，应尽量缩短记录时间，优化信噪比（通过提高增益而非增加LED/激光功率），并在两次成像会话之间间隔24-48小时。
尽管存在这些固有的复杂性，但只要以手术般的精确性执行本方案，并结合适当的图像处理技术，即可为比较神经活动提供一个可靠的平台。该方案能够比较在严格控制的任务中头部固定状态下的神经活动与更接近自然行为的自由活动状态下的神经活动，从而拓展了其在神经科学领域的潜在应用。

技术的出现 体内 双光子荧光成像1,2结合光学系统新技术与基因改造的荧光指示剂，已成为神经科学领域研究活体大脑复杂结构、功能及可塑性的强大技术3,4特别是，这种成像方式相较于传统电生理学具有无与伦比的优势，能够同时捕捉神经元的形态结构和动态活动，从而实现对已识别神经元的长期追踪5,6,7,8.
尽管高分辨率荧光成像具有显著优势，但其应用通常需要静态的、头部固定的实验装置，这限制了动物的活动能力9,10,11。此外，利用透明玻璃表面观察神经元时，仅能对一个或多个水平平面进行成像，从而限制了对跨越不同皮层深度的垂直方向动态过程的探究12。
针对这些局限性，本研究提出了一种创新的手术方法，结合头固定板、微棱镜和微型显微镜，构建出具有多层与多模态成像能力的成像技术。微棱镜可实现对皮层柱内垂直信息处理过程的观察13,14,15,16，这对于理解信息在皮层不同层次间传递时如何被加工与转换，以及在可塑性变化过程中垂直处理如何发生改变至关重要。此外，该方法能够在头固定范式和自由活动状态下对同一神经元群体进行成像，覆盖了多种实验条件17,18,19：例如，头固定通常适用于需要精确控制的实验范式，如感觉知觉评估以及双光子成像下的稳定记录；而自由活动状态则为行为学研究提供了更自然、更灵活的环境。因此，能够在两种模式下进行直接比较的能力，对于深入理解支持灵活且功能性神经反应的微环路机制至关重要。
本质上，将头部固定板、微棱镜与微型显微镜整合到荧光成像中，为研究大脑结构与功能的复杂性提供了一个极具前景的平台。研究人员能够跨多个深度采样涵盖所有皮层的特定细胞群，直接比较这些细胞群在严格控制条件和自然范式下的反应，并在数月时间内监测其长期变化20。该方法有助于深入理解这些神经细胞群在不同实验条件下如何随时间相互作用并发生改变，从而揭示神经环路的动态特性。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠输注溶液（Vetivex 11）250 ml</td><td>德克拉</td><td>20091607</td><td>用于水化和药物配制的生理盐水</td></tr><tr><td>18004-1 骨钻 1.8 mm 直径钻头</td><td>FST</td><td>18004-18</td><td>钻头</td></tr><tr><td>1毫升注射器</td><td>Terumo</td><td>MDSS01SE</td><td>1 ml 注射器</td></tr><tr><td>23G × 5/8 英寸 6% LUER 针头</td><td>Terumo</td><td>NN-2316R</td><td>23G针头</td></tr><tr><td>71000 自动化立体定位仪，内置软件</td><td>真实世界数据</td><td>-</td><td>真实世界数据</td></tr><tr><td>可吸收明胶止血海绵（10x10x10mm）</td><td>Surgispon</td><td>SSP-101010</td><td>凝胶-泡沫</td></tr><tr><td>70%异丙醇酒精棉片</td><td>布劳恩</td><td>9160612</td><td>酒精棉片</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>任何零售商</td><td>-</td><td>手术期间用于覆盖眼睛的锡箔</td></tr><tr><td>人工脑脊液&amp;nbsp;</td><td>Tocris Bioscience，Bio-Techne 品牌</td><td>3525/25ML</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>自动显微注射泵</td><td>WPI</td><td>8091</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液（10%碘化聚维酮）500 ml</td><td>Videne/Ecolab</td><td>3030440</td><td>聚维酮碘</td></tr><tr><td>布鲁克 Ultima 2Pplus（定制版）</td><td>布鲁克</td><td>-</td><td>双光子成像系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cardiff Aldasorber</td><td>兽医技术</td><td>AN006</td><td>麻醉吸收器</td></tr><tr><td>CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC</td><td>尼康</td><td>MRH48230</td><td>20倍物镜</td></tr><tr><td>紧凑型麻醉系统 - 单气体 - 异氟烷 K/F，配氧气浓缩器型号：ZY-5AC 