Name: 副结核分枝杆菌增强实验性自身免疫性脑脊髓炎期间自身抗原免疫原的辅助活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 了解利用副结核分枝杆菌作为佐剂诱导C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的方法。该方案使用MOG 35-55肽段和不完全弗氏佐剂，通过肠-免疫-脑轴增强免疫反应，为研究多发性硬化等神经系统疾病的发病机制提供新模型。

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本工作获得了日本促进科学学会基金（基金编号：JP 23K14675）的资助。

所有小鼠实验均经顺天堂大学医学院机构动物护理和使用委员会批准（批准号 290238），并依照美国国立卫生研究院动物实验指南进行。
1. 实验的总体说明
<ol>
	<li>将小鼠单独饲养在动物房的笼具中，置于温度为 23 °C ± 2 °C、相对湿度为 50% ± 10%、12 小时光照/12 小时黑暗循环的受控无菌环境中，并提供 随意摄取 食物和水的获取</li>
	<li>分别向小鼠注射不含抗原的磷酸盐缓冲液（PBS）和完全弗氏佐剂（CFA），作为阴性对照和阳性对照。</li>
</ol>
2. 分枝杆菌抗原的制备
<ol>
	<li>在T25细胞培养瓶中，将M. paratuberculosis K-10菌株接种于添加了10% OADC（油酸、白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶）、0.005%吐温80和2 mg/L分枝杆菌素J的Middlebrook 7H9液体培养基中，于37 °C培养2周。定期通过肉眼观察评估菌落生长情况。 
	注意：&#160;操作M. paratuberculosis时必须在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。</li>
	<li>将富集培养物置于500 mL锥形瓶中，加入终体积为200 mL的菌悬液（浓度为1.7 × 105 菌落形成单位（CFU）/mL，培养基同步骤2.1），在摇床培养箱中培养1周。 
	注意：由于污染微生物可能影响实验结果，需将细菌接种至Middlebrook 7H10固体培养基，以观察菌落形态，并通过M. paratuberculosis常规聚合酶链式反应（PCR）检测试剂盒验证纯度。</li>
	<li>将细菌悬液在70 °C下灭活&#160;5–10分钟，随后在3,000 × g条件下离心10分钟。将获得的沉淀用PBS洗涤两次，称重后通过超声波破碎，并于-20 °C保存。</li>
	<li>将沉淀转移至无菌容器中，使用干冰或液氮迅速冷冻，立即转移至冷冻干燥室。</li>
	<li>根据仪器说明书对M. paratuberculosis进行冷冻干燥（真空条件下-50 °C持续4小时）。</li>
	<li>冻干结束后，从冻干机中取出不锈钢容器并转移至生物洁净工作台。使用不锈钢刮勺将附着在容器内壁上的干燥MAP块状物刮下，并尽可能研磨成细粉。</li>
	<li>使用电子天平称量研磨后的细胞，手动将其以10 mg/mL的浓度分装至无菌10 mL小瓶中。 
	注意：细胞密度以每升样品的干重克数表示。培养3周后，1 mg（湿重）细菌沉淀约含有2.5 × 108 CFU。</li>
</ol>
3. MOG&#160;35-55 乳剂的制备
<ol>
	<li>取一管冻干的M. paratuberculosis（10 mg）内容物，用研钵和研杵研磨成细粉，加入10 mL不完全弗氏佐剂，配制成10 mg/mL的储备液。储存于-4 °C。</li>
	<li>免疫前，将储备液稀释至终浓度为4 mg/mL。</li>
	<li>将肽段MOG35-55溶于ddH2O中，配制成终浓度为2 mg/mL的溶液，并储存于-20 °C。</li>
	<li>使用匀浆器，在5 mL离心管中将步骤3.2中的MOG35-55溶液（2 mg/mL）与等体积的佐剂（4 mg/mL）混合，直至形成浓稠的乳剂。每匀浆10秒后，将溶液置于冰上冷却20秒，并短暂离心以收集管壁上的液体。</li>
	<li>将乳剂转移至1 mL注射器中，排尽所有空气，安装27 G针头。乳剂现可用于注射。 
	注意：由于在制备过程中MOG35-55的黏稠乳剂会有一定损失，建议制备所需量的1.5倍为宜。</li>
</ol>
4. 动物免疫
<ol>
	<li>使用异氟烷吸入麻醉动物，以尽量减少动物的应激反应。</li>
	<li>将乳剂（200 µL，含 MOG35-55 200 µg/只）&#160;皮下注射至动物下背部。</li>
	<li>在免疫后第0天和第2天，分别腹腔注射百日咳毒素（100 µL，含200 ng/只）。 
	&#8203;注意：百日咳毒素对免疫系统具有多种抑制作用；避免摄入以及接触眼睛和皮肤。</li>
</ol>
5. 临床评估
<ol>
	<li>每天监测小鼠的体重和临床症状。使用以下评分系统：0 = 无临床症状；1 = 尾巴松软；2 = 翻正反射受损和后肢无力；3 = 后肢完全瘫痪；4 = 后肢完全瘫痪并伴有前肢部分瘫痪；5 = 濒死状态。 
	注意：一旦首次观察到临床症状，应为动物提供更多的饮水和食物。将啮齿类动物饲料软化并润湿后，从饲料盒中取出并放置于笼底。对于脱水动物，给予皮下补液，或通过口服灌胃给予啮齿类动物饲料糊。若小鼠需要此类支持超过3天，则实施安乐死。</li>
	<li>为避免或尽量减少动物疼痛与痛苦，采用以下 humane endpoints（人道终点）：体重减轻超过20%、临床评分 ≥4.0、评分为3时丧失翻正反射，以及动物无法自主接触饲料或饮水持续24小时。 
	注意：在EAE诱导后第30天，通过腹腔注射戊巴比妥（≥150 mg/kg）对小鼠实施安乐死。</li>
</ol>

