Name: 在成像微孔板中使用预制聚乙二醇（PEG）水凝胶简单建立血管化成骨骨髓壁龛 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 了解如何使用预制聚乙二醇水凝胶在成像微孔板中建立血管化成骨骨髓壁龛模型。该方法支持间充质干细胞与内皮细胞顺序接种，用于高通量研究细胞相互作用及生长因子对血管网络形成的影响。

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作者感谢Riccardo Urbanet在液体处理设备方面的技术支持，以及Rodi Odabasi在落射荧光显微镜方面的支持。本工作由瑞士国家科学基金会（资助号310030E_202429和205321_204318）和Ectica Technologies AG资助。

图1 总结了以下实验方案部分。
1. 建立三维基质单培养体系
<ol>
	<li>制备hBM-MSC细胞悬液。
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中，使用添加10% FBS、1%青霉素-链霉素和5 ng/mL FGF-2的MEMα培养基培养hBM-MSCs，使其融合度达到70%–90%。细胞传代次数不超过第6代。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞，加入0.05%胰蛋白酶-EDTA于37 °C消化3–5分钟。用基础培养基（含10% FBS和1%青霉素-链霉素的MEMα）冲洗以终止消化。将悬浮细胞收集至50 mL锥形离心管中。</li>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并确定悬液中的总细胞数量。</li>
		<li>在200 × g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。小心吸除上清液。</li>
		<li>用适量的基础培养基重悬细胞，使储备液浓度达到1 × 107 个细胞/mL。</li>
		<li>准备若干50 mL锥形离心管，分别加入所需体积的基础培养基，并补充相应浓度的生长因子（如FGF-2和BMP-2，浓度可设为0 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL或200 ng/mL）。每孔需200 µL。若使用自动化液体处理仪进行接种，还需考虑仪器的死体积；若为手动接种，额外准备10%的过量体积即可。</li>
		<li>将储备液中的hBM-MSCs按1:66.67的比例稀释，使最终细胞浓度为1.5 × 105 个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备接种用培养板。
	<ol>
		<li>移除覆盖在96孔水凝胶板上的聚丙烯粘性薄膜。</li>
		<li>小心吸除覆盖在水凝胶表面的保存缓冲液。可使用微孔板洗涤仪，也可手动操作。
		<ol>
			<li>若使用手动吸液器或多通道移液器，应将吸头紧贴孔壁，边吸液边缓慢向内孔边缘移动，以避免损伤水凝胶表面。</li>
			<li>若使用自动化微孔板洗涤仪，应将吸液喷嘴设置在距离板架至少3.8 mm的位置（相当于距离水凝胶板内圈0.8 mm），并朝向孔边缘。详细操作说明及96孔水凝胶板的图纸请参考仪器制造商提供的使用手册。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤1.1.7中制备并充分混匀的细胞悬液以每孔200 µL加入培养板，确保细胞均匀分布。接种过程中避免倾斜培养板，以防细胞在基质某一区域不均匀沉降。手动接种时，每接种3个孔后应重新混匀细胞悬液以维持均一性；自动化接种前，应立即用移液管吹打混匀，以保证每次分配的液体中含有相同数量的细胞。</li>
	<li>将培养物置于37 °C、5% CO2的湿润环境中继续培养。</li>
	<li>根据需要使用5倍物镜进行明场显微镜观察，监测培养物的生长情况。接种后约30分钟采集参考图像，用于评估接种的细胞数量。</li>
</ol>
2. 建立三维基质-内皮细胞共培养体系
<ol>
	<li>制备GFP-HUVEC细胞悬液。
	<ol>
		<li>通过使用含有150 µg/mL大鼠尾胶原I（溶于0.02 M乙酸）的溶液，在37 °C下孵育30分钟，对HUVEC培养用的培养瓶进行包被处理。使用前用PBS冲洗一次。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2的湿润环境中，将GFP-HUVECs在添加了10%胎牛血清（FBS）的EGM-2培养基中培养至80%-100%融合度。细胞传代次数不超过第7代。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞，然后加入0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C下消化2-3分钟。用基础培养基（MEMα补充10% FBS和1%青霉素-链霉素）冲洗以终止消化。将悬浮细胞收集至50 mL锥形离心管中。</li>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并确定悬液中的总细胞数量。</li>
		<li>在200 x g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。小心吸除上清液。</li>
		<li>用适量的基础培养基重悬细胞，使其浓度达到1 x 107 个细胞/mL，作为储备液。</li>
		<li>准备50 mL锥形离心管，加入所需体积的基础培养基，并补充相应的生长因子（如FGF-2和BMP-2，浓度分别为0 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL或200 ng/mL），具体操作参照步骤1.1.6中对hBM-MSCs的描述。</li>
		<li>按照步骤1.1.7中对hBM-MSCs的描述，将步骤2.1.8制备的GFP-HUVEC储备液以1:66.67的比例加入，使终浓度为1.5 x 105 个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参照步骤1.2.2中缓冲液去除的方法，吸除含有基质细胞单层培养的孔板中的培养基。</li>
	<li>参照步骤1.3中hBM-MSCs的添加方法，每孔加入200 µL步骤2.1.8制备的GFP-HUVEC细胞悬液。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育，每3-4天更换一次培养基。</li>
	<li>根据需要，使用5倍物镜通过明场和荧光显微镜观察培养物的发育情况。共培养第4天或第7天分别用于早期或中期表征分析，或根据实验需求维持培养至相应时间点。</li>
</ol>
3. 表征步骤1：定量分析内皮细胞网络形成
<ol>
	<li>在预定的时间点，使用适合定量的荧光显微镜设置（例如最佳焦距、高对比度和低倍率[如5x]以获得更大的视野）获取GFP-HUVECs的GFP信号。</li>
	<li>对同一天获取的所有图像进行相同的预处理（例如使用Fiji32），以进一步增强对比度。请注意，GFP信号可能随着培养时间延长而变暗；因此，不同天获取的图像可能需要不同的处理方式。
	<ol>
		<li>如果使用Fiji或ImageJ，打开同一时间点的所有GFP通道图像，并打开亮度 &amp;#38; 对比度菜单。选择一个代表中间状态的图像（既非最暗也非最亮的信号），通过点击自动来自动调整对比度。点击设置，并勾选应用到所有其他已打开的图像。</li>
		<li>目视评估自动选定的范围是否适用于当前时间点的所有图像，并根据需要手动重新调整并重新传播至所有图像。</li>
		<li>将调整后的图像保存为TIF文件，并对其他时间点获取的图像重复步骤3.2.1和步骤3.2.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对所有图像应用中值模糊滤波器（例如，对于2048x2048&#160;图像使用半径3&#160;），以避免后续分析中出现伪影识别，从而有助于准确识别网络结构。通过2x2像素合并（binning）减小图像尺寸，并将所有预处理后的图像保存为灰度RGB彩色&#160;TIF文件至一个用于定量分析的文件夹中。这些步骤可手动完成，也可使用作者应要求提供的宏以批处理模式完成。</li>
	<li>使用ImageJ33中的血管生成分析器的批处理模式，分析步骤3.1–3.3创建的文件夹中的所有图像。请注意，根据图像大小和可用工作内存，每张图像的分析可能需要几分钟时间。</li>
	<li>通过检查识别结构与原始图像的叠加图来验证定量结果。如果算法识别出原始图像中仅存在少量或无细胞的人工结构，则应调整预处理参数，重新分析原始图像，或从分析中排除这些有问题的区域和/或重复图像。</li>
	<li>通过将每个样本的数值乘以分析面积与1 mm2的比值，将获得的数值归一化至1 mm2面积。如果使用了不同尺寸的图像，此步骤尤为重要。</li>
	<li>从分析结果中提取多种网络参数，例如总网络长度、节点数量、片段数量、孤立片段数量、分支间隔和平均网孔大小，并利用这些参数表征不同时间点和不同培养条件下内皮细胞网络的特征。</li>
</ol>
4. 表征步骤2：评估细胞外基质沉积
<ol>
	<li>在预定的实验终点，使用免疫荧光法评估细胞外基质（ECM）的沉积。在培养的最后6小时期间，或在固定后（如下所述），向每孔中加入100 µL培养基中含有针对不同ECM分子的一抗。
	<ol>
		<li>在室温下用200 µL/孔的PBS洗涤培养物一次，持续5分钟，并在通风橱中用100 µL/孔的4%多聚甲醛在室温下固定30分钟。请注意，建议同时固定整块板的所有孔，因为此步骤可能对周围培养物造成损伤。固定后，在室温下用200 µL/孔的PBS洗涤三次，每次5分钟，随后在4 °C下用200 µL/孔的PBS保存，或立即进行下一步操作。</li>
		<li>在固定后与针对ECM分子的一抗孵育之前，先用200 µL/孔含1% BSA的PBS作为封闭液，在室温下封闭30分钟。
		<ol>
