Name: 普通狨猴层流皮层活动的电生理学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学习使用定制微驱动系统在普通狨猴中进行亚毫米级精准皮层电生理记录，实现清醒状态下的视觉视网膜拓扑映射。该方法为灵长类视觉神经科学研究提供了稳定可靠的长期记录技术。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 EY030998（J.F.M.、A.B. 和 S.C.）支持。本方法基于Coop等人（正在审稿中，2022年；https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.11.511827v2.abstract）所开发的方法。我们感谢Dina Graf以及Mitchell实验室成员在狨猴饲养与操作方面提供的帮助。

Development of an X-Y Electrode Stage for Precise Neural Recording in Marmosets

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<li>Okun, M., Lak, A., Carandini, M., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+immobile+silicon+probes+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with immobile silicon probes in the mouse cortex.</a> PloS One. 11 (3), e0151180(2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前有多种方法（例如慢性、亚慢性、急性）可用于在非人灵长类动物中进行神经生理学实验。由于狨猴体型较小，且缺乏作为解剖学标志的脑回结构，因此在对其进行神经生理学实验时面临独特的挑战。研究人员需要依赖视网膜拓扑结构和感兴趣脑区的调谐特性等神经生理学标志来确定记录目标区域。因此，在初次绘制皮层区域图谱时，可能需要每天调整电极位置。目前狨猴神经生理学实验的常用准备方法采用亚慢性探针固定方式，无法实现便捷的位置调节机制5。本方案展示了一种轻量化的微型驱动装置，可用于稳定的线性阵列记录，能够在不同记录会话之间灵活定位，并实现亚毫米级的精确移动，从而在记录腔内绘制出视网膜拓扑图谱。
目前的方法涉及每天急性插入电极，以实现精确的电极定位并在视网膜拓扑图之间移动，这与在狨猴中使用的慢性电极阵列植入有所不同5。然而，急性制备本身存在一些缺点，例如实验准备时间延长、感染风险增加，以及由于反复穿刺导致皮层组织损伤的风险升高。尽管在此制备过程中已优化了硅胶的使用以降低感染风险，但应用硅胶时仍需进行一定的故障排查，...

近年来，普通狨猴（Callithrix jacchus）作为研究脑功能的动物模型，其使用日益广泛。这种趋势的兴起主要归因于狨猴平滑的大脑皮层易于操作、其神经功能组织与人类及其他灵长类动物具有高度相似性，以及其体型小、繁殖速度快等特点1。随着该模式生物的普及，适用于狨猴脑部的神经生理学技术也迅速发展。电生理学方法在神经科学中被广泛用于研究啮齿类和灵长类动物大脑皮层中单个神经元的活动，具有无与伦比的时间分辨率和空间定位能力。然而，由于狨猴作为视觉神经科学研究模型相对较新，清醒状态下行为结合电生理记录技术的优化仍在不断演进。以往研究已建立了适用于麻醉状态下狨猴的稳定电生理记录方案2，早期的清醒行为神经生理学研究也证实了单通道钨电极的可靠性3。近年来，研究人员已成功将基于硅的微电极阵列应用于清醒狨猴的神经生理记录4。然而，由于狨猴脑体积较小且缺乏明显的解剖学标志，电极靶向定位面临独特挑战。本实验方案详细阐述了如何构建并使用一种适用于狨猴的微型驱动记录系统，该系统可利用硅线性电极阵列记录大量神经元活动，同时最大限度减少对脑组织的损伤。
由于狨猴视觉皮层中的视网膜拓扑图相较于较大的灵长类动物更为微小，因此在研究中使用狨猴存在挑战。电极位置仅移动1毫米就可能导致拓扑图发生显著变化。此外，研究人员通常需要在不同记录会话之间调整电极的放置位置，以获取视觉皮层中更广泛的视网膜拓扑区域。目前的半慢性制备方法尚无法实现每日调整电极位置，也无法以足够的精度在亚毫米尺度上靶向特定位置5. 考虑到这一点，所提出的微驱动系统采用了一种X-Y电极平台，可将轻量化的微驱动装置安装至记录室，并实现对皮层位点的亚毫米级精确定位。可移动的X-Y平台组件能够调节线性阵列的垂直和水平位置，从而系统性地覆盖不同皮层区域，这是识别感兴趣区域所必需的通过 视网膜定位与调谐特性。在不同记录会话之间，研究人员还可手动调节X-Y位移台，以改变目标区域内的记录位点。这一优势显著优于采用半慢性记录装置的其他技术，后者缺乏便捷的电极定位机制。
微型驱动装置是一种多功能工具，可安装多种硅基阵列并将其缓慢置入皮层。在本方案中，采用了一种定制探针，其包含两个相距200 µm的32通道线性阵列，用于研究跨越整个皮层深度的分层环路。目前大多数神经环路探测方法通常仅对大脑皮层所有层的电位或单个神经元信号进行平均采样。然而，近期研究揭示了关于皮层分层微环路的 intriguing 发现6。通过使用微型驱动装置，研究人员可利用分层探针并对记录深度进行精细调节，以确保对所有皮层层级实现全面采样。
该系统可使用市售组件构建，并可轻松修改以适用于不同的实验技术或探针。此制备方法的主要优势在于能够以亚毫米级精度调节X-Y记录位置，并可控制在皮层内的记录深度。本方案提供了构建X-Y平台微驱动装置以及神经生理学记录技术的逐步操作说明。