Immunogenicity Enhancement by Mycobacterium paratuberculosis in Autoimmune Encephalomyelitis

<ol><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).</li>
<li>Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+a+model+for+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS).</a> British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).</li>
<li>Lu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pertussis+toxin+induces+angiogenesis+in+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).</li>
<li>Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of adjuvants.</a> Frontiers in Immunology. 4, 114(2013).</li>
<li>Kubota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+activity+of+Mycobacteria-derived+mycolic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids.</a> Heliyon. 6 (5), e04064(2020).</li>
<li>Nicolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+in+the+adjuvant+modulates+the+balance+of+Th+immune+response+to+self-antigen+of+the+CNS+without+influencing+a+%26%2334%3Bcore%26%2334%3B+repertoire+of+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a &#34;core&#34; repertoire of specific T cells.</a> International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).</li>
<li>O'Connor, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+immunotherapy+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%3A+immature+myeloid+cells+expressing+CXCL10+and+CXCL16+attract+CXCR3%2BCXCR6%2B+and+myelin-specific+T+cells+to+the+draining+lymph+nodes+rather+than+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system.</a> Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).</li>
<li>Libbey, J. E., Fujinami, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+as+a+testing+paradigm+for+adjuvants+and+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines.</a> Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).</li>
<li>Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conflicting+role+of+Mycobacterium+species+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis.</a> Frontiers in Neurology. 8, 216(2017).</li>
<li>Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+and+antigenic+properties+of+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+on+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).</li>
<li>Biet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopentapeptide+induces+a+strong+host+humoral+response+and+distinguishes+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+from+M.+avium+subsp.+avium%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium.</a> Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).</li>
<li>Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+humoral+immunity+to+mycobacterial+antigens+in+Japanese+patients+affected+by+inflammatory+demyelinating+diseases+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3179(2017).</li>
<li>Cossu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mucosal+immune+response+induced+by+oral+administration+of+heat-killed+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+exacerbates+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE.</a> Journal of Neuroimmunology. 352, 577477(2021).</li>
<li>Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+Calmette-Guerin+Tokyo-172+vaccine+provides+age-related+neuroprotection+in+actively+induced+and+spontaneous+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models.</a> Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

