Mycobacterium paratuberculosis 在实验性自身免疫性脑脊髓炎中增强自身抗原免疫原性的佐剂活性

我们利用本团队专家开发的新技术，研究了多种神经系统疾病的发病机制，以改善患有交互性运动障碍疾病的患者的治疗。我们的部分研究聚焦于病原体在新型炎症性疾病（如多发性硬化症或视神经脊髓炎谱系疾病）病因学中的作用，这些疾病以遗传因素与环境因素之间的复杂相互作用为特征。尽管已有多种病原体被发现与这些疾病相关，但其具体作用尚不明确。

我们发现，禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis）的抗原成分可在多发性脊柱侧弯患者中引发强烈的体液和细胞介导的免疫反应。此外，我们在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中证实，分枝杆菌可通过作用于肠-免疫-脑轴而产生脑炎诱导潜能。我们鉴定出副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）是一种有效的佐剂候选物，可诱导活性EAE的发生，其导致的疾病严重程度高于灭活结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）所诱导的疾病。

这种差异可能是因为副结核分枝杆菌在细胞壁表面产生的是脂五肽抗原，而非糖肽脂类。我们的未来研究目标是探究外周神经系统与中枢神经系统免疫反应之间的相互作用，并阐明感染介导的神经炎症机制。为此，我们正在建立独特的神经炎症遗传学模型。

首先，在含有增菌培养基的T25培养瓶中，于37摄氏度培养副结核分枝杆菌K10菌株两周。定期通过肉眼观察评估菌落生长情况。随后，在500毫升锥形瓶中加入200毫升增菌培养物，于摇床培养箱中振荡培养一周。

将细菌悬液置于 70 摄氏度下 5 到 10 分钟以灭活，然后在 3,000G 条件下离心 10 分钟。用 20 毫升 PBS 将沉淀洗涤两次，并离心悬液。将沉淀转移至无菌容器中，用液氮冷冻。

立即将冷冻的沉淀物转移至冻干机腔室。冻干完成后，将其转移至生物安全操作台。使用不锈钢刮勺，将粘附在容器内壁上的干燥MAP块状物刮下，并研磨成细粉。

称取粉碎后的细胞，并将其手动放入无菌的10毫升小瓶中。首先，使用研钵和研杵将10毫克冻干的副结核分枝杆菌研磨成细粉。加入5毫升不完全弗氏佐剂，配制成10毫克/毫升的储备液。

将储备液在负4摄氏度保存。免疫前，稀释储备液。然后将MOG 35-55肽稀释至2毫克/毫升，并在负20摄氏度保存。

将MOG 35-55与佐剂以等体积混合于5毫升试管中，使用匀浆器搅拌，直至形成浓稠的乳剂。每混合10秒后，将溶液置于冰上冷却20秒，并旋转试管以回收全部溶液。将乳剂转移至1毫升注射器中，确保其中无气泡，然后安装27号针头。

将200微升乳剂皮下注射至麻醉小鼠的背部下方。然后在免疫当天（第0天）和免疫后第2天，腹腔注射百日咳毒素。所有小鼠均表现出急性单相性疾病，其特征是在14至17天时出现一次残疾高峰，随后在接下来的10天内症状部分恢复。

用副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）免疫的小鼠在免疫后发病更早，急性期病情更重。两组小鼠表现出相似的体重。对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠脾细胞进行滴定胸腺嘧啶掺入增殖实验，结果显示细胞对MOG 35-55肽段有强烈的增殖反应，但对卵清蛋白无反应。

流式细胞分析显示，与CFA免疫小鼠相比，M.paratuberculosis免疫的EAE小鼠脾脏中T淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞数量增加。苏木精和伊红组织学分析显示，脑和脊髓中存在典型的血管周围及脑膜单核细胞炎症浸润。