<table><tbody><tr><td>1/4英寸Hp钻头</td><td>麦克马斯特 &amp;amp; Carr</td><td>货号 43035A32</td><td>碳化钨钻头，1/4&quot; 柄径，圆柱头（圆头），货号 SC-1，单刃切割（https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits）</td></tr><tr><td>1x1毫米Crist网格</td><td>Crist Instruments</td><td>1 mm × 1 mm 网格</td><td>https://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids</td></tr><tr><td>91% 异丙醇</td><td>Medline</td><td>N/A</td><td>https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol</td></tr><tr><td>采集板</td><td>Open-Ephys</td><td>N/A</td><td>https://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1</td></tr><tr><td>杆菌肽软膏</td><td>Medline：Cosette Pharmaceuticals Inc</td><td>N/A</td><td>https://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr</td></tr><tr><td>钝头直镊</td><td>Medline</td><td>N/A</td><td>https://www.medline.com/category/中央灭菌/手术器械/镊子/Z05-CA16_02_20/产品</td></tr><tr><td>骨蜡</td><td>Medline</td><td>ETHW31G</td><td>https://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B Metabond 快速粘合剂水泥系统</td><td>Parkell, Inc.</td><td>S380</td><td>https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System</td></tr><tr><td>Clavamox</td><td>MWI动物健康</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>隐形眼镜护理液</td><td>博士伦</td><td></td><td>多种可获取的来源</td></tr><tr><td>定制打印的3D打印部件</td><td>ProtoLab</td><td></td><td>https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html</td></tr><tr><td>DB25-G2 25针公头端口信号连接器</td><td>多种来源</td><td>DB25-G2 25</td><td>DB25-G2 25针公插头端口信号2排端子分线板螺母连接器</td></tr><tr><td>Dremel 金刚石锯附件</td><td>Dremel</td><td>545金刚石轮</td><td>https://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab</td></tr><tr><td>数字化头级</td><td>Intan</td><td>RHD 32通道（部件号 #C3314）</td><td>https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&amp;amp;yPos=120.80&lt;br/&gt; 000305175781</td></tr><tr><td>EDOT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>产品编号 # 483028</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028</td></tr><tr><td>辅助之手</td><td>海港货运</td><td>N/A</td><td>https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html</td></tr><tr><td>钩式电极夹</td><td>多种来源</td><td>N/A</td><td>钩挂测试 电缆线</td></tr><tr><td>接口电缆（RHD 3英尺（0.9米）超薄SPI电缆）</td><td>Intan</td><td>&amp;nbsp;部件 #C3213</td><td>https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html</td></tr><tr><td>实验升降台</td><td>多种来源</td><td>N/A</td><td>https://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&amp;amp;linkCode=df0&amp;amp;hvadid=366343&lt;br/&gt; 827267&amp;amp;hvpos=&amp;amp;hvnetw=g&amp;amp;hvrand&lt;br/&gt; =2036619536500717246&amp;amp;hvpone&lt;br/&gt; =&amp;amp;hvptwo=&amp;amp;hvqmt=&amp;amp;hvdev=c&amp;amp;hv&lt;br/&gt; dvcmdl=&amp;amp;hvlocint=&amp;amp;hvlocphy=900&lt;br/&gt; 