Name: 基于线扫描振动和频生成显微镜的多模态非线性高光谱化学成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 了解基于线扫描振动和频生成显微镜的多模态非线性高光谱化学成像技术，用于研究自组装生物组织的微观结构与介观形态关系。该方法可同时获取宽带VSFG图像、明场和二次谐波成像，显著提升软材料成像分辨率，为神经科学和生物物理学研究提供分子水平的结构信息。

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仪器开发得到了美国国家科学基金会（NSF CHE-1828666）的资助。ZW、JCW 和 WX 得到了美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所（Grant 1R35GM138092-01）的资助。BY 得到了中国科学院青年创新促进会（CAS，2021183）的资助。

1. 高光谱线扫描VSFG显微镜
<ol>
	<li>激光系统
	<ol>
		<li>使用中心波长为 1025 nm ± 5 nm 的脉冲激光系统（参见材料表）。将激光设置为 40 W、200 kHz（200 µJ/脉冲），脉宽约为 290 fs。 
		注意：重复频率可略有变化，通常较高的重复频率激光更适用于该VSFG显微镜。</li>
		<li>将种子激光的输出引导至商用光学参量放大器（OPA）以生成中红外（MIR）光束（参见材料表）。将MIR调谐至目标频率（图1A）。 
		注意：在本研究中，MIR中心波长为 3450 nm ± 85 nm（约 2900 ± 72 cm-1），脉冲持续时间约为 290 fs，脉冲能量约为 6 µJ，覆盖了部分-CHx官能团区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>上转换光束
	<ol>
		<li>将来自OPA的残余1025 nm光束通过法布里-珀罗标准具（参见材料表），以产生光谱窄化的上转换光束，其半高全宽（FWHM）约为 4.75 cm-1。</li>
		<li>使用8 µm蓝宝石针孔对窄化后的1025 nm光束进行空间滤波。 
		注意：可使用近红外（NIR）卡观察1025 nm光束。</li>
		<li>使用λ/2波片（参见材料表）控制1025 nm脉冲的偏振方向。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MIR光束
	<ol>
		<li>将MIR光束通过延迟台，以精细控制时间重叠。</li>
		<li>使用λ/2波片控制MIR光束的偏振方向。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>VSFG显微镜
	<ol>
		<li>在定制的二向色镜（DM，图1B）上使上转换光束和MIR光束在空间上重叠，该二向色镜对MIR透射、对NIR反射（参见材料表）。使用两个光阑辅助准直：一个位于DM之后，另一个位于远端。在光阑后使用功率计判断MIR是否居中，并使用NIR卡定位NIR光束位置。 
		注意：重叠后，可利用NIR光束引导两束光。</li>
		<li>将重叠后的光束导入倒置显微镜，并通过集成的325 Hz单轴共振光束扫描器（安装于集成双位置扫描器（I2PS），图1B）（参见材料表）进行扫描。 
		注意：共振扫描器将两束重叠光形成的线投射到聚光物镜的后焦平面。该扫描器安装在滑轨上，可在VSFG/SHG与明场成像模式之间无缝切换。</li>
		<li>使用纯反射式施瓦茨希尔德物镜（SO，图1B,D）（参见材料表）将两个空间重叠的光束聚焦到样品上。</li>
		<li>使用无限远校正的折射物镜（RO，图1B,D）（参见材料表）收集样品产生的VSFG信号。</li>
		<li>将准直输出的VSFG信号先通过线性偏振片，再通过由两个焦距 f = 60 mm 的透镜（TL1 和 TL2，图1B,C）组成的远心管镜系统（参见材料表）。 
		注意：管镜系统放大的图像形成于单色仪（MC，图1B,C）的入射狭缝处，空间/频率分辨的数据由二维CCD探测器（CCD，图1B）检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SHG模式
	<ol>
		<li>切换至SHG成像时，遮挡红外光束，并将光谱仪的光栅旋转至501.5 nm，以成像SHG信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>明场模式
	<ol>
		<li>切换至明场光学成像时，打开白光光源（参见材料表）。移动集成滑轨（I2PS，图1B），使成像在反向传播方向进行，此时成像物镜（RO）作为聚光镜，聚光物镜（SO）作为成像物镜，以采集明场图像。</li>