			<li>吸除封闭液，加入100 µL/孔用含1% BSA的PBS配制的一抗溶液，在4 °C下过夜孵育。在室温下用200 µL/孔的PBS洗涤三次，时间分别为5分钟、至少3小时和5分钟。 
			注意：长时间的洗涤步骤是为了确保未结合的抗体完全从水凝胶中扩散出去。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为了促进包括细胞内复染剂在内的二抗染色液的渗透，根据培养物的细胞密度，在室温下使用含0.3% Triton X-100和1% BSA的PBS处理30–90分钟。 
		注意：对于基于抗体的细胞内分子染色，此步骤应在步骤4.1.2所述的一抗孵育之前进行。</li>
		<li>根据需要配制含有相应二抗和复染剂的二抗染色液（例如，细胞核染料如DAPI，细胞骨架染料如鬼笔环肽-罗丹明）。
		<ol>
			<li>配制染色缓冲液，包含0.1% Triton X-100、1% BSA的PBS，以及复染剂（例如，1 µg/mL DAPI 和 1:4,000 稀释的鬼笔环肽-罗丹明），并按推荐稀释比例加入相应的二抗。</li>
			<li>每孔加入100 µL二抗染色液，在4 °C下过夜孵育。与一抗孵育后的操作类似，在室温下用200 µL/孔的PBS洗涤三次，时间分别为5分钟、至少3小时和5分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为实现结构的三维解析，从玻璃底开始采集共聚焦图像堆栈&#160;，z轴步进为2.5 µm，最终高度达500 µm，&#160;使用&#160;10倍物镜和0.75倍数字放大倍率。在Fiji中生成GFP和F-肌动蛋白信号的三维重建时，应先对每个通道分别进行阈值处理，再生成复合图像，并使用Fiji 3D Viewer进行三维重建。</li>
		<li>为可视化免疫染色中沉积的ECM，采集高度为100 µm、z轴步进为5 µm、使用10倍物镜和1.5倍数字放大倍率的共聚焦图像堆栈。生成最大强度投影，并在Fiji中对每个通道分别调整亮度和对比度后再生成复合图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对细胞外环境进行直接染色。
	<ol>
		<li>向经多聚甲醛固定的孔中加入200 µL/孔的苦味酸天狼星红染色液，在室温下孵育1小时。</li>
		<li>随后用蒸馏水洗涤染色孔五次，接着每天或每隔一天洗涤两次，持续3–4天，同时监测样本颜色的清除情况。在长时间洗涤步骤（即超过6小时）期间，将培养板置于4 °C保存。</li>
		<li>使用配备彩色相机的明场显微镜采集染色样本的图像，并保持各实验条件之间的白平衡一致。为获取样本的整体视图，使用低倍镜（例如2.5倍）扫描整个孔。若显微镜未配备支持自动拼接的软件，则手动完成拼接（例如使用Fiji中的Pairwise Stitching34）。 
		注意：此前用于免疫荧光的孔也可用于此步骤，前提是&#160;已完成荧光图像采集。</li>
		<li>参照步骤4.2.1–4.2.3中所述的苦味酸天狼星红染色步骤，进行茜素红染色、洗涤和成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 表征实验步骤3：通过监测碱性磷酸酶活性评估成骨分化
<ol>
	<li>在不同的培养终点时间点（例如共培养的第4天和第7天），通过以下方法定量评估碱性磷酸酶（ALP）活性：&#160;使用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）/硝基蓝四氮唑（NBT）染色。
	<ol>
		<li>用 200 µL/孔 PBS 洗涤细胞一次，然后加入 BCIP/NBT 底物溶液孵育，该溶液应根据制造商说明书配制。在 37 °C 孵育，同时定期观察显色情况。一旦非成骨条件下开始出现显色，立即用 200 µL/孔 PBS 洗涤一次，随后按照步骤 4.1.1 所述方法用 4% 多聚甲醛固定。</li>
		<li>按照4.2.3节中关于Picrosirius Red染色的方法，获取染色样本的彩色图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在不同的培养终点时间点（例如共培养的第4天和第7天），定量检测细胞裂解液中的碱性磷酸酶（ALP）活性。
	<ol>
		<li>用 200 µL/孔的 PBS 洗涤细胞培养物三次，随后每孔加入 200 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，在 37 °C 下孵育。每隔 10 分钟，通过剧烈吹打上下混匀以促进消化，并使用标准细胞培养显微镜观察细胞形态变化。</li>
		<li>一旦获得无长条状细胞结构的单细胞悬液（通常在20–30分钟后），将样品转移至2 mL离心管中，加入200 µL MSC基础培养基以抑制胰蛋白酶活性，并在500 x g 5分钟离心以沉淀回收的细胞。弃去上清液，将沉淀物在−80 °C冷冻保存，或直接进入步骤5.2.3。</li>
		<li>解冻步骤 5.2.2 中获得的细胞沉淀，加入 500 µL 裂解缓冲液（含 0.56 M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇、0.2% Triton X-100，pH 10），冰上孵育 30 分钟。随后在 16,100 x g 4 °C下离心10分钟，离心后将样品置于冰上。完成5.2.7步骤所述测定后，将样品于−20 °C或−80 °C冻存，或按照5.2.8步骤直接进行DNA定量。 
		注意：裂解缓冲液可预先配制，经无菌过滤后于 4 °C 保存。</li>
		<li>配制碱性磷酸酶（ALP）试剂，包含20 mM对硝基苯磷酸二钠盐六水合物和4 mM MgCl₂2 在裂解缓冲液中。 
		注意：最好在定量当天新鲜配制此溶液。</li>
		<li>在不扰动任何已沉淀的残渣的情况下，将步骤5.2.3中制备的细胞裂解液上清液各50 µL，以复孔形式加入标准透明组织培养96孔板的孔中。另取两个孔加入裂解缓冲液作为空白对照。</li>
		<li>使用多通道移液器，向5.2.5步骤中已加样的孔中每孔加入50 µL ALP试剂。轻轻振荡酶标板，于37 °C避光孵育10分钟。碱性磷酸酶（ALP）活性较高的孔会呈现黄色。使用多通道移液器向每孔加入100 µL 1 M NaOH以终止反应。</li>
		<li>使用酶标仪在410 nm处读取光密度值。取技术重复样的平均值，并减去空白对照样的平均值。</li>
		<li>进行DNA定量，以根据总细胞数对之前步骤中测定的碱性磷酸酶（ALP）活性进行归一化。此处描述一种基于荧光检测的方法，但任何其他适用于细胞裂解液中DNA定量的方法均可与本实验兼容。根据制造商说明书，使用市售试剂盒配制DNA定量所需的试剂和DNA标准品。 
		注意：建议使用裂解缓冲液来制备DNA标准品。</li>
		<li>如果用于5.2.3步骤中ALP定量的样品已被冷冻，则将其解冻后，在16,100 x g 在 4 °C 条件下离心 2 分钟，然后将样品置于冰上。避免扰动任何沉淀的碎片，将 50 µL 细胞裂解液上清液一式两份加入黑色 96 孔板的孔中。将样品在 −20 °C 或 −80 °C 冻存，必要时重复 ALP 和 DNA 定量检测。一式两份加入 DNA 标准品。</li>
		<li>使用多通道移液器加入50 µL DNA染色剂，按照试剂盒说明书进行孵育，然后检测荧光强度。根据标准曲线数值，确定并应用所测得的荧光强度值向DNA浓度的转换。</li>
		<li>将步骤5.2.7中获得的ALP值除以各样本相应的DNA浓度进行归一化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 应用1：进行药物敏感性检测
<ol>
	<li>当内皮细胞网络完全形成后（通常在基质细胞-内皮细胞共培养的第4天），在新鲜培养基中加入抗血管生成化合物（如贝伐珠单抗），并在不同时间和条件下测试其活性（例如，不同浓度的FGF-2或BMP-2）。
	<ol>
		<li>配制新鲜培养基，其中包含此前各培养体系所使用的相同生长因子。
		<ol>
			<li>配制对照溶液，其成分为目标化合物的溶剂（例如，贝伐珠单抗的溶剂：60 mg/mL α-海藻糖二水合物、0.4 mg/mL Tween20、5.8 mg/mL 磷酸二氢钠一水合物，以及1.2 mg/mL 无水磷酸氢二钠），并进行无菌过滤。</li>
			<li>将目标化合物以所需浓度（例如，10 µg/mL 贝伐珠单抗）加入实验组培养基中，同时在对照组培养基中加入等体积的对照溶液。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除原有培养基，每孔加入200 µL在步骤6.1.1中 freshly prepared 的培养基。根据待测化合物的特性孵育适当时间（例如，贝伐珠单抗孵育2天）。监测培养过程，并按照第3节所述方法对内皮细胞网络进行表征。利用GFP图像及步骤3.7中所述分析所提取的定量网络参数，评估该化合物在抑制血管生成或破坏已形成结构方面的有效性。</li>
</ol>
7. 应用2：建立包含多种癌细胞类型的高级共培养系统
<ol>
	<li>在共培养的第4天，当内皮细胞网络基本形成后，向培养物中加入其他细胞类型（如MDA-MB-231或U2OS癌细胞），并更换为新鲜培养基。
	<ol>
		<li>根据制造商说明书，使用适用于活细胞的荧光染料对癌细胞进行标记，以便在共培养体系中将其与GFP标记的HUVECs及未标记的hBM-MSCs区分开来。</li>
		<li>将癌细胞重悬于新鲜培养基中，细胞浓度为1.5 × 104 cells/mL&#160;，培养基中应含有此前各培养阶段所使用的相同生长因子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要监测培养物的发育情况及癌细胞的定位。 
	注意：根据癌细胞类型、活性及微环境的不同，癌细胞可能需要数天时间才能到达间质-内皮细胞共培养体系中的血管结构（例如MDA-MB-231和U2OS约需2天）。因此，应据此合理安排延时成像的时间，以可视化观察癌细胞与血管细胞之间的相互作用。</li>
</ol>