我们展示了一种可靠的替代方案，通过使用MOG肽主动诱导C57BL/6J小鼠产生严重的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）35-55 乳化于含佐剂的溶液中 M. paratuberculosis10采用该方法诱导EAE所导致的疾病严重程度高于使用CFA的常规方案。这种差异可能是由于分枝杆菌细胞壁中不同的脂质成分所致。11。事实上，与其他分枝杆菌不同的是， M. paratuberculosis 在细胞壁表面产生脂五肽抗原，而非糖肽脂质11该脂五肽不与其他近缘物种发生交叉反应，并已被证实是自身免疫性疾病患者体内强烈特异性体液免疫反应的靶标12分枝杆菌具有病原体相关分子模式，这些分子模式在免疫反应中发挥不同作用9例如，我们最近的研究表明，通过口服免疫接种 M. paratuberculosis 加重MOG-EAE的严重程度<sup c...

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究人类脱髓鞘疾病常用的模型1存在多种EAE模型：通过不同髓鞘肽与强效佐剂联合使用进行主动免疫，或通过过继免疫 体外 髓鞘特异性CD4转移+ 淋巴细胞，以及自发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的转基因模型2每种模型都具有特定的特征，可用于研究EAE的不同方面，如疾病 onset（起病）、效应阶段或慢性阶段。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）模型是研究慢性神经炎症和脱髓鞘免疫介导机制的良好模型，其特征为单核细胞炎症浸润、周围白质脱髓鞘，以及在疾病达峰后恢复能力降低。1.
通过用MOG35-55肽段在完全弗氏佐剂（CFA）中免疫易感小鼠，随后腹腔注射百日咳毒素，可诱导MOG-EAE模型。这会增加血脑屏障的通透性，使在外周被激活的髓鞘特异性T细胞进入中枢神经系统（CNS），并在该处被再次激活3。CFA在EAE诱导中起关键作用，其机制是增强抗原呈递细胞对抗原的摄取，并促进与体液免疫和细胞介导免疫相关的细胞因子表达4。这一机制主要归因于油中乳化的灭活Mycobacterium tuberculosis，其组分可对免疫系统产生强烈刺激5。事实上，EAE的诱导效果与抗原攻击期间存在的分枝杆菌含量直接相关6。
将其他灭活的分枝杆菌（如Mycobacterium butyricum）添加至不完全弗氏佐剂7 中，以及不同佐剂组合的使用8，均可调节实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的临床病程，从而影响实验结果的可重复性。Mycobacterium avium 亚种 paratuberculosis（MAP）是反刍动物约翰氏病的致病因子，已被发现与人类中枢神经系统（CNS）的炎症性疾病相关9，因其抗原成分可在多发性硬化症和视神经脊髓炎谱系障碍患者中引发强烈的体液免疫和细胞介导免疫反应9。因此，在本实验方案中，我们提出一种替代性且可重复的方法，即用M. paratuberculosis替代CFA中的M. tuberculosis，以诱导MOG-EAE模型。