		<li>使用商用管镜系统（参见材料表），将折射物镜准直输出的图像形成于RGB明场相机的传感器平面上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="1025 nm 激光激发光路装置示意图，包含光谱系统与中红外分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1多模态高光谱VSFG显微镜 (A) 核心装置的俯视图。 1025 nm 泵浦激光被送入光参量放大器（OPA）以产生可调谐的中红外脉冲。剩余的 1025 nm 激光经常通过法布里-珀罗标准具（E）进行窄化，并通过空间滤波器（SFG）整形为高斯光束。中红外光束与 1025 nm 光束在定制的二向色镜（DM）处实现空间重叠，随后导入倒置显微镜（图中框选区域） A). (B两束光被导入一个325 Hz谐振光束扫描器，该扫描器安装在一个集成的双位置滑块（I2PS）上，可实现明场与非线性光学模式之间的无缝切换。显微镜平台配备了一个基于反射的无限远校正施瓦兹希尔德物镜（SO），用作聚光镜，以及一个基于折射的无限远校正成像物镜（RO），安装在垂直纳米定位（VNP）Z轴平台上。SO将谐振光束扫描器反射的入射光束线聚焦到样品上，而RO则收集VSFG信号的线段部分。精确控制RO在Z轴方向的位置至关重要 1 µm 精确调节以确保样品处于最佳焦面状态，从而实现高质量成像。VSFG信号的准直光束随后被导入由两个管镜（TL1和TL2）组成的管镜系统，在单色仪（MC）的入射狭缝处形成放大图像。频率分辨的光谱线随后在电荷耦合器件（CCD）上进行高光谱成像。每条高光谱线采集完成后，通过纳米定位平台（NP）在与共振光束扫描器扫描轴垂直的方向上对样品进行扫描。为采集样品的明场图像，将I2PS移至明场位置，并安装用于反射白光光源（WLS）的反射镜。光线经由物镜（RO）聚焦后，由成像物镜（SO）成像，最终在倒置显微镜顶部的明场相机（BC）传感器平面上形成图像。C) 光路经管镜区域进入MC和CCD的详细示意图。DSO与RO之间样本区域的详细视图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
2. 高光谱显微镜的校准与垂直CCD轴空间校准
<ol>
	<li>使用标准的氧化锌（ZnO）样品（厚度为1 µm，溅射镀膜图案，尺寸为15 mm × 15 mm × 0.170 mm ± 0.005 mm 的盖玻片），通过明场成像模式将其调至明场焦点，粗略优化样品平面（纳米位移台z轴）的位置。 
	注意：可能需要根据实际情况调整物镜转盘（RO）的z位置以及白光的对准。用于对准校准的玻璃基底上ZnO图案的代表性图像见图2。</li>
	<li>将I2PS移回非线性照明臂，并针对CCD相机上观察到的ZnO区域产生的最大非共振VSFG信号强度，优化样品高度。 
	注意：必须调整RO的z位置以获得最大信号强度。在达到样品和RO的最佳高度之前，可能需要重复步骤2.1和2.2数次。</li>
	<li>打开共振振镜扫描器，并采集一行图像。</li>
	<li>通过沿垂直于振镜扫描方向扫描样品，采集非共振强度图像。对图像数据取垂直切片，并确定像素与微米的比例关系（参见图3及其图注）。 
	​注意：通过分析这些线段的导数，可得到用于后续图像的垂直CCD轴方向上的像素:微米比例。</li>
</ol>
<img alt="显微图案，25μm标尺，网格布局，显微图像，材料表面分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：氧化锌（ZnO）图案明场成像模式粗略对准时的代表性图像质量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用信号强度图进行纳米定位器校准；光学测量校准过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：垂直轴校准工作流程。 本图说明如何将CCD像素转换为以 µm 为单位的垂直空间尺寸。(A) 采集并重建ZnO图案化盖玻片的图像，然后测量图案两侧边缘之间的像素距离（A中的小竖条）。由于ZnO图案十字的设计宽度为25 µm，因此可利用此处的实际宽度与像素宽度的比值，计算出实际尺寸与像素的换算比例。一个典型的经垂直轴校准后的图像如(B)所示。(C) 最后，沿红线所示位置提取一条垂直切片。(D) 对该垂直切片求导以获得空间分辨率。对垂直切片求导用于确定空间分辨率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 高光谱数据采集
<ol>
	<li>在CCD上采集VSFG信号的垂直线光谱，其中光谱沿CCD的水平轴色散，空间位置则记录在CCD的垂直轴上。 
	注意：这将生成单线区域的二维数据集。</li>
	<li>在对样品的线区域完成高光谱成像后，使用三维纳米定位器（NP，图1）沿垂直于线扫描方向的轴对样品进行扫描。 
	注意：三维纳米定位器对于精确定位样品区域（x-y平面）以及调节样品至最佳焦平面（z轴）具有重要意义，可确保高精度与可重复性。</li>
	<li>重复执行步骤3.1与步骤3.2，以采集完整的VSFG高光谱图像。</li>
</ol>
4. 高光谱数据分析
<ol>