3D Co-Culture Assay: Vascularized Osteogenic Niches for Cancer Drug Screening

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<li>Loebel, C., Mauck, R. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+nascent+protein+deposition+and+remodelling+guide+mesenchymal+stromal+cell+mechanosensing+and+fate+in+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels.</a> Nature Materials. 18 (8), 883-891 (2019).</li>
<li>Curtis, M. B., Kelly, N., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+stromal+cells+impact+endothelial+cell+transcriptome+in+3D+microvessel+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Organotypic stromal cells impact endothelial cell transcriptome in 3D microvessel networks.</a> Scientific Reports. 12 (1), 20434(2022).</li>
<li>Wust, R., Terrie, L., Muntefering, T., Ruck, T., Thorrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+co-isolation+of+microvascular+endothelial+cells+and+satellite+cell-derived+myoblasts+from+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient co-isolation of microvascular endothelial cells and satellite cell-derived myoblasts from human skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 964705(2022).</li>
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Ectica Technologies AG 是 3DProSeed 水凝胶培养板的制造商，并拥有商业利益。Benjamin R. Simona 和 Martin Ehrbar 是 Ectica Technologies AG 的股东。

在此，我们描述了一种建立 体外 一种完全合成且可调控的基于聚乙二醇（PEG）的三维基质模型，用于构建高度血管化的骨及骨髓微环境，在骨与骨髓生物学研究、组织工程及癌症研究中具有广泛应用。该模型基于一种功能化修饰了RGD肽段和基质金属蛋白酶（MMP）可切割位点的合成PEG水凝胶，并在玻璃底96孔成像板上构建成具有深度密度梯度的结构。30该即插即用型平台可实现高度互连的三维细胞网络构建，且无需将细胞包埋于水凝胶中。与前述的细胞包埋方法类似，在本研究中，我们展示了细胞自身分泌的细胞外基质对基质材料的重塑作用28 以创建细胞类型特异性的微环境。因此，利用该方法可在高度可重复的类器官三维培养条件下，轻松进行药物筛选实验和高内涵分析。玻璃底96孔板和光学透明水凝胶使该平台可与液体处理自动化系统和高通量显微镜兼容。
生成成骨性血管化骨髓微环境的第一步是将人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs）在PEG水凝胶上进行至少3天的预培养。在此期间，细胞会附着于水凝胶表面，穿透其内部，并开始形成细胞间连接以及细胞外基质（ECM）的沉积。在接种hBM-MSCs之前，必须去除保存液。由于水凝胶位于96孔成像板标准孔内的内层小室中，因此可安全地将吸液针沿孔壁插入，直至接触内层小室的环形边缘。若使用真空泵进行吸液，应将其吸力调至最低。或者，也可使用自动板式洗板机，将喷嘴高度调整至高于内层小室环至少0.8 mm，以从水凝胶板中移除缓冲液。采用自动化液体处理可最大限度减少对水凝胶表面的损伤，从而提高后续培养结果的可重复性。当细胞在水凝胶上沉降后，水凝胶表面的微小缺陷将变得可见，并在焦平面较低的位置呈现出缺陷区域的形貌。因此，在第0天获取参考图像，可作为细胞接种均匀性和水凝胶表面完整性的良好质量控制手段。尽管微小的水凝胶表面缺陷并不妨碍该孔的后续使用，但细胞倾向于在缺陷区域聚集，可能形成非典型的生长模式，或更快地到达底部玻璃表面，并在该处形成单层生长。在使用或评估这些孔时，必须记录此类人为假象。在整个实验过程中进行的任何换液操作均需遵循类似的注意事项。
实验方案的第二步是在已形成的hBM-MSC单层培养物中加入GFP-HUVECs（共培养的第0天）。hBM-MSC沉积的细胞外基质（ECM）为内皮细胞的生长提供了良好的支架；在本研究中，即使存在hBM-MSC条件培养基，内皮细胞在水凝胶上也只能形成圆形的细胞簇（未展示）。接种后&#160;在hBM-MSC培养物中，HUVECs整合并形成微血管样结构，其形态与通过细胞包封法构建的共培养体系中所观察到的结构相似27,28通常，在共培养4天后即可形成发育良好的三维微血管样网络，并可通过表达GFP的HUVECs进行长期动态监测。这些结构在体外培养中可维持至少7天，因此有充足的时间观察血管网络结构在不同处理条件下的变化，例如用于抗血管生成药物的筛选。内皮网络的形态学特征可通过成熟的图像分析工具（如对GFP图像进行分割）以批量模式进行量化分析。 血管生成分析仪 ImageJ 插件33，其参数可用于评估药物疗效和药效动力学等指标。
对于许多潜在应用而言，所述细胞模型的一个显著优势在于其可塑性。只需在培养基中添加不同的生长因子，即可改变共培养体系的形态。例如，在单层培养和共培养期间持续存在BMP-2时，会形成成骨性血管微环境，表现为碱性磷酸酶（ALP）活性增强、细胞外钙沉积增加，以及细胞外基质（ECM）的组装与沉积。相反，在存在FGF-2的情况下，成骨标志物消失，共培养体系形成的侧向细胞连接较少，但表现出更明显的三维细胞生长。FGF-2抑制ALP活性而BMP-2相较于无生长因子处理组能更强地诱导ALP活性，这一现象与先前的研究结果一致27。然而，尽管人骨髓间充质干细胞（hBM-MSC）基质成分存在显著差异，在本研究中，两种生长因子处理条件下的微血管网络形成程度却非常相似。在对照培养中，仅形成少量短小的血管样结构，可能代表一种血管化程度较低的骨髓微环境。这表明，通过简单地改变添加至培养基中的生长因子种类、浓度及添加时机，即可构建一系列定义明确的血管化骨髓微环境，适用于比较研究。然而，为确保结果的可重复性，需注意培养进程和形态可能受所用细胞传代历史的影响（例如常规培养维护过程中的传代次数和消化分离方法），因此在实验设计中应控制此类因素。
在此，作为该模型的首个应用，我们展示了工程化微血管网络对10 µg/mL贝伐珠单抗处理的敏感性。值得注意的是，必须确认所使用的算法能够准确识别内皮网络，因为在网络发育不良的图像中常常会产生伪影。若存在此类情况，则需要对图像处理过程中（分割前及分割期间）所用的参数进行精细调整，通常需通过反复试验来实现。
作为第二个应用，我们介绍一种通过依次接种间充质细胞、内皮细胞和癌细胞而构建的高级共培养模型。该模型可用于研究癌细胞、骨髓基质及脉管系统之间的相互作用，这些因素可能在转移过程中发挥重要作用。此外，该模型还可用于药物筛选以及靶点不限于血管生成的化合物测试。
在二维培养中，细胞无法接收到生理性的微环境信号，不能获得自然状态下的细胞形态，因此其分化方式与天然三维环境中的细胞存在差异35。当在工程化的三维水凝胶中培养时，细胞会早期分泌固有的细胞外基质（ECM），从而提供黏附位点，并可被主动重塑28,36。本研究中，为建立适用于筛选应用的简化三维模型，将成血管细胞接种于工程化水凝胶表面，在无灌注条件下使其形成血管网络。基于成像的评估基于参与血管结构形成的内皮细胞的二维投影进行。然而，只有共聚焦图像揭示了BMP-2刺激样本中三维血管网络的侵入生长程度较FGF-2刺激样本更弱。这表明，所形成血管结构的长度被低估，而其连通性则被高估。此外，尚未研究周细胞与内皮细胞之间的相互作用以及血管腔的形成。这些方面，特别是在药物处理反应方面的研究，仍需进一步关注。最后，若能优化实验方案，先建立广泛的三维血管网络，再诱导其成骨分化，将有助于构建更接近生理状态的骨组织和骨髓模型。
总体而言，本文所介绍的模型具有高度的多功能性，可轻松针对特定应用进行调整。例如，可使用来自不同来源的间充质细胞和内皮细胞。已知脂肪组织来源的间充质干细胞（MSCs）和脐带来源的MSCs表达的促血管生成因子与骨髓来源的MSCs（BM-MSCs）不同，因此可作为替代的基质成分轻松替换37。也可使用从已明确界定的骨髓微环境中分离出的内皮细胞，替代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。此外，还可利用患者来源的、配对的骨髓间充质细胞和内皮细胞建立共培养体系，用于个体化医学应用，这一点在近期关于血管化肌肉共培养的研究中已有建议38。此外，水凝胶板的设计允许通过明场和荧光显微镜对培养过程进行纵向监测，从而让用户可根据具体应用灵活缩短或延长培养时间。或者，也可相应调整接种时的细胞密度，以加快或延缓细胞网络的形成，从而适应比本方案中所述更短或更长的观察周期。但无论何种情况，均需谨慎操作，避免细胞过度生长形成片状结构，否则可能导致水凝胶收缩并最终引起细胞脱落。
最后，可利用该模型开展多种多样的检测。除了在活细胞或固定后的培养物中进行免疫荧光和显微镜观察外，还可通过酶解消化三维培养物，回收细胞并用于各类生化检测。本文展示了使用比色/荧光法测定细胞裂解液中的碱性磷酸酶（ALP）活性和DNA含量，但该系统同样适用于其他多种技术，包括PCR、RNA测序（RNAseq）和蛋白质组学分析。若目标检测的灵敏度要求不高，可合并多个孔的样品以增加可用于检测的样本量。若特定应用需要更快的凝胶溶解，可在使用较小体积消化液的同时对培养板进行轨道振荡，以确保孔内形成涡流，前提是整块板的所有孔均以该方式处理（活细胞培养物对这类剧烈操作较为敏感）。综上所述，本文所呈现的实验方案若按所述方法操作，可确保生成 体外 一种能够重现成骨性血管微环境关键特征的模型，且具有足够的灵活性，可针对定制化应用进行修改。