<table><tbody><tr><td>抗小鼠 CD115 抗体</td><td>Biolegend, USA</td><td>135505</td><td>用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b 抗体</td><td>Biolegend, USA</td><td>101215</td><td>用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c 抗体</td><td>Biolegend, USA</td><td>117313</td><td>用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/32&amp;nbsp; 抗体</td><td>Biolegend, USA</td><td>101302</td><td>用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD4&amp;nbsp; 抗体</td><td>Biolegend, USA</td><td>116004</td><td>用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD8a&amp;nbsp; 抗体</td><td>Biolegend, USA</td><td>100753</td><td>用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>抗小鼠 I-A/I-E 抗体</td><td>Biolegend, USA</td><td>107635</td><td>用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6C&amp;nbsp; 抗体</td><td>Biolegend, USA</td><td>128023</td><td>用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>BBL Middlebrook OADC 增菌液</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>BD 211886</td><td>用于分枝杆菌的分离与培养</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Charles River Laboratory, 日本</td><td></td><td>3 周龄，雄性和雌性</td></tr><tr><td>FBS 10279-106</td><td>Gibco Life Techologies, USA</td><td>42F9155K</td><td>用于细胞培养，使用前于 37 &amp;deg;C 预热</td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Eyela, 东京, 日本</td><td>FDU-1200</td><td>用于细菌冻干</td></tr><tr><td>不完全弗氏佐剂（incomplete Freund&amp;rsquo;s adjuvant）</td><td>Difco Laboratories, MD, USA</td><td>263810</td><td>用于佐剂配制</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 肉汤培养基</td><td>Difco Laboratories, MD, USA</td><td>90003-876</td><td>促进分枝杆菌生长</td></tr><tr><td>副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）K-10</td><td>ATCC, USA</td><td>BAA-968</td><td>来源于牛的细菌</td></tr><tr><td>结核分枝杆菌 H37 Ra，冻干粉</td><td>BD Biosciences, USA</td><td>743-26880-EA</td><td>用于佐剂配制</td></tr><tr><td>Mycobactin J</td><td>Allied Laboratory, MO, USA</td><td></td><td>生长促进剂</td></tr><tr><td>髓鞘少突胶质细胞糖脂蛋白（MOG）35-55</td><td>AnaSpec, USA</td><td>AS-60130-10</td><td>致脑炎肽段</td></tr><tr><td>卵清蛋白（257-264）</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S7951-1MG</td><td>增殖实验中的阴性对照抗原&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>百日咳毒素溶液</td><td>Fujifilm Wako, 大阪, 日本</td><td>168-22471</td><td>来源于革兰氏阴性菌百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis），可增加血脑屏障通透性</td></tr><tr><td>Polytron 匀浆器 PT 3100</td><td>Kinematica</td><td></td><td>用于抗原与佐剂的混合</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（含 L-谷氨酰胺）</td><td>Gibco Life Techologies, USA</td><td>11875093</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>胸苷 [Methyl-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]，溶于 2% 乙醇，1 mCi</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td><td>NET027W001MC</td><td>用于增殖实验，使用浓度为每孔 1 &amp;mu;Ci</td></tr><tr><td>Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒</td><td>Biolegend, USA</td><td>423105</td><td>&amp;nbsp;用于流式细胞术检测细胞活力</td></tr></tbody></table>

mycobacterium paratuberculosis 在实验性自身免疫性脑脊髓炎中增强自身抗原免疫原性的佐剂活性

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导，需通过将MOG多肽与含灭活的完全弗氏佐剂（CFA）乳化后进行免疫。 结核分枝杆菌分枝杆菌的抗原成分可激活树突状细胞，进而刺激T细胞产生促进Th1反应的细胞因子 通过 Toll样受体。因此，抗原攻击期间存在的分枝杆菌的数量和种类与实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发展直接相关。本文提供了一种替代性方法，通过使用含有热灭活分枝杆菌的改良不完全弗氏佐剂，在C57BL/6小鼠中诱导EAE。 鸟分枝杆菌 亚种 副结核分枝杆菌 菌株 K-10
M. paratuberculosis，一种属于 鸟分枝杆菌 复合物是反刍动物约翰氏病的致病因子，并已被确认为多种人类T细胞介导疾病（包括多发性硬化症）的风险因素。总体而言，用该复合物免疫的小鼠 Mycobacterium paratuberculosis 比使用含该菌株的完全弗氏佐剂（CFA）免疫的小鼠发病更早且疾病更严重 M. tuberculosis H37Ra 在相同剂量（4 mg/mL）下的抗原决定簇 鸟分枝杆菌 亚种 副结核分枝杆菌 （MAP）&#160;菌株 K-10 能够在效应阶段诱导强烈的 Th1 型细胞免疫反应，其特征是 T 淋巴细胞（CD4）数量显著增加+ CD27+），树突状细胞（CD11c+ I-A/I-E+）和单核细胞（CD11b+ CD115+) 与使用CFA免疫的小鼠相比，在脾脏中达到最高水平。此外，针对MOG肽的T细胞增殖反应似乎在 M. paratuberculosis-免疫小鼠。使用脑炎原（例如，MOG35-55) 乳化于含佐剂的溶液中 M. paratuberculosis 配方中的成分可能是激活树突状细胞以启动髓鞘表位特异性CD4的一种替代且经过验证的方法+ EAE 诱导阶段的 T 细胞。