	<li>使用MatLab成像工具箱中的高光谱成像库工作流程对数据进行光谱解混41. 
	注意：光谱解混将空间位置与独特的光谱相关联。用于高光谱数据分析的 Matlab 代码在 补充文件 1.
	<ol>
		<li>创建一个四维超立方体（x = 空间，y = 空间，z = 频率依赖性强度，ω = 频率），使用以下方法 超立方体 Matlab 图像处理工具箱高光谱成像库中的函数41.</li>
		<li>鉴定具有唯一性的谱图数量 countEndmembersHFC 假警报概率（PFA）值为10时的函数-7.</li>
		<li>使用以下方法识别独特光谱 nfindr 光谱解混功能</li>
		<li>最后，使用 sid 功能，将每个像素与前一步骤中识别出的唯一光谱之一相关联。 
		注：可使用 MatLab 高光谱成像库中提供的其他函数/算法进行额外的光谱解混和匹配方法41.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拟合 每个分离薄片的求和数据拟合到Voigt函数42 (补充文件 1). 
	注意：洛伦兹函数代表纯均匀线型极限，而高斯函数源于非均匀极限。实际上，体系可能处于均匀与非均匀极限的混合状态，此时需要采用沃伊格特函数——这是凝聚相光谱学（包括振动和频光谱 VSFG）中的常见做法。</li>
</ol>
5. 样品的几何分析
<ol>
	<li>按照步骤 5.2-5.3 中所述的程序确定样品的几何结构。本研究中以 SDS@2β-CD 为例。基于 SDS@2β-CD 介观片层样品中分子亚基的 C7 对称性，推导出 χ(2) 中由对称性允许的张量元素。 
	注意：由对称性允许的 χ(2) 取决于对称性。如需计算任意对称性下允许的非线性 susceptibilities，可参考文献43。</li>
	<li>应用欧拉旋转27 将实验室坐标系中的测量结果与分子坐标系相关联。 
	注意：对于 SDS@2β-CD，其 C7 对称性导致了八个独立方程，将 8 个输出量（实验室坐标系下的 χ(2)）与 8 个输入量（6 个独立的超极化率 β(2)，以及两个角度：ϴ，即所有片层相对于样品平面的倾斜角；φ，即片层在平面内的旋转角（图 4））关联起来。使用两个片层以提取两者共有的分子取向信息。两个片层的平面内旋转角 φ1 与 φ2 之间的关系可通过明场图像提取。在当前示例中，φ2 = φ1 + 60°。假设所有分子单元以相同角度倾斜，因此 ϴ1 = ϴ2。这导致共有 11 个未知量（其中 9 个独立量，包括 6 个独立的超极化率 β(2)、ϴ1 和 φ1, 以及两个片层之间的相对覆盖比例 N，以及两个依赖量 φ2 和 ϴ2），对应 16 个已知量（每个片层 8 个实验室坐标系下的极化分量，共两个片层）。</li>
	<li>利用神经网络函数求解器，将偏振分辨的实验室坐标系 χ(2) 与分子坐标系下的超极化率 β(2) 关联起来。 
	注意：该方法的详细总结见文献27。
	<ol>
		<li>在 Python44 中使用 Keras 构建一个分层神经网络模型，其结构为 200-100-50 节点，并采用双曲正切激活函数。</li>
		<li>生成一个 100000 × 11 的随机矩阵，包含 β(2)、ϴ1、ϴ2、φ1、φ2 和 N 的数值。利用步骤 5.2 中确定的欧拉旋转公式，计算对应的实验室坐标系下 16 个 χ(2) 值。</li>
		<li>将计算得到的 χ(2) 值（共 100,000 组，每组 16 个值）作为输入，训练模型以预测 11 个输出值（β(2)、ϴ1、ϴ2、φ1、φ2 和 N），当输入 16 个 χ(2) 值时。</li>
		<li>训练完成后，使用另一组包含 1000 个样本的数据（同时具有输入和输出）来测试训练好的模型。预测输出与真实输出应呈现线性关系，斜率应为 1。</li>
		<li>最后，输入从两个片层实验测得的 χ(2) 值（每个片层测得 8 个 χ(2)），利用训练好的模型预测倾斜角 ϴ 以及其他相关性质。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="晶向图，显示 χ(2)(θ,φ,β) 及 θ=23° 时的分子结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：欧拉变换示意图。 （A）实验室坐标系（XYZ）中的二阶非线性 susceptibilitity χ(2) 与分子坐标系（xyz）中的超极化率 βijk 之间欧拉变换的示意图。对分子坐标系进行 z-y'-z'' 欧拉旋转，其中 φ 为面内旋转角，θ 为倾斜角，ψ 为扭转角。对于分子轴周围任意扭转角，ψ 被积分消除。φ 不被积分消除，因为所有分子均相对于实验室坐标系旋转至特定角度，从而形成自组装片层。N 为两种片层的相对表面覆盖率。（B）由神经网络结果确定的倾斜亚基形成片层结构的可视化示意图。该图改编自 Wagner 等人27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