骨骼和骨髓是结构和功能上高度复杂的器官，在人类健康中起着核心作用。这一点体现在存在多种不同的微环境，这些微环境调控着造血过程以及骨骼的维持1。目前普遍认为，在健康的骨髓中，造血干细胞和骨骼干细胞及其子代细胞的维持与扩增均由特定的微环境所调控。这些微环境包含多种细胞类型，如成骨谱系细胞、间充质干细胞、内皮细胞和血管周围细胞、神经元和胶质细胞、脂肪细胞、破骨细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞2。毫不奇怪的是，这些主要与血管相关的微环境也参与了多种类型白血病的发生发展3，并成为多种癌症转移的靶部位4。由于骨相关血管在骨形成、骨重塑以及骨（髓）维持中具有特殊功能，其结构具有高度特异性，不同于体内其他部位的血管系统5,6,7。因此，全身应用的抗血管生成药物或血管调节药物在这些特化的微环境中可能产生不同的效应8。因此，建立用于研究维持骨骼和骨髓生理特性、骨与骨髓再生过程以及对治疗干预反应的分子机制的模型具有重要意义。
传统的二维（2D）组织培养以及利用动物模型进行的体内研究，已为深入了解不同细胞及分子在骨和骨髓发育过程中的作用提供了宝贵的信息9,10。能够使用相关人类细胞进行高通量实验的模型，有望增进我们对如何调控这些高度复杂系统中特定参数的理解。
在过去十年中，组织工程学原理已被用于构建三维组织模型11,12这些方法主要依赖于将与组织相关的细胞包封到生物材料中，以建立三维单培养或共培养体系。13在最常用的生物材料中，纤维蛋白是其中之一14胶原蛋白15，和 Matrigel16,17，这些材料均具有高度生物相容性，可为多种细胞类型的生长提供适宜条件。这些生物材料能够形成 体外 能够重现不同血管微环境关键特征的模型 体内18此外，利用微流控装置构建灌注血管化的骨组织和骨髓模型，已促进了 体外 更复杂的模型19,20,21,22.
天然生物材料在组成控制和性能设计方面的困难，促使人们开发出可合理设计的合成类似物，使其具备可预测的物理、化学和生物学特性23,24。我们开发了完全合成的凝血因子XIII（FXIII）交联聚乙二醇（PEG）水凝胶，该材料通过功能化修饰RGD肽段和基质金属蛋白酶（MMP）可切割位点，以促进细胞黏附与基质重塑25,26。这些生物材料的模块化设计已成功应用于优化三维血管化骨及骨髓模型的构建条件27,28。
为了测试更多不同培养条件和新疗法，需要具有更高通量能力的模型。我们最近的研究表明，可通过电化学过程调控PEG水凝胶中FXIII的交联，从而形成深度方向上的水凝胶硬度梯度29。当细胞接种于此类水凝胶表面时，会向内部迁移，并逐渐发育成高度互连的三维细胞网络30。该方法无需将细胞包埋于水凝胶内部（这是其他三维支架通常所需的操作），不仅简化了实验设计，还允许在不同时间点依次添加不同类型的细胞，从而构建复杂的共培养系统。这些水凝胶可预先浇铸在玻璃底96孔成像板上，使得三维培养既可通过手动操作也可通过自动化细胞接种方案实现。PEG水凝胶的光学透明性使该平台适用于显微成像。
在此，我们介绍一种在该环境中生成和表征血管化成骨微环境的简便方法&#160;即用型合成即插即用平台。我们证明，使用一种常用于诱导血管网络形成的生长因子可促进血管网络的发育 体外 成骨作用、骨形态发生蛋白-2（BMP-2），而补充成纤维细胞生长因子2（FGF-2）可抑制成骨分化27,31与 FGF-2 刺激形成的网络相比，这些网络在整体形态以及细胞和细胞外基质（ECM）分布方面均存在差异。此外，我们采用碱性磷酸酶作为标志物，监测成骨诱导过程。我们展示了该标志物随时间推移表达水平的升高，并通过定性和定量方法将其表达水平与 FGF-2 刺激的网络进行比较。最后，我们验证了该模型所生成的微环境在两种潜在应用中的适用性。首先，我们通过向已形成的微环境中添加贝伐珠单抗并监测血管网络在其存在下的降解情况，进行了概念验证性的药物敏感性检测。其次，我们将 MDA-MB-231 乳腺癌细胞和 U2OS 骨肉瘤细胞添加至已形成的成骨微环境中，证明该微环境可用于研究肿瘤细胞与其周围环境之间的相互作用。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基-2-甲基-1-丙醇</td><td>Sigma</td><td>A9199</td><td></td></tr><tr><td>3DProSeed 水凝胶孔板</td><td>Ectica Technologies</td><td>ECT.PS1.001.096</td><td></td></tr><tr><td>4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物</td><td>Sigma</td><td>71768</td><td></td></tr><tr><td>茜素红 S</td><td>Sigma</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>抗胶原蛋白 IV 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6311</td><td></td></tr><tr><td>抗层粘连蛋白 1+2 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab7463</td><td></td></tr><tr><td>自动板式洗板机</td><td>Agilent Biotek</td><td>EL&amp;chi;50</td><td></td></tr><tr><td>自动洗板/分液仪</td><td>Agilent Biotek</td><td>MULTIFLO FX 配备 5 µL 蠕动泵盒</td><td></td></tr><tr><td>贝伐珠单抗</td><td>Evidentic</td><td>ID PS-E07-2019-00119 A009</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2</td><td>Peprotech</td><td>120-02C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td>用于在 ALP 分析期间以 16100 × g 离心 2 mL 管</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica</td><td>Stellaris 5</td><td></td></tr><tr><td>锥形 50 mL 离心管</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 649 驴抗兔 IgG（最小交叉反应性）抗体</td><td>Biolegend</td><td>406406</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 649 羊抗小鼠 IgG（最小交叉反应性）抗体</td><td>Biolegend</td><td>405312</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白（IST-9）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-59826</td><td></td></tr><tr><td>GFP-HUVECs</td><td>PELOBiotech</td><td>PB-CAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>hBM-MSCs</td><td>-</td><td>-</td><td>在巴塞尔大学医院分离；Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, 等. 在直接灌注条件下利用三维支架系统从新鲜骨髓中扩增人源间充质基质细胞. PLoS One. 2014;9(7):e102359</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td>200M</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 乳腺癌细胞系</td><td>-</td><td></td><td>由纪念斯隆-凯特琳癌症中心的 J Massagu&amp;eacute; 惠赠</td></tr><tr><td>MEM&amp;alpha;</td><td>Gibco</td><td>22571-038</td><td></td></tr><tr><td>多功能成像读板仪</td><td>Agilent Biotek</td><td>Cytation 1</td><td>用于自动成像</td></tr><tr><td>多功能成像读板仪 - 荧光和吸光度检测</td><td>Agilent Biotek</td><td>Cytation 5</td><td>用于在 ALP 分析中测量吸光度和荧光强度</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Artechemis</td><td>US 040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽-罗丹明</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>苦味酸-天狼星红溶液</td><td>Abcam</td><td>ab246832</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 定量检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>重组抗胶原蛋白 I 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab260043</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST BCIP/NBT</td><td>Sigma</td><td>B5655-25TAB</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>1064981000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠，无水</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物</td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>U2OS 骨肉瘤细胞系</td><td>-</td><td></td><td>由苏黎世生物力学研究所 J Snedeker 惠赠&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-海藻糖二水合物</td><td>Sigma</td><td>90208</td><td></td></tr></tbody></table>