及废气清除装置</td><td>兽医技术</td><td>AN001</td><td>紧凑型麻醉系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Contec Prochlor&amp;nbsp;</td><td>Aston Pharma</td><td>AP2111L1</td><td>消毒剂（次氯酸）</td></tr><tr><td>地塞米松磷酸钠注射液，USP，4 mg/ml，NDC：0641-6145-25</td><td>Hikma</td><td>Covetrus:70789</td><td>地塞米松</td></tr><tr><td>解剖刀，切割刃4mm，厚度0.5mm，不锈钢</td><td>Fine Science Tools</td><td>10055-12</td><td>用于切开皮层的刀具</td></tr><tr><td>双面无穿刺小鼠模型 &amp;和新生大鼠耳杆</td><td>斯托尔廷</td><td>51649</td><td>耳杆</td></tr><tr><td>假显微镜</td><td>Inscopix</td><td>假显微镜</td><td>以协助植入</td></tr><tr><td>乙醇（100%）&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>40-1712-25</td><td>用于配制70%乙醇&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;III类个人防护装备 丁腈蓝手套</td><td>FischerScientific</td><td>17182182</td><td>手套</td></tr><tr><td>恒温监测仪 50-7222-F</td><td>哈佛仪器</td><td>50-7222-F</td><td>恒温监测系统/加热垫</td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>ImageJ</td><td>-</td><td>图像处理软件</td></tr><tr><td>Inscopix 数据处理软件（IDPS）</td><td>Inscopix</td><td>-</td><td>单光子钙成像处理软件</td></tr><tr><td>Insight Duals-232，序列号 2043</td><td>InSight</td><td>Insight Spectra X3</td><td>双光子成像激光器</td></tr><tr><td>IsoFlo 250ml 100% w/w 吸入剂</td><td>硕腾</td><td>WM 42058/4195</td><td>异氟烷</td></tr><tr><td>Kwik-Sil 低毒性硅胶粘合剂</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>KWIK-SIL</td><td>硅胶粘合剂</td></tr><tr><td>MICROMOT 交流电源适配器 NG 2/S，配钻机单元 60/E</td><td>PROXXON</td><td>NO 28 515</td><td>手持电钻</td></tr><tr><td>nVoke 集成成像与光遗传学系统套装</td><td>Inscopix</td><td>-</td><td>单光子成像系统及软件</td></tr><tr><td>ProView 植入套件</td><td>Inscopix</td><td>ProView 植入套件</td><td>假体显微镜、立体定位臂及附件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ProView Prism 探针</td><td>Inscopix</td><td>1050-002203</td><td>微棱镜透镜</td></tr><tr><td>Rimadyl（50 mg/ml）</td><td>硕腾</td><td>VM 42058/4123</td><td>卡洛芬&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带桌夹的关节臂立体定位显微镜</td><td>WPI</td><td>PZMTIII-AAC&amp;nbsp;</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Super-Bond Universal 试剂盒，SUN Medical</td><td>Prestige-Dental</td><td>K058E</td><td>粘接水泥</td></tr><tr><td>双光子钙成像软件</td><td>Suite2P</td><td>-</td><td>双光子钙成像处理软件</td></tr><tr><td>蒸发器</td><td>兽医技术</td><td>-</td><td>异氟烷蒸发器</td></tr><tr><td>Xailin 润滑眼膏 5g</td><td>Xailin-Night</td><td>MLG/28/1551</td><td>眼用软膏&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