Using a VSFG Microscope for Multimodal, Rapid, Hyperspectral Chemical Analysis

作者无任何利益冲突需要披露。

最关键的步骤是1.42至1.44。为了实现光学空间分辨率，必须精确对准物镜。同时，有效收集发射信号、中继并以线状将扫描光束投射到入口狭缝处也至关重要。正确的对准可确保最佳分辨率和信噪比。对于典型的样品，如&#160;SDS@2β-CD 100 µm × 100 µm 的片状样品，获得一幅高信噪比、分辨率良好（约1 µm）的图像需要20分钟。这已经比之前版本的仪器更快24,26。通过使用更高重复频率的激光器，可进一步提高数据采集速度。
目前的局限性在于空间分辨率，通过使用更高数值孔径（NA）的物镜以及基于非线性光学的超分辨率技术，该分辨率有望进一步提升45。外差探测已被应用于振动和频生成（VSFG）光谱中，以解析其相位并提取分子取向信息5,46,4...

振动和频产生（Vibrational sum-frequency generation, VSFG）是一种二阶非线性光学技术1,2，已被广泛用作光谱学工具，用于对具有对称性允许特性的样品进行化学表征3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22。传统上，VSFG 被应用于缺乏反演对称性的界面体系8,9,10,11（即气-液、液-液、气-固、固-液界面），而这种对称性破缺是 VSFG 活性的必要条件。该技术的应用已提供了大量关于埋藏界面的分子细节12,13、界面处水分子的构型14,15,16,17,18，以及界面化学物种的信息19,20,21,22。
尽管VSFG在确定界面处的分子种类和构型方面已表现出强大能力，但其在测量缺乏反演中心的材料分子结构方面的潜力尚未得到充分开发。部分原因在于这类材料在化学环境、组分和几何排列上可能具有异质性，而传统的VSFG光谱仪在样品上的照射区域较大，约为100 µm2。因此，传统VSFG光谱技术提供的是在典型100 µm2照射区域内样品的系综平均信息。这种系综平均可能导致取向相反的高度有序区域之间的信号相互抵消，从而误判局部异质性15,20,23,24。
随着高数值孔径（NA）反射式显微物镜（Schwarzschild 和 Cassegrain 结构）的发展，这类物镜几乎无色差，使得VSFG实验中两束光的聚焦尺寸可从100 µm2减小至1–2 µm2，在某些情况下甚至可达到亚微米级25。结合这一技术进步，我们课题组及其他研究团队已将VSFG发展为一种显微成像平台20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36。最近，我们实现了倒置光路结构和宽带探测方案37，可无缝采集多模态图像（VSFG、二次谐波生成（SHG）和明场光学图像）。多模态成像能够利用光学成像快速检查样品，将多种类型的图像相互关联，并在样品图像上准确定位信号位置。借助消色差照明光学系统以及脉冲激光光源的选择，该光学平台为未来无缝整合其他技术（如荧光显微镜38和拉曼显微镜等）提供了可能。
在这一新构型中，已研究了诸如分层结构和一类分子自组装体（MSA）等样品。这些材料包括胶原蛋白和仿生材料，其中材料的最终功能既取决于其化学组成，也取决于其几何结构。由于VSFG是一种二阶非线性光学信号，它对分子间排列特别敏感39,40，例如分子间距离或扭转角度，因此成为揭示化学组成和分子排列的理想工具。本文描述了核心仪器的VSFG、SHG和明场成像模式，该仪器由一个掺镱腔体固态激光器驱动的光学参量放大器（OPA）、一台自行搭建的多模态倒置显微镜以及与二维电荷耦合器件（CCD）探测器耦合的单色仪频率分析仪组成27。文中提供了该系统的逐步搭建与校准流程，以及完整的部件清单。此外，以一种分子自组装体（MSA）为例进行了深入分析，该自组装体的基本分子单元由一个十二烷基硫酸钠（SDS，一种常见表面活性剂）分子和两个β-环糊精（β-CD）分子组成，本文中简称为SDS@2β-CD，用以展示VSFG如何揭示有序物质中分子特异性的几何细节。研究还表明，可通过神经网络函数求解器方法确定该MSA的化学特异性几何结构细节。