5674&amp;amp;hvtargid=pla-795933567991&amp;amp;&lt;br/&gt; ref=&amp;amp;adgrpid=71496544770&amp;amp;th=1</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>MWI动物健康</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>微驱动装置</td><td>克里斯特仪器</td><td>3-NRMD</td><td>https://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd</td></tr><tr><td>64通道连接器的多通道线性硅阵列</td><td>NeuroNexus</td><td>A1x32-5mm-25-177</td><td>https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/</td></tr><tr><td>NanoZ Omentics 适配器- 32通道</td><td>NeuraLynx</td><td>ADPT-NZ-N2T-32</td><td>https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32</td></tr><tr><td>NanoZ 系统</td><td>Plexon</td><td>NanoZ 阻抗测试仪</td><td>https://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/</td></tr><tr><td>Narishige 微操作器</td><td>Narishige</td><td>立体定位微操作器</td><td>https://usa.narishige-group.com/</td></tr><tr><td>Open-Ephys GUI</td><td>Open-Ephys</td><td></td><td>https://open-ephys.org/</td></tr><tr><td>聚酰亚胺管（外径(英寸)：0.021 / 内径(英寸)：0.018）</td><td>多种来源（Chamfr）</td><td>Chamfr Cat#HPC01895</td><td>https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/</td></tr><tr><td>灵长类动物固定椅</td><td>由罗切斯特大学机械车间定制制作</td><td>在线设计</td><td>https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html</td></tr><tr><td>聚（苯乙烯磺酸钠）（PSS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>产品编号 # 243051</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051</td></tr><tr><td>RHD USB 接口板</td><td>Intan</td><td>RHD2000评估板版本1.0</td><td>https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>World Precision Instruments</td><td># KWIK-SIL</td><td>低毒性硅胶粘合剂 ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive)</td></tr><tr><td>缓释型丁丙诺啡</td><td>药房配制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>36号不锈钢丝</td><td>McMaster &amp;amp; 卡尔</td><td>货号 6517K11</td><td>圆形弯折定型多功能304不锈钢丝，哑光表面，1英尺长，0.008英寸直径&quot; 直径</td></tr><tr><td>Stanley 6件装精密螺丝刀套装</td><td>Stanley</td><td>1.4 mm 平头螺丝刀</td><td>https://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&amp;amp;关键词=&lt;br/&gt; stanley+66-052&amp;amp;qid=1672764369&amp;amp;sprefix=&lt;br/&gt; stanley+66-052%2Caps%2C90&amp;amp;sr=8-3</td></tr><tr><td>钢制螺丝</td><td>McMaster &amp;amp; Carr</td><td>00 型不锈钢六角螺丝和 1/8&amp;rdquo; 在长度上</td><td>https://www.mcmaster.com/</td></tr><tr><td>钢制管</td><td>麦克马斯特 &amp;amp; Carr</td><td>28号不锈钢管</td><td>https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Loctite</td><td>SuperGlue 凝胶对照</td><td>https://www.loctiteproducts.com/zh/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html</td></tr></tbody></table>