使用微棱镜对自由活动和头部固定动物中已鉴定的神经元群体进行长期成像

Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals

随着多光子显微镜和分子技术的进步，荧光成像正迅速发展成为研究活体脑组织结构、功能及可塑性的强大手段。与传统的电生理学方法相比，荧光显微镜不仅能捕捉神经元的活动，还能同时记录细胞形态，从而实现对特定神经元群体在单细胞或亚细胞分辨率下的长期记录。然而，高分辨率成像通常需要稳定的头部固定装置，这限制了动物的自由活动；此外，制备平坦的透明玻璃表面虽可实现一个或多个水平层面的神经元可视化，但在研究跨越不同深度的垂直结构时存在局限性。本文介绍一种结合头部固定板与微棱镜的技术，以实现多层、多模态成像。该手术方法不仅能够完整获取小鼠视觉皮层的全层结构，还可支持在头部固定状态下进行双光子成像，以及在自由活动范式下进行单光子成像。利用该方法，可对跨越不同皮层的特定细胞群体进行采样，记录其在头部固定与自由活动状态下的反应，并实现长达数月的长期追踪。因此，该技术为研究神经微环路提供了一种全面的检测手段，能够直接比较由精确控制的刺激所诱发的神经活动与自然行为范式下的神经活动。

已展示在数周时间内，利用单光子和双光子成像方式，在自由活动和头部固定条件下，对同一神经元群体进行慢性多层活体钙成像的方法。此处展示了在动物于黑暗环境中探索开放场地时，通过单光子成像识别匹配神经元群体的能力（图7A）。从已识别的神经元中提取钙信号轨迹，并进行z分数标准化以进行比较（图7B）。在相隔3周的实验记录中，神经元表现出相似水平的荧光强度和放电频率。
<img alt="随时间变化的细胞动态；显微镜图像；荧光强度变化的图表追踪。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65387/65387fig07v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：初级视皮层的钙信号动态可在长达3周的多次记录中稳定匹配。 （A）在单光子自由活动钙成像条件下，对同一视野进行三次独立记录所获得的最大投影图像上叠加的已识别神经元的空间滤波结果，记录时间跨度为3周。感兴趣区域（ROIs）的标注顺序与（B）中的呈现顺序一致。第二次（中间）和第三次（右侧）记录中的深色区域是基于第一次（左侧）记录作为参考进行图像配准的结果（比例尺代表0.5 mm）。（B）在（A）中所示的第一（左）、第二（中）和第三（右）次记录中，已配准的感兴趣区域的Z分数化钙信号活动。水平比例尺为10 s，垂直比例尺为10 sd。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65387/65387fig07largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
接下来，展示了在不同成像模式下对神经元群体进行配准的方法。在同一天内分别进行单光子和双光子成像实验。从单光子数据中识别出感兴趣区域（ROI），并通过人工筛选生成细胞图谱（图8A）。同样地，对双光子数据进行处理以生成细胞图谱，其中细胞被自动识别并经人工选择用于演示。随后，利用MIRA平台将单光子会话的平均投影图像与双光子z轴堆栈的最大投影图像进行对齐（图8B）。该变形后的细胞图谱随后被导出，叠加至双光子最大投影图像上，并与双光子细胞图谱对齐（图8C）。由此实现了在两种成像模式下对同一细胞的活动进行识别（图8D），可用于神经元响应的定量分析。
<img alt="显微成像与光子测量；图A-C显示荧光成像，D图显示光子发射曲线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65387/65387fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 8"> 
图 8：不同成像模式下记录的初级视皮层钙动力学。（A）在单光子自由活动记录会话的最大投影图像上叠加的已识别神经元的空间滤波结果。标注的神经元是指成功与（C）中展示的双光子记录数据配准的神经元。（B）（A）中所示的相同轮廓经形变后与（C）中展示的双光子会话数据匹配。（C）将（A）中所示感兴趣区域（ROI）在配准后的空间滤波结果（白色），以及使用双光子处理软件从同日双光子固定头部记录会话中识别出的ROI（绿色），叠加于该双光子会话的最大投影图像上。重叠的ROI被视为已成功配准，并被选作进一步分析（比例尺代表0.5 mm）。（D）已配准ROI在单光子（左）和双光子（右）记录会话中的Z分数化钙信号活动（水平比例尺为10 s，垂直比例尺为10 sd）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65387/65387fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