<table><tbody><tr><td>1x 相机转接器</td><td>Thorlabs</td><td>WFA4100</td><td>将相机连接至显微镜或光学系统</td></tr><tr><td>25.0 mm 直角棱镜镜，镀保护金膜</td><td>Thorlabs</td><td>MRA25-M01</td><td>反射光线并产生后向反射，将光线沿原路径返回</td></tr><tr><td>3&amp;rdquo; 通用立柱支架-5件装</td><td>Thorlabs</td><td>UPH3-P5</td><td>固定和支撑各种尺寸与配置的立柱</td></tr><tr><td>30 mm 转 60 mm 笼式安装板，厚度 4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LCP4S</td><td>在 30 mm 笼式系统与 60 mm 笼式系统之间进行转换</td></tr><tr><td>500 mm 高 Cerna 显微镜主体带落射照明臂</td><td>Thorlabs</td><td>CEA1500</td><td>实现显微镜顶部照明技术的功能</td></tr><tr><td>60 mm 笼式安装 &amp;Oslash;50.0 mm 可调光阑</td><td>Thorlabs</td><td>LCP50S</td><td>控制通过光学系统的光量</td></tr><tr><td>60 mm 笼式安装支架</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01B</td><td>在光学装置中安装和定位 60 mm 笼式系统</td></tr><tr><td>空气间隔标准具</td><td>SLS Optics Ltd.</td><td>定制</td><td>生成窄带 1030 nm 光&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>笼式安装板支架</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>以精确角度固定和调节反射镜</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Andor Technologies</td><td>Newton&amp;nbsp;</td><td>用于频率和空间分辨的二维 CCD</td></tr><tr><td>共线光学参量放大器</td><td>Light Conversion</td><td>Orpheus-One-HP</td><td>可调中红外光源</td></tr><tr><td>氯化铜</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A16064.30</td><td>自组装组分</td></tr><tr><td>定制二向色镜</td><td>Newport</td><td>定制</td><td>根据波长或偏振态选择性反射或透射光线</td></tr><tr><td>外螺纹转 M32 内螺纹适配器</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A34</td><td>提供兼容性，便于连接具有不同螺纹类型的组件</td></tr><tr><td>无限远校正折射物镜</td><td>Zeiss</td><td>420150-9900-000</td><td>折射物镜</td></tr><tr><td>无限远校正施瓦兹希尔德物镜</td><td>Pike Technologies Inc.</td><td>891-0007</td><td>反射式物镜</td></tr><tr><td>激光器</td><td>Carbide, Light-Conversion</td><td>C18212</td><td>激光光源</td></tr><tr><td>M32x0.75 外螺纹转 RMS 内螺纹</td><td>Thorlabs</td><td>M32RMSS</td><td>适配或转换显微物镜的螺纹尺寸或类型&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M32x0.75 外螺纹转 M27x0.75 内螺纹刻字</td><td>Thorlabs</td><td>M32M27S</td><td>适配或转换显微物镜的螺纹尺寸或类型&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手动中高程聚光镜调焦模块</td><td>Thorlabs</td><td>ZFM1030</td><td>调节光学元件的焦点</td></tr><tr><td>单色仪</td><td>Andor Technologies</td><td>Shamrock 500i</td><td>为每条线扫描提供频率分辨</td></tr><tr><td>带 1&quot; 行程的边缘安装臂电动模块</td><td>Thorlabs</td><td>ZFM2020</td><td>控制成像物镜的垂直位置</td></tr><tr><td>纳米定位器</td><td>Mad City Labs Inc.