利用预铸聚乙二醇（peg）水凝胶在成像微孔板中简便构建血管化成骨骨髓微环境

Simple Establishment of a Vascularized Osteogenic Bone Marrow Niche Using Pre-Cast Poly(ethylene Glycol) (PEG) Hydrogels in an Imaging Microplate

骨骼和骨髓是高度血管化的结构复杂的器官，也是癌症和转移灶形成的部位。体外模型若能模拟包括血管化在内的骨骼及骨髓特异性功能，并适用于药物筛选，则具有重要价值。此类模型可弥合结构无关、过于简化的二维（2D）体外模型与成本较高、伦理挑战较大的体内模型之间的差距。本文介绍一种基于工程化聚乙二醇（PEG）基质的可控三维（3D）共培养检测方法，用于构建具有血管化的成骨性骨髓微环境。该PEG基质设计可通过简单的细胞接种步骤实现3D细胞培养，无需包封，从而支持复杂共培养系统的建立。此外，基质透明且预先浇铸于玻璃底96孔成像板上，使该系统适用于显微镜观察。在本检测中，首先培养人骨髓来源的间充质基质细胞（hBM-MSCs），直至形成充分发育的3D细胞网络。随后加入表达GFP的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。通过明场和荧光显微镜观察培养过程的发展。hBM-MSC网络的存在支持了血管样结构的形成，而这些结构若无此网络&#160;则无法形成，并且可保持稳定至少7天。血管样网络形成的程度可轻松定量。通过在培养基中添加骨形态发生蛋白2（BMP-2），可将该模型调节为成骨性骨髓微环境，BMP-2可促进hBM-MSCs的成骨分化，这一点在共培养第4天和第7天碱性磷酸酶（ALP）活性升高时得到验证。该细胞模型可作为平台用于培养多种癌细胞，并研究它们与骨骼及骨髓特异性血管微环境之间的相互作用。此外，该系统适用于自动化和高内涵分析，意味着可在高度可重复的培养条件下进行抗癌药物筛选。