将C57BL/6小鼠分为若干组（每组总数 n = 15），分别使用含有M. paratuberculosis的乳剂或采用常规CFA方法免疫MOG35-55。所有小鼠组均表现出急性单相性疾病，其特征为在免疫后14–17天出现一次致病性高峰，随后在接下来的10天内症状部分缓解（图1A）。无论性别如何，使用含M. paratuberculosis佐剂免疫的小鼠在免疫后8–9天即出现更早的发病时间，并且在急性期表现出比CFA免疫小鼠更高的疾病严重程度（图1B）。各组之间在体重上无显著差异（图1C）。按照先前发表的方法11，对EAE小鼠脾细胞进行流式细胞分析，并通过3H-胸苷掺入法评估T淋巴细胞的增殖活性。所有EAE小鼠的脾细胞，无论所用佐剂为何，均对MOG35-55<...

本文介绍一种替代方案，通过使用免疫原性表位髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55 悬浮于含灭活的副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）的不完全弗氏佐剂中，主动诱导C57BL/6小鼠产生实验性自身免疫性脑脊髓炎。

Mycobacterium paratuberculosis 在实验性自身免疫性脑脊髓炎中增强自身抗原免疫原性的佐剂活性

由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）需通过将MOG多肽乳化于...中进行免疫接种

我们利用本团队专家开发的新技术，研究了多种神经系统疾病的发病机制，以改善患有交互性运动障碍疾病的患者的治疗。我们的部分研究聚焦于病原体在新型炎症性疾病（如多发性硬化症或视神经脊髓炎谱系疾病）病因学中的作用，这些疾病以遗传因素与环境因素之间的复杂相互作用为特征。尽管已有多种病原体被发现与这些疾病相关，但其具体作用尚不明确。我们发现，禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis）的抗原成分可在多发性脊柱侧弯患者中引发强烈的体液和细胞介导的免疫反应。此外，我们在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中证实，分枝杆菌可通过作用于肠-免疫-脑轴而产生脑炎诱导潜能。我们鉴定出副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）是一种有效的佐剂候选物，可诱导活性EAE的发生，其导致的疾病严重程度高于灭活结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）所诱导的疾病。这种差异可能是因为副结核分枝杆菌在细胞壁表面产生的是脂五肽抗原，而非糖肽脂类。我们的未来研究目标是探究外周神经系统与中枢神经系统免疫反应之间的相互作用，并阐明感染介导的神经炎症机制。为此，我们正在建立独特的神经炎症遗传学模型。首先，在含有增菌培养基的T25培养瓶中，于37摄氏度培养副结核分枝杆菌K10菌株两周。定期通过肉眼观察评估菌落生长情况。随后，在500毫升锥形瓶中加入200毫升增菌培养物，于摇床培养箱中振荡培养一周。将细菌悬液置于 70 摄氏度下 5 到 10 分钟以灭活，然后在 3,000G 条件下离心 10 分钟。用 20 毫升 PBS 将沉淀洗涤两次，并离心悬液。将沉淀转移至无菌容器中，用液氮冷冻。立即将冷冻的沉淀物转移至冻干机腔室。冻干完成后，将其转移至生物安全操作台。使用不锈钢刮勺，将粘附在容器内壁上的干燥MAP块状物刮下，并研磨成细粉。称取粉碎后的细胞，并将其手动放入无菌的10毫升小瓶中。首先，使用研钵和研杵将10毫克冻干的副结核分枝杆菌研磨成细粉。加入5毫升不完全弗氏佐剂，配制成10毫克/毫升的储备液。将储备液在负4摄氏度保存。免疫前，稀释储备液。然后将MOG 35-55肽稀释至2毫克/毫升，并在负20摄氏度保存。将MOG 35-55与佐剂以等体积混合于5毫升试管中，使用匀浆器搅拌，直至形成浓稠的乳剂。每混合10秒后，将溶液置于冰上冷却20秒，并旋转试管以回收全部溶液。将乳剂转移至1毫升注射器中，确保其中无气泡，然后安装27号针头。将200微升乳剂皮下注射至麻醉小鼠的背部下方。然后在免疫当天（第0天）和免疫后第2天，腹腔注射百日咳毒素。所有小鼠均表现出急性单相性疾病，其特征是在14至17天时出现一次残疾高峰，随后在接下来的10天内症状部分恢复。用副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）免疫的小鼠在免疫后发病更早，急性期病情更重。两组小鼠表现出相似的体重。对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠脾细胞进行滴定胸腺嘧啶掺入增殖实验，结果显示细胞对MOG 35-55肽段有强烈的增殖反应，但对卵清蛋白无反应。流式细胞分析显示，与CFA免疫小鼠相比，M.paratuberculosis免疫的EAE小鼠脾脏中T淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞数量增加。苏木精和伊红组织学分析显示，脑和脊髓中存在典型的血管周围及脑膜单核细胞炎症浸润。