普通狨猴皮层分层活动的电生理学

Electrophysiology of Laminar Cortical Activity in the Common Marmoset

由于狨猴具有光滑的大脑皮层表面，便于使用线性电极阵列进行记录，因此成为研究皮层层状神经环路的理想模型。近年来，狨猴因其神经功能组织与其他灵长类动物相似，且在记录和成像方面具备技术优势，而日益受到关注。然而，由于其脑组织体积较小，且缺乏脑回等解剖学标志，对该模型进行神经生理学研究面临一些独特挑战。通过使用定制的微型驱动装置，研究人员能够以亚毫米级精度调控线性电极阵列的位置，并在多次记录过程中稳定地针对相同的视网膜拓扑位置进行记录。本实验方案详细描述了微型驱动定位系统的逐步构建方法，以及使用硅基线性电极阵列进行神经生理记录的技术。通过在不同记录会话中精确控制电极位置，研究人员可轻松穿越皮层，根据视网膜拓扑组织特征及所记录神经元的调谐特性，识别感兴趣的脑区。此外，利用这种层状电极阵列系统，还可应用电流源密度分析（CSD）来确定单个神经元的记录深度。本方案还展示了层状记录的示例，包括在Kilosort中分离出的跨多个通道的尖峰波形。

本方案描述了如何构建一个X-Y电极架（图1），该装置可实现亚毫米级的靶点定位，并在多次独立的记录会话中保持可靠的定位精度。X-Y定位的可靠性如图6所示，该图表明，相隔一周进行的两次记录会话中，其平均感受野（RF）位置的重叠率达到70.8%（图6A）。此外，通过微调微驱动器的位置，可在视网膜拓扑空间中实现精确移动。通过参考每一级架台上预先钻好的孔位（孔间距为2 mm），可进行最大达0.2 mm的微小X和Y方向移动。在一系列利用微小位置调整跨越MT/MTC边界的记录会话中（图6B），可观察到视网膜拓扑空间中的精确移动（图6C）。MT和MTC的记录位点与Solomon和Rosa此前报道的电生理图谱一致2。同样，根据本方案，Z方向的定位可通过调节电极至目标深度所需的旋转圈数进行追踪。尽管为将电极置入皮层...