通过将人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs）和表达绿色荧光蛋白的人脐静脉内皮细胞（GFP-HUVECs）依次接种到96孔成像板中预先制备的具有刚度梯度的聚乙二醇（PEG）基水凝胶上，建立血管微环境共培养体系（图1）。利用活细胞落射荧光显微镜对培养体系进行长期动态监测，并在选定的时间点进行进一步表征。通过直接染色和基于抗体的染色方法评估细胞外基质成分。从构建的微环境中回收细胞并裂解后，定量检测碱性磷酸酶（ALP）活性。此外，我们还展示了该平台适用于抗血管生成药物敏感性检测，并可作为肿瘤共培养模型的基础。
通过将3 × 104个细胞/孔接种于无生长因子培养基中，或在含50 ng/mL FGF-2或BMP-2的培养基中，建立hBM-MSCs与表达GFP的HUVECs的共培养体系，具体操作如实验方案所述。从早期时间点起，明场图像及仅显示GFP-HUVECs的荧光图像中均可观察到不同培养条件之间的差异（图2A）。通过纵向观察相同区域，可发现培养体系发育过程中的差异，例如在FGF-2存在条件下发育更快。通常情况下，无任何生长因子的培养体系发育程度较低，两种细胞的铺展数量均较少，并可见无细胞区域。相比之下，明场图像显示，在BMP-2存在条件下形成的细胞层最为致密。然而，血管样网络在含有任一生长因子的条件下均能形成，其中以FGF-2条件下的网络最为广泛且相互连接。这些观察到的差异也可通过ImageJ的Angiogenesis Analyzer进行量化分析。事实上，总网络长度在FGF-2存在时最高，而在无生长因子时最低（图2B）。网络中代表分支点的节点数量变化趋势与总长度一致（图2C）。相反，两种含生长因子的条件中孤立片段数量均显著少于无生长因子条件，表明其具有更高的连通性（图2D）。此外，三维共聚焦成像显示，在FGF-2刺激条件下，内皮细胞在深度方向上的渗透能力更强（图2E）。
在添加FGF-2或BMP-2的条件下，hBM-MSC/GFP-HUVEC共培养体系维持培养7天，随后进行固定并针对细胞外基质（ECM）成分染色。经免疫细胞化学染色并结合共聚焦激光扫描显微镜观察，结果显示不同生长因子添加条件下，培养物的形态存在显著差异（图3A）。在FGF-2存在时，培养物形成致密的微血管样结构，其中内皮细胞和间充质细胞均较密集；而在BMP-2存在时，hBM-MSCs分布范围更广，表现为F-actin阳性且GFP阴性的区域更为广泛。纤维连接蛋白和I型胶原蛋白的分布模式相似，而层粘连蛋白和IV型胶原蛋白则更集中于内皮结构周围。然而，与BMP-2相比，FGF-2存在时这些蛋白在内皮结构周围的富集程度更为明显。除抗体染色外，还进行了直接显色染色以评估ECM的整体纤维化状态（Picrosirius Red染色；图3B）以及ECM上钙沉积情况（Alizarin Red染色；图3C），用于分析所形成微环境的特性。在BMP-2培养的微环境中，Picrosirius Red染色更强且分布更广泛，Alizarin Red染色也呈现相同趋势。
接下来，通过检测碱性磷酸酶（ALP）活性作为早期成骨标志物，对培养物的成骨潜能进行表征。在共培养的第4天和第7天，通过胰蛋白酶消化水凝胶从微环境中回收细胞。为了定量ALP活性，裂解回收的细胞并进行对硝基苯磷酸（pNPP）显色测定。所得数值根据每个样品的总DNA含量进行归一化，以校正不同条件下细胞数量可能存在的差异。事实上，可观察到各条件下DNA含量存在微小差异，其中未添加任何生长因子的条件回收的细胞数量最少（未显示）。然而，归一化后的ALP活性在不同条件下差异显著，随着BMP-2浓度升高，ALP活性呈上升趋势，并在100 ng/mL时达到平台期（图4A、B）。含有50 ng/mL FGF-2的条件表现出最低的ALP活性。尽管在两个时间点均观察到相似的趋势，但所有条件下的ALP活性均从第4天到第7天显著升高。除了定量测定外，还可利用BCIP/NBT底物转化进行直接显色染色，对ALP活性进行定性观察。与FGF-2相比，BMP-2存在时可观察到更广泛且更深的紫色染色信号（图4C）。
为了展示所表征的成骨微环境的两种潜在应用，我们进行了概念验证性的药物敏感性研究以及肿瘤共培养实验。在药物敏感性检测中，将贝伐珠单抗或由贝伐珠单抗制剂稀释液组成的对照溶液加入含有新鲜BMP-2的培养基中。在第4天，当50 ng/mL BMP-2存在条件下已形成稳定的网络结构时，在常规换液过程中加入对照溶液或含贝伐珠单抗的培养基，并通过荧光成像对培养物进行监测。图5A、B显示，添加10 µg/mL贝伐珠单抗后，先前形成的网络出现回缩或消退，而对照组在换液后2天仍保持广泛的网络结构。这些变化还可通过每日采集的荧光图像，利用ImageJ中的Angiogenesis Analyzer插件追踪网络总长度进行量化分析（图5C）。此外，也可从共培养开始时即加入贝伐珠单抗或其他任何化合物，以评估其对网络形成的影响。以贝伐珠单抗为例，其可完全抑制内皮网络的形成（未展示）。
在第二次应用中，将 MDA-MB-231 乳腺癌细胞或 U2OS 骨肉瘤细胞以每孔 1.5 × 103 个细胞的密度接种至第 4 天的共培养体系中，培养基为含有 50 ng/mL BMP-2 的新鲜培养液。为了将这些癌细胞与表达 GFP 的 HUVECs 以及未标记的 hBM-MSCs 区分开，在接种到成骨微环境之前，先用 CellTrace FarRed 对癌细胞进行孵育标记。通过荧光显微镜对培养物进行监测；在初期，大多数癌细胞位于支架表面附近，但在 2 天后，它们更接近含有血管共培养层的区域。因此，选择第 2 天作为延时显微成像的起始时间点，以展示癌细胞与血管微环境中细胞之间相互作用的动态过程。有趣的是，MDA-MB-231 细胞既表现出向内皮结构靠近的行为，也表现出远离内皮结构的运动，提示其可能正在探测或重塑周围微环境（图 5D）。利用 CellTrace FarRed 标记癌细胞，GFP 标记 HUVECs，并结合 F-actin 的额外染色，可通过共聚焦激光扫描显微镜清晰区分所有细胞类型（图 5E）。