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科研

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副结核分枝杆菌增强实验性自身免疫性脑脊髓炎期间自身抗原免疫原的辅助活性

本视频展示了多发性硬化动物模型——DA大鼠慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导方法及临床评分。该疾病通过用包含全鼠脊髓组织与完全弗氏佐剂的乳剂免疫大鼠而诱导，其临床表现与人类疾病相似。...

慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与临床评分

本视频展示了一种高效的均质化技术，用于制备抗原-佐剂乳剂，以在小鼠模型中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。该乳剂的水相中含有自身抗原——髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），周围由包含灭活病原菌的连续油相包裹。该乳剂可实现抗原的持续释放，从而引发持久的免疫反应。...

制备抗原-佐剂乳剂以诱导自身免疫性脑脊髓炎

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

本视频演示了通过注射髓鞘来源的多肽并联合佐剂以激活自身反应性T细胞来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的方法。这些T细胞会迁移至脑部。同时给予百日咳毒素以增加血脑屏障的通透性，使这些T细胞及其他免疫细胞得以进入脑组织。这些免疫细胞引发脱髓鞘，导致神经传导受损，从而诱发EAE。...

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的一种成熟动物模型。通过用髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）免疫C57BL/6小鼠，可诱导中枢神经系统中自身反应性免疫细胞引发的上行性弛缓性瘫痪。本文将讨论疾病诱导与监测的相关方案。...

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）诱导的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

我们介绍一种仅使用常规实验室设备的简单方案，用于大量制备和纯化含有小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的融合蛋白。该蛋白可用于诱导由T细胞和B细胞共同介导的实验性自身免疫性脑脊髓炎。...

用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简单高效制备与纯化

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化症的动物模型），需用含有自身抗原和完全弗氏佐剂的油包水乳剂对小鼠进行免疫。尽管目前已存在多种乳剂制备方案，本文介绍了一种快速、简便且标准化的乳剂均质化制备方法。...

一种快速、简单且标准化的匀浆方法用于制备抗原/佐剂乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

了解利用副结核分枝杆菌作为佐剂诱导C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的方法。该方案使用MOG 35-55肽段和不完全弗氏佐剂，通过肠-免疫-脑轴增强免疫反应，为研究多发性硬化等神经系统疾病的发病机制提供新模型。

Mycobacterium paratuberculosis 在实验性自身免疫性脑脊髓炎中增强自身抗原免疫原性的佐剂活性

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