</td><td>MMP3</td><td>三维样品台</td></tr><tr><td>共振扫描器</td><td>EOPC</td><td>SC-25</td><td>325 Hz 共振光束扫描器</td></tr><tr><td>RGB 彩色 CCD 相机</td><td>Thorlabs</td><td>DCU224C</td><td>明场相机，已停产，但其他相机同样适用</td></tr><tr><td>RGB 管镜</td><td>Thorlabs</td><td>ITL200</td><td>白光收集</td></tr><tr><td>直角运动学光学平台</td><td>Thorlabs</td><td>OPX2400</td><td>集成具有两个固定位置的滑动机构</td></tr><tr><td>30 mm 直角运动学反射镜架</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>以精确角度固定和调节反射镜</td></tr><tr><td>60 mm 直角运动学反射镜架</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>以精确角度固定和调节反射镜</td></tr><tr><td>SM2，用于 Cerna 调焦平台的 60 mm 笼式臂</td><td>Thorlabs</td><td>CSA2100</td><td>安全安装和定位聚光镜</td></tr><tr><td>60 mm 笼式系统快拆盖，长 24 英寸</td><td>Thorlabs</td><td>C60L24</td><td>封闭并保护笼内组件</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>J63394.AK</td><td>自组装组分</td></tr><tr><td>用于 1&quot; Cerna 行程平台的三通道控制器与旋钮盒</td><td>Thorlabs</td><td>MCM3001</td><td>控制 ZFM2020</td></tr><tr><td>管镜</td><td>Thorlabs</td><td>LA1380-AB - N-BK7</td><td>SFG 信号收集</td></tr><tr><td>可见光 LED 套件</td><td>Thorlabs</td><td>WFA1010</td><td>为成像系统提供照明</td></tr><tr><td>白光光源</td><td>Thorlabs</td><td>WFA1010</td><td>用于明场成像的白光照明光源</td></tr><tr><td>WPH05M-1030 - &amp;Oslash;1/2&quot; 零级半波片，&amp;Oslash;1&quot; 安装架，1030 nm&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>WPH05M-1030</td><td>改变通过其的光的偏振态</td></tr><tr><td>WPLQ05M-3500 - &amp;Oslash;1/2&quot; 安装式低阶四分之一波片，3.5 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>WPLQ05M-3500</td><td>改变通过其的光的偏振态</td></tr><tr><td>X 轴长行程钢制延长接触滑台</td><td>Optosigma</td><td>TSD-65122CUU</td><td>提供水平（X）方向长行程的定位平台</td></tr><tr><td>XT95 4 英寸导轨载具</td><td>Thorlabs</td><td>XT95RC4</td><td>安装和定位光学元件</td></tr><tr><td>带 360 度旋转的 X-Y 轴平移台</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1</td><td>实现物体在二维方向上的精确定位与移动，并具备平台旋转能力</td></tr><tr><td>XY(1/2&quot;) 线性平移器，中心带 SM1 通孔</td><td>Thorlabs</td><td>XYT1</td><td>提供二维方向上的精确定位与移动</td></tr><tr><td>掺镱固体激光器</td><td>Light Conversion</td><td>CB3-40W</td><td>种子激光器</td></tr><tr><td>&amp;beta;-环糊精</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>J63161.22</td><td>自组装组分</td></tr></tbody></table>