当与头部固定板及兼容单光子和双光子显微镜的光学设计结合使用时，微棱镜透镜在多种条件下测量垂直神经元柱中的神经反应方面具有显著优势，包括在头部固定状态下的精确控制实验，或在自由活动动物中进行的自然行为任务。

随着多光子显微技术和分子技术的进步，荧光成像正迅速发展成为一种强大的研究方法，用于……

系统神经科学极大地受益于成像技术的进步，尤其是与分子和遗传学方法相结合时。研究人员正越来越多地采用高分辨率、慢性记录以及细胞类型特异性靶向技术，以更精细的空间尺度、更长的时间跨度和更多样的位置来解析大脑功能。实验范式的一个显著转变是逐渐从麻醉状态下的记录转向清醒或自由活动状态下的记录。该方法能够实现对自然条件下脑活动的表征，但也对刺激和测量的精确控制带来了挑战。通过本方案，我们可以在头部固定和自由活动的动物中对相同的神经元群体进行成像，从而直接比较这些神经元在高度受控条件和自然范式下的活动情况。本方案可实现跨皮层层次的感觉信息处理研究。通过该方法，我们能够在头部固定状态下比较神经元对受控感觉刺激的反应，并在自由运动期间开展行为任务，从而促进对感觉处理动态特性的理解。

long-term-imaging-identified-neural-populations-using-microprisms

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在自由移动和头部固定的动物中使用微棱镜对已识别的神经种群进行长期成像

将直角微棱镜插入小鼠新皮层，可实现对多个皮层的深层成像，其视野通常仅在脑片中可见。一毫米微棱镜提供宽广的视野（约900...

体内成像微棱镜用于深层皮层的成像

在本视频及补充材料中，我们展示了一种利用磨薄颅骨制备法对完整大脑进行长期在体成像的实验方案。...

使用磨薄颅骨制备法对小鼠视觉皮层进行长期成像

在活体动物中进行延时成像可为完整大脑内的结构重组提供重要信息。本文介绍一种颅骨减薄制备方法，该方法可通过双光子显微镜对活体小鼠大脑皮层中荧光标记的突触结构进行经颅成像。...

双光子 体内 使用颅骨变薄制备法对小鼠皮层树突棘进行成像

该方法为小鼠在显微成像或单细胞电生理记录期间提供了一个可感知且熟悉的环境，使其能够在动物头部被牢固固定的情况下进行导航与探索。...

平底式气浮平台：一种将清醒自由活动啮齿类动物行为学与显微成像或电生理记录相结合的新方法

本文介绍了一种在自由活动的小鼠中，跨多个皮层以细胞分辨率进行大规模 Ca2+...

自由活动小鼠中使用棱镜探针和微型荧光显微镜进行多层皮层 Ca2+ 成像

本方法描述了一种慢性制备技术，可实现对活体小鼠海马体的光学观察。该技术可用于在数周时间内对神经元结构可塑性以及活动诱导的细胞可塑性进行纵向光学成像。...

活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像

本方案描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于在健康和疾病状态下对神经-胶质-血管结构、相互作用及功能进行纵向成像。该技术可作为经颅成像方法的补充替代方案，后者虽然常被优先选用，但存在一些关键性局限。...

精确脑图谱引导下对小鼠神经-免疫动态进行重复活体成像

本文演示了定制成像窗口的制备方法，该窗口配有灌注套管，并展示了其在小鼠海马CA1区的植入过程。...

行为小鼠海马神经元活动观测的开颅手术操作

本文介绍了一种用于在清醒且头部固定的活体小鼠中对脑细胞进行长期成像的慢性颅窗植入实验方案。...

植入颅窗以实现重复观察 在体实验 清醒小鼠成像

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

学习利用微棱镜透镜对头部固定和自由移动的动物进行神经种群长期成像，以比较不同行为状态下的神经活动。该方法有助于研究皮层感觉信息处理动态，为理解自然条件下的神经机制提供重要技术支持。

使用微棱镜对自由活动和头部固定动物中已鉴定的神经元群体进行长期成像

探索更多视频