<img alt="三维基质-内皮共培养示意图；细胞外基质沉积的显微观察；内皮网络分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：构建血管化成骨微环境的简易方法。 具有深度刚度梯度的预制合成水凝胶可实现无需直接包埋的顺序接种细胞，从而建立三维共培养体系。人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs）先预培养3天，随后加入表达绿色荧光蛋白（GFP）的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。通过连续采集明场和GFP信号对培养过程进行动态监测。在特定时间点，进一步评估微环境中的细胞外基质（ECM）沉积情况及成骨状态。碱性磷酸酶活性通过直接显色染色法检测，并通过从微环境中回收细胞后对细胞裂解液进行对硝基苯磷酸酯（pNPP）比色分析加以验证。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="体外血管生成、显微镜图像、图表；FGF-2、BMP-2 对 HUVEC 细胞作用 6 天。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用 FGF-2 或 BMP-2 刺激形成类血管网络。（A）在共培养的第 2 天、第 4 天和第 6 天，采集在无生长因子、含 FGF-2 或含 BMP-2（均为 50 ng/mL）条件下培养的细胞的明场和荧光（GFP）图像。比例尺：400 µm。（B–D）使用 ImageJ 的 Angiogenesis Analyzer 分析共培养第 4 天采集的 GFP-HUVEC 网络图像所得的量化参数。数据以均值 ± 标准差表示。统计分析使用 GraphPad Prism 9.5.1 进行，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Dunnett 多重比较检验，n ≥ 4；* P &lt; 0.05；** P &lt; 0.01；*** P &lt; 0.001。（E）基于共聚焦图像堆栈（总高度：547.5 µm；z 步进：2.5 µm）生成的 GFP 和 F-actin 信号的三维重建图像，分别对应 FGF-2 刺激（上排）和 BMP-2 刺激（下排）条件。比例尺：300 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="FGF-2 和 BMP-2 处理下细胞外基质的荧光显微镜观察；ECM、胶原蛋白、蛋白质分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：BMP-2 诱导人骨髓间充质干细胞（hBM-MSC）的去局域化铺展及细胞外基质（ECM）沉积。 （A-C）在含有 FGF-2 或 BMP-2 的条件下培养 7 天的共培养体系接受了（A）免疫荧光染色或（B、C）直接显色染色。（A）对 F-肌动蛋白以及细胞外基质蛋白纤维连接蛋白（fibronectin）、层粘连蛋白（laminin）、I 型胶原（collagen I）和 IV 型胶原（collagen IV）进行染色。图像显示共聚焦图像堆栈的最大强度投影（总高度：100 µm；z 步进：5 µm）。比例尺：200 µm。（B、C）使用（B）苦味酸天狼星红（Picrosirius Red）和（C）茜素红（Alizarin Red）对培养物进行染色。上排图像为在 2.5 倍放大下获取的拼接全孔概览图（比例尺：1,000 µm），下排图像为在 5 倍放大下获取的单个视野图像（比例尺：400 µm）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用生长因子 FGF-2 和 BMP-2 进行 ALP 归一化分析的柱状图和显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：通过直接显色染色法对 BMP-2 诱导的 ALP 活性进行生化评估。（A、B）在无生长因子、含不同浓度 BMP-2 或含 50 ng/mL FGF-2 的培养条件下，分别共培养（A）4 天或（B）7 天后，测定细胞裂解液中的 ALP 活性。ALP 活性数据已根据各裂解样品的 DNA 含量进行归一化处理。数据以均值 ± 标准差表示。统计分析使用 GraphPad Prism 9.5.1 进行；采用普通单因素方差分析（one-way ANOVA），并结合 Dunnett 多重比较检验，n = 5；**** P &lt; 0.0001。（C）在含 50 ng/mL FGF-2 或 BMP-2 的条件下共培养 7 天后，对类器官中 ALP 活性进行直接显色染色。左侧图像为 2.5 倍放大倍数下拍摄图像拼接而成的整孔概览图（比例尺：1,000 µm），右侧图像为 5 倍放大倍数下单个视野图像（比例尺：400 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血管生成抑制研究；荧光显微镜；GFP-HUVECs；贝伐珠单抗效应；癌症检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：在高级癌症模型中使用成骨性、血管化微环境。 （A）在BMP-2存在条件下共培养的细胞，在共培养第4天成像以观察GFP信号，随后分别加入对照溶液（左）或10 µg/mL贝伐珠单抗（右）处理2天，之后再次成像（共培养第6天）。比例尺：600 µm。（B）显示的是经贝伐珠单抗处理的培养物在（A）中的高倍放大图像。比例尺：250 µm。（C）使用ImageJ中的Angiogenesis Analyzer对（A）所示内皮网络的总长度进行定量分析，数据来自每日采集的图像；n ≥ 3。（D）将CellTrace FarRed标记的MDA-MB-231乳腺癌细胞加入到在BMP-2存在下培养4天的共培养体系中，并在癌细胞加入后2天开始采集延时图像。比例尺：100 µm。（E）对如（D）所述构建的三重共培养体系进行固定并用F-actin染色后，获取共聚焦图像堆栈的最大强度投影（总高度：70 µm；z步进：2.4 µm）。左图：含MDA-MB-231乳腺癌细胞的微环境；右图：含U2OS骨肉瘤细胞的微环境。左侧图像比例尺：200 µm；右侧图像比例尺：50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

一个 体外 通过将间充质细胞和内皮细胞接种到预先制备的三维聚乙二醇水凝胶上，建立骨髓血管微环境模型。该微环境中的内皮网络、细胞外基质成分以及碱性磷酸酶活性会因所使用的生长因子不同而发生变化。该平台可用于构建高级癌症模型。