使用线扫描振动和频产生显微技术的多模态非线性高光谱化学成像

Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy

振动和频产生（VSFG）是一种二阶非线性光学信号，传统上被用作光谱技术来研究界面分子，其空间分辨率约为 100 µm。然而，该光谱技术对样品的异质性不敏感。为了研究介观尺度上具有异质性的样品，我们与他人共同将 VSFG 光谱技术的分辨率极限推进至约 1 µm 水平，并构建了 VSFG 显微镜。这种成像技术不仅能够通过成像解析样品的形貌，还能在图像的每个像素点上记录宽带 VSFG 光谱。作为一种二阶非线性光学技术，其选择定则使得生物学、材料科学及生物工程等领域中常见的非中心对称或手性自组装结构得以可视化。本文将引导读者了解一种倒置透射式设计，该设计可实现对未固定样品的成像。本研究还展示了将 VSFG 显微技术与神经网络函数求解器相结合，能够解析单个自组装片层的化学特异性几何信息。最后，通过对多种样品在明场、SHG 和 VSFG 配置下获得的图像进行简要讨论，阐述了 VSFG 成像所揭示的独特信息。

<img alt="用于信号分析的VSFG光谱装置分子示意图，显示顶部和侧面视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：SDS@β-CD的分子结构、形貌及可能的取向。（A）SDS@β-CD的顶视图化学结构；（B）侧视图化学结构。（C）介观尺度片层在样品平面上的代表性非均匀分布。分子亚基在基底上的取向和排列方式可能各不相同，目前尚不明确。本图经改编自Wagner等人的研究27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig05lar...

开发了一种多模态快速高光谱成像框架，用于获取宽带振动和频生成（VSFG）图像，同时结合明场和二次谐波产生（SHG）成像模式。由于红外频率与分子振动共振，该方法可揭示具有对称性允许特性的样品的微观结构和介观形貌信息。

振动和频光谱（Vibrational sum-frequency generation, VSFG）是一种二阶非线性光学信号，传统上被用于研究界面处的分子结构，作为一种……