定制的微型驱动装置可实现使用线性硅阵列对皮层记录位点进行亚毫米级精确定位。

狨猴因其平滑的大脑皮层表面，成为研究皮层分层环路的理想模型，这种结构特点有利于进行……记录

由于体型较小且缺乏作为解剖学标志的脑回结构，普通狨猴在神经生理学研究中带来了独特的挑战。电极位置仅移动一毫米就可能导致视网膜拓扑图发生显著变化。所提出的微型驱动系统采用了一种XY电极平台，可在亚毫米尺度上实现电极的垂直和水平移动。由于狨猴作为视觉神经科学研究模型相对较新，清醒行为电生理技术仍在不断发展。目前的制备方法通常使用半慢性探针，无法为定位装置提供操作空间。本方案展示了一种轻量化的机械驱动装置，可用于有效的线性阵列记录，能够在不同记录会话之间灵活调整位置，从而在记录腔内绘制视网膜病变图谱。正确使用固定驱动装置、缓慢穿透组织并避开主要血管，可在制备过程中避免长期的皮层损伤。此外，该技术已优化了开颅手术中使用 slastic 以避免感染的操作。首先，收集构建电极微驱动装置所需的部件。将一个螺母放入底座的槽中，并添加氰基丙烯酸酯胶水以增强稳定性。然后将螺钉穿过底座中的螺母。使用配备金刚石切割轮附件的旋转工具，切割一块4×3×3毫米的塑料网格，网格孔间距为1×1毫米。将网格部件放置在Y形支架的顶部。涂抹环氧树脂，将网格部件固定在Y形支架的顶部。然后，使用螺丝将微型驱动器安装到网格上方。在微型驱动器底部添加环氧树脂以增强稳定性。使用环氧树脂将塑料矩形平台固定在28号钢制管上。将23号导管穿过网格。然后将连接在塑料平台上的不锈钢管穿过23号导引管。将28号不锈钢管插入微驱动装置的其中一个插槽中。使用环氧树脂将不锈钢管固定在微驱动装置上。使用手敲工具，敲击X轴平台和底座上的预制螺孔，以构建驱动部分的基座。然后将螺钉穿过X轴平台的长条形槽孔，并固定在底座对应的螺孔中。再将两个螺钉穿过Y轴平台的长条形槽孔，并将其固定在X轴平台的预制螺孔中。在确认显微操作仪驱动装置已安装塑料平台后，使用胶带将64针连接器固定在平台上。然后小心地在塑料管上涂抹少量杆菌肽，并通过柔性带状电缆将电极连接到64针连接器上。使用显微操作仪驱动装置固定硅电极及其连接器，同时将塑料管穿过Y轴平台上的孔洞。将64针连接器从显微操作器驱动装置上拆下，并使用胶凝剂将连接器固定在X轴载物台的平台上。第二天，小心地将电极从塑料管上分离，并将显微操作器驱动装置从组件上取下。轻轻移动鳄鱼夹，翻转驱动装置，以露出未固定的电极。将电极放置在Y轴载物台下方的塑料支架上，并用硅胶弹性体固定。五分钟后，使用显微驱动器上的螺丝控制装置回撤电极，并将保护套套在电极外部。拧紧显微驱动器基座部件上的三个侧边螺丝。将用于记录的前置放大器连接到64针连接器上。在使用前一天，将EDOT和PSS溶于蒸馏水中以配制PEDOT溶液。打开阻抗测试软件，在左上角的顶部下拉菜单中选择适配器。在第二个下拉菜单中，选择电极。确保通道数量正确。使用连接器将探头连接到阻抗测试系统，并将探头浸入接地的生理盐水中，以获得基线读数。按下“测试阻抗”按钮，并在按下“测试探针”按钮前确认设置正确。记录并保存电极两个分支的基线读数，以供日后参考。随后，降低实验台升降架，将探针从盐水中取出。将烧杯中的生理盐水替换为蒸馏水。升起实验室升降台，使电极浸入蒸馏水中，冲洗残留的生理盐水，然后再次降低升降台。将蒸馏水替换为PEDOT溶液，升起实验室升降台，直至电极完全浸入溶液中。选择直流电镀按钮并确认设置正确。然后按下自动电镀按钮并保存结果。测试结束后，首先用蒸馏水冲洗探头。然后用生理盐水注满烧杯，并升高实验台升降架，直至电极完全浸入。按下“测试阻抗”按钮，检查设置是否正确。随后按下“测试探头”按钮。首先，将微型驱动器固定在头帽上。拧紧微型驱动器系统的全部三颗螺丝。使用微型驱动器上的螺丝控制器，以每1至2秒旋转一圈的速度缓慢降低硅探针，直至在阵列尖端观察到神经信号单位。观察到神经元后，回撤微驱动器一圈，以降低电极穿过弹性组织和硬脑膜进入皮层组织时的进针速度。随后缓慢继续将电极阵列推进皮层，20至30分钟内前进4到6圈，直至神经元在探针长度方向上均匀分布。然后缓慢回撤电极阵列1至2圈，以减轻对组织的压力。记录完成后，以与初始插入时相近的速度缓慢将电极阵列从皮层撤回。当探头上不再可见神经元时，加快撤回速度，直至电极阵列完全回到初始的完全回缩位置。将探头从记录室取出后，将其浸泡在隐形眼镜清洁液中20分钟，以清除任何残留的组织或血液。将探针置于酒精中一分钟，以去除接触镜溶液，并让电极自然干燥。通过Kilosort获得的峰电位分选阵列数据显示，所选簇中峰电位的主成分特征与背景峰电位明显不同，证实了记录在时间上的稳定性。XY定位的可靠性显示，相隔一周的两次实验会话之间，平均感受野位置的重叠率达到70.8%。通过微小的位置调整，在跨越MT和MTC边界的系列记录会话中，观察到了精确的视网膜拓扑空间运动。

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