关键词：骨髓血管微环境，间充质细胞，内皮细胞，三维聚乙二醇水凝胶，内皮网络，细胞外基质，碱性磷酸酶活性，生长因子，癌症模型

利用预铸聚乙二醇（PEG）水凝胶在成像微孔板中简便构建血管化成骨骨髓微环境

骨与骨髓是高度血管化且结构复杂的器官，也是癌症及转移灶形成的常见部位。体外模型……

大多数体外无血管化研究使用天然来源的基质。尽管这类基质通常对生物过程具有很强的促进作用，但其固有的生物活性使得研究单个参数的影响变得复杂。在此，我们可以选择性地添加感兴趣的因子，并评估系统如何发生变化。在我们的空白合成水凝胶上依次接种细胞，可实现高度明确的微环境形成。在此过程中，人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs）定植于水凝胶并沉积其内源性细胞外基质，从而为后续接种的内皮细胞提供基底。这一特性在其他三维体外模型中并不常见。能够依次添加不同类型的细胞，使得构建具有高度复杂性且适用于高通量筛选的体外模型成为可能。这些模型可被进一步优化，以生成更特异的成骨性血管化微环境，并用于研究细胞和分子因子的功能。首先，取一管人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs），通过离心形成细胞沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于适量的基础培养基中。随后，准备含有相应体积基础培养基的50 mL锥形离心管，并加入相应的生长因子。最后，将储备液中的hBM-MSCs以1:66,67的比例稀释，使其浓度达到每毫升1.5 × 10⁵个细胞。移除覆盖在96孔水凝胶板上的聚丙烯粘性薄膜，以进行细胞接种。将吸液管尖端紧贴孔壁，缓慢向内孔边缘移动，小心吸除覆盖在水凝胶表面的保存缓冲液。接种时，需定期混匀细胞悬液以保持其均匀性，并向每孔中加入 200 µL 细胞悬液。随后，在37°C、5%二氧化碳及湿润的环境中培养细胞。或者，可使用自动洗板机，将吸液针头设置在距离板架至少3.8 mm处，并靠近孔的边缘，吸除保存缓冲液。通过血清学移液管将细胞混匀，并向培养板的各孔中加入等量细胞。使用5倍物镜通过明场显微镜监测培养物的发育情况，并在接种后约30分钟采集参考图像，以评估所添加的细胞数量。首先，取融合度为80%至100%的GFP-HUVECs细胞沉淀，用适量基础培养基重悬细胞，制备成浓度为1 × 10^7 个细胞/mL的储备液。准备50 mL锥形离心管，加入所需体积的基础培养基，并补充相应的生长因子。将储存的GFP-HUVECs按1:66,67的比例稀释，使其终浓度为每升1.5 × 10⁵个细胞。随后吸除基质细胞单层培养板中的培养基，每孔加入200 μL上述制备的GFP-HUVECs悬液。在37 °C、5%二氧化碳、湿度充足的环境中孵育，每三至四天更换一次培养基。使用5倍物镜通过明场和荧光显微镜监测培养物的发育情况。通过仅显示GFP-HUVECs的明场和荧光图像，可以观察到不同培养物之间的差异。在无任何生长因子的情况下，培养物的发育程度较低。然而，在存在 FGF-2 的情况下观察到更快的发育。相比之下，明场图像显示在存在 BMP-2 的情况下细胞培养密度最高。然而，血管样网络在含有两种生长因子的条件下均能形成，且在 FGF-2 存在时形成的网络最为广泛且相互连接。 建立基质细胞与内皮细胞共培养体系后，使用适合定量的荧光显微镜设置，采集GFP-HUVECs的GFP信号。对同一天获取的所有图像进行预处理，以进一步增强对比度。若使用Fiji或ImageJ，同时打开同一时间点的所有增强GFP通道图像，并打开亮度和对比度菜单。选择一张代表中间状态的图像，并通过点击“自动”来自动调整对比度。点击“设置”，并勾选“应用到所有已打开的图像”。目视评估自动选定的范围是否适用于当前时间点的所有图像。如有需要，手动重新调整范围，并将其重新传播到所有图像，然后将调整后的图像保存为 TIFF 文件。接着，对所有图像应用中值模糊滤波器。通过像素合并（binning）减小图像尺寸，并将其保存为灰度 RGB 彩色 TIFF 文件，存入用于定量分析的文件夹中。此步骤可手动完成，也可使用宏以批处理模式进行。利用 ImageJ 的血管生成分析工具中的批处理模式分析所有生成的图像。然后通过检查已识别结构与原始图像的叠加效果，验证定量分析结果。如果算法检测到原始图像中存在人工结构且可见细胞极少或无细胞，则调整预处理参数，重新分析原始图像，或排除有问题的区域。最后，通过将每个样本的数值乘以分析面积与1平方毫米的比值，将获得的数值归一化至1平方毫米的面积。对GFP-HUVECs网络的定量参数显示，在存在FGF-2时总网络长度最长，而在缺乏生长因子时最短。指示网络中分支点的连接点数量与总长度呈现相同趋势。相反，添加了两种生长因子的条件显著减少了孤立片段的数量，表明其互联性高于未添加任何生长因子的条件。首先，取hBM-MSCs与GFP-HUVECs的共培养物，每孔加入200 µL PBS洗涤一次。加入BCIP/NBT底物溶液，将培养物在37°C孵育，并定期观察显色情况。一旦非成骨条件下出现显色，立即用每孔200 µL的PBS洗涤。用4%多聚甲醛固定样品后，采集染色样品的彩色图像。为了定量细胞裂解液中的碱性磷酸酶（ALP）活性，向用PBS洗涤过的培养物中每孔加入200 µL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育。每隔10分钟通过剧烈吹打上下混合以促进消化，并使用标准细胞培养显微镜监测培养物形态。随后将样品转移至2 mL离心管中，加入200 µL间充质干细胞基础培养基以抑制胰蛋白酶活性。离心后弃去上清液，将沉淀物在-80 °C冷冻保存，或直接进行下一步操作。将细胞沉淀在500 µL裂解缓冲液中冰上解冻，并在冰上孵育30分钟。接着，在4 °C条件下以16,100 ×g离心10分钟，离心后将样品保持在冰上。避免扰动沉淀的碎片，将上清液各50 µL分别加入透明组织培养96孔板的每个孔中，每组设两个复孔。向96孔组织培养板的各孔中加入50 µL已配制好的碱性磷酸酶试剂。轻轻振荡混匀，置于37 °C避光孵育10分钟。使用多通道移液器向各孔加入100 µL 1摩尔氢氧化钠溶液以终止反应。使用酶标仪在410 nm处读取吸光度。进行DNA定量时，将冻存样品解冻，离心后置于冰上。避免扰动沉淀的碎片，取50 µL细胞裂解上清液，重复加入黑色96孔板的孔中。将DNA标准品做双份加入。接着，使用多通道移液器加入50 µL DNA染色剂，然后根据制造商说明书进行孵育并读取荧光强度。利用标准曲线数值，确定并应用将测得的荧光强度值转换为DNA浓度的换算关系。最后，通过将碱性磷酸酶的数值除以各样本相应的DNA浓度，对其进行归一化处理。对碱性磷酸酶活性的定量分析用于表征培养物的成骨潜能，结果显示，经归一化的碱性磷酸酶活性在不同条件下差异显著，随着BMP-2浓度的升高，活性呈上升趋势，并在每毫升100 ng时达到平台期。含有每毫升50 ng FGF-2的条件显示出最低的活性水平。与 FGF-2 相比，在存在 BMP-2 的情况下观察到更广泛且更强烈的紫色染色。

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生物工程

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