我们的目标是研究介观尺度上具有异质性的自组装样品（如生物组织），以揭示其化学组成和分子排列。我们正在探索这些自组装材料的微观排列和介观形貌如何与其微观性质相关联。随着高数值孔径和基于反射的显微物镜技术的进步，我们及其它研究团队已实现了分辨率达到一平方微米的振动和频产生显微成像，该技术可同时记录软物质的图像并空间分辨其光谱，从而形成所谓的高光谱图像。高光谱成像以多个维度记录实验数据，包括两个空间维度、一个频率维度，可能还有一个时间维度。然而，如何快速采集、存储和分析此类大数据以最大化信息获取，仍然是一个挑战。仅对图像进行采样以收集有用的数据点也同样具有挑战性。通过开发更快的线扫描技术，我们可以将数据采集时间加快100倍。此外，该显微镜兼容和频生成（SFG）、二次谐波生成（SHG）以及宽场成像。多模态成像可实现利用光学成像对样品进行快速检测，并关联多种成像模态。二次谐波成像有助于我们技术的光学手段，尽管缺乏光谱分辨能力，但在生物物理学中已得到广泛应用。我们的和频共振显微镜现在将能够提供目前在软组织生物物理研究中所缺失的强有力分子水平洞察。

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Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

基于线扫描振动和频生成显微镜的多模态非线性高光谱化学成像

光谱成像已成为在同一份样本中识别和分离多种荧光信号的可靠方法，能够有效区分目标信号与背景或自发荧光。激发扫描高光谱成像在此基础上进一步优化，可在降低图像采集所需时间的同时，显著提高信噪比。...

激发扫描高光谱成像显微技术高效区分荧光信号

本文描述了一种通过将受激拉曼散射（SRS）实验装置与激光扫描显微镜集成而实现的受激拉曼散射显微镜。该SRS显微镜基于两束飞秒（fs）激光光源，分别为钛宝石（Ti:Sa）激光器和同步的光学参量振荡器（OPO）。...

基于受激拉曼散射的非线性显微镜的实现

本文介绍了光谱聚焦模块与双输出脉冲激光器的集成，实现了对金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。本研究旨在展示在标准激光扫描显微镜上实现多模态非线性光学技术的详细方法。...

利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

本文直接比较了集成在同一显微镜平台上的受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）在分辨率、灵敏度和成像对比度方面的性能。结果表明，CARS 具有更高的空间分辨率，SRS...

高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微成像在化学成像中的直接比较

我们提出了一种利用宽带受激拉曼散射（SRS）显微技术获取化学图像的实验方案。该方案基于采用多通道差分锁相检测的SRS显微镜，详细描述了样品制备、SRS仪器调节以及化学计量学方法，用于解析化学非均质样品中不同组分的成分信息。...

基于宽带受激拉曼散射显微技术的多重化学成像

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

基于紧凑且超稳定的双折射干涉仪的宽场傅里叶变换显微镜，可对二维探测器的所有像素并行采集光谱。该时域方法能够分离光致发光信号与拉曼信号，并实现快速拉曼成像（约5毫秒/像素），空间分辨率约为1 µm，光谱分辨率约为23...

一种多模态宽场傅里叶变换拉曼显微镜

本方案详细介绍了无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微技术的逐步操作流程，包括激光光源的产生、组织样本的制备、成像过程的实施以及数据的分析方法。SLAM技术通过检测四种互补的无标记对比信号，推动了非线性显微成像技术的发展，可用于研究组织微环境。...

无标记自体荧光多谐波显微成像同步观测

基于自由基的仿生化学已被应用于构建生物标志物开发所需的化合物库。...

化学生物学中的自由基：从化学行为到生物标志物的开发

本文描述了一种利用尼罗红染色法测定藻类细胞中性脂质含量的简单方案。该技术省时高效，可作为传统基于重量法的脂质定量方法的替代方案，并专为生物工艺性能监测这一特定应用而设计。...

一种利用荧光法快速简便测定藻类细胞中中性脂质的方案

了解基于线扫描振动和频生成显微镜的多模态非线性高光谱化学成像技术，用于研究自组装生物组织的微观结构与介观形态关系。该方法可同时获取宽带VSFG图像、明场和二次谐波成像，显著提升软材料成像分辨率，为神经科学和生物物理学研究提供分子水平的结构信息。

使用线扫描振动和频产生显微技术的多模态非线性高光谱